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Biotech/immunologie

Biotechnologie Zusammenfassung Fragen

CK
by Clara K.

Was verbirgt sich hinter dem Begriff Biotechnologie?

praktische Nutzung biologischer Phänomene

Bitte ordnen Sie zu:

  • rote Biotechnologie

  • weiße Biotechnologie

  • grüne Biotechnologie


rote Biotechnologie = Pharmazie/Medizin


weiße Biotechnologie = Industrie


grüne Biotechnologie = Landwirtschaft


Biotechnologie Geschichte

  • Worauf geht die Biotechnologie zurück?

    • Prozesse + 2 Beispiele

  • Fleming entdeckt…

  • Watson & Crick veröffentlichen…

  • 60er/70er Entdeckung….

  • 70er Sequenzierung …

  • 80er Erfindung der ….

  • erstes rekombinantes Medikament …

  • 90er Welches Projekt + erste experimentelle…

  • 2012 erste Zulassung für …

  • 2018 Nobelpreis für ….

  • 2020 Nobelpreis für …


Worauf geht die Biotechnologie zurück? Prozesse + 2 Beispiele

-> empirische Prozesse (Bier und Wein Herstellung)

Fleming entdeckt… Penicillin

Watson & Crick veröffentlichen… DNA-Modell

60er/70er Entdeckung…. Restriktionsenyme

70er Sequenzierung … DNA

80er Erfindung der ….PCR

erstes rekombinantes Medikament Insulin

90er Welches Projekt + erste experimentelle… Human Genome Project und Gentherapie

2012 erste Zulassung für …Gentherapie Medikament

2018 Nobelpreis für ….gerichtete Evolution und Selektion

2020 Nobelpreis für …Genome Editing


Biotechnologische Produzenten

  • Prokaryonten (3)

  • Eukaryonten (2)

    • Teile von eukaryontischen Organismen (2)

  • Actinomyceten, Archaeen, Bakterien

  • Hefen, Schimmelpilze

    • Insektenzellen, Säugerzellen

Relevanz von Organismen für die Biotechnlogie und Nutzung für industrielle Zwecke.

Begründung

  • viele Organismen sind interessant

  • wenige können genutzt werden

    —> viele Organismen lassen sich nicht gut genetisch manipulieren und nur schlecht/gar nicht kultivieren


Domänen des Lebens

  • Archaeen

  • Bakterien

  • Prokaryonten

  • Archaeen und Bakterien bilden die Prokaryonten

  • Archaeen sind den Eukaryonten ähnlicher als den Prokaryonten


Methanbildung

  • Wo kommen Methanbildene Organismen vor ?

  • In welcher Domäne sind diese zu finden?

  • Unter welcher Bedingung läuft dieser Prozess ab?


  • Termitendarm, Rindermagen, auf Reisfeldern

  • Archaeen

  • strikt anaerob


Extremophile

  • Welche Organismen werden so bezeichnet

  • Welche Relevanz haben Extremophile für die Biotechnologie und warum?


  • alle Organismen die unter extremen Bedingungen leben

  • häufig biotechnologisch interessante Produzenten

    —> ABER wenig Einsatz, da sie sehr schwer zu kultivieren sind


Extremophile zuordnen

  • hyperthermophil

  • thermophil

  • mesophil

  • psychrophil

  • halophil

  • alkaliphil

  • acidophil

  • barophil

  • barotolerant

  • radiotolerant



Definition von Vektoren

Vehikel zur Übertragung von genetischer Information

Überbegriff: Einbringen von fremder genetischer DNA

Orden Sie unterschiedliche Vektoren nach der Größe ihrer Aufnahmefähigkeit (klein—>groß)

  • Plasmid

  • Cosmid

  • BAC

  • YAC

  • MAC


Welche Vektoren kann man unterscheiden, was sind ihre Eigenschaften und wo werden sie eingesetzt?

  • Klonierungvektoren

    • nicht für die Proteinexpression geeignet

    • werden meist in E.coli eingesetzt

  • Expressionsvektoren

    • sind für die Expression geeignet

  • Shuttle-Vektoren

    • funktionieren in mehreren Organismen

    • häufig zur Klonierung in E.coli und Expression in anderen Organismen


typische Vektorbestandteile und ihre Funktion (8)

  • ori

    • für die Replikation des Vektors

  • Antibiotika-Resistenzgen

    • für die Selektion auf vorhandensein des Vektors

  • MCS (=multiple cloning site)

    • zum einfachen Klonieren

  • Promotor

    • für den Start der Transkription

  • RBS (ribosomale binding site)

    • für den Start der Translation

  • Terminator

    • für den Stop der Transkription

  • Stop-Codon

    • für den Stop der Translation

  • CDS/GOI

    • codierense Sequenz/gene of interest


Tags

  • Definiton

  • Wozu dienen Sie?

    • Welche Anforderungen werden dafür an tags gestellt?

  • Welche Technik wird zur Detektion verwendet und welches Hilfsmittel wird benötigt?


  • kurze Peptidsequenzen oder auch längere Proteinsequenzen, die sich am N- oder C-Terminus des protein of interest befinden

    —> Fusionsproteine

  • dienen zur Detektion und Reinigung

    • Detektion:

      • hohe Affinität und hohe Spezifität

    • Reinigung

      • mittlere Affinität und hohe Spezifität

  • Western Blot mithilfe von Antikörpern


Beispiele für tags

  • Pepti-tags

  • Protein-tags


  • Flag-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, Strep-tag

  • GFP-tag, GST-tag, MBP-tag


Abbildung beschriften




Welche Reagenzien benötigen sie für eine PCR? (6)

  • Vorwärts-Primer

  • Polymerase-Puffer

  • dNTP

  • Template

  • DNA-Polymerase

  • Rückwärts-Primer


Schritte einer PCR nennen, kurze Erklärung und bei welcher Temperatur ?

  1. Denaturierung

    • Trennen des Doppelstrangs in 2 Einzelstränge

    • ca. 94°C

  2. Annealing

    • binden der Primer

    • ca. 54°C

  3. Extension

    • Verlängerung der Primer durch DNA-Polymerase

    • 72°C

  4. Wiederholung der Zyklen

    • meist 20-30 mal


Wie kann die Schmelztemperatur der Primer für die PCR abgeschätzt werden?

An welchem Ende erfolgt die Verlängerung der Primer ?

Wie werden Primer immer angegeben?

  • nach der 4+2-Regel

    • 4°C für G-C (3H-Brücken)

    • 2°C für A-T (2 H-Brücken)

  • immer am 3´-Ende

  • immer von 5`—>3`-Ende


Sie sollen für die Klonierung des Gens für GFP mittels PCR amplifizieren.

Hierbei soll über den Vorwärts-Primer die Erkennungssequenz für NdeI sowie ein His-tag eingefügt werden.

Über den Rückwärts-Primer soll ein Strep-tag, ein Stop-Codon sowie die Erkennungssequenz für EcoRI eingefügt werden.


Vorwärts-Primer

  • 5’ - XXXXXX— Erkennungssequenz NdeI — Gen für His-tag — primender Bereich “vorderer” Bereich des GFP Gens -3’

Rückwärts-Primer

  • 5’ - XXXXXX — Erkennungssequenz EcoRI — Stop-Codon — Gen für Strep-tag — primender Bereich “hinterer” Bereich des GFP Gens -3’


SARS-CoV-2 ist ein … Virus.

Was wird vom Rachen isoliert?

Was muss damit passieren und wie nennt man diesen Prozess?

Wie erfolgt der Nachweis und welche Techniken unterscheidet man?

Erklären sie die Methoden in einem Satz.

  • RNA-Virus

  • RNA wird isoliert und in DNA umgewandelt = reverse Transkription

  • Nachweis mittels PCR

    • nested PCR

      • erst normale PCR und anschließend erneute PCR mit weiter innen liegenden Primern

    • real time PCR

      • Fluoreszenz gibt einen Hinweis auf die Menge des Ausgangsmaterials

      • hoher Virustiter führt zu gut detektierbarem Signal nach weniger PCR Zyklen als ein niedriger Titer


SARS-CoV-2

Wie ließen sich mit real time PCR auch Virus-Varianten gezielt detektieren?

gezieltes testen auf mutierte Abschnitte

mit spezifischen Primern

Klonierung über homologe Rekombination

Worüber erfolgt das einfügen?

Wie muss der Vektor vorliegen?

Womit erfolgt die Reaktion?

Können mehrere Fragmente gleichzeitig eingefügt werden?

z.B. SLiCE (Seemless Ligation Cloning Extract)

  • Einfügen von Inserts über Homologieregionen, welche identisch in Vektor und Insert sind

  • Vektor muss linear/ offen vorliegen

  • Reaktion erfolgt mithilfe von E. coli-Extrakt

  • gleichzeitiges Klonieren von mehreren Fragmenten ist möglich

  • Homologieregion sollte ca. 36 nt lang sein


gezielte Mutagenese

Definieren Sie den Begriff.

Welche Vorgänge sind möglich?

Wie erfolgt das Einfügen und das Entfernen des Ausgangsvektors?


  • Methode für die definierte Veränderung in doppelsträngiger Plasmid-DNA

  • es sind möglich:

    • Substitution

      • Veränderung von Basen/Basenpaaren)

    • Insertion

      • Einfügen von Basen/Basenpaaren

    • Deletion

      • Entfernen von Basen/Basenpaaren

  • Einfügen erfolgt über entsprechende Primer in einer PCR-Reaktion

  • zur Befreiung verwendet man DpnI

    —> spaltet nur methylierte DNA

  • Ziel: Ursprungsvektor loswerden


Expressionskontrolle über induzierbare Promotoren

Beispiel lac Operon

Erklären Sie wie es zum reprimierten und zum induzierten Zustand kommt.

reprimierter Zustand

  • lac-Repressor bindet an die Lac Operator Site

  • Blockierung der RNA-Polymerase

    -> keine Transkription

induzierter Zustand

  • über Zugabe von Induktor (IPTG (zur Kontrolle der Proteininduktion) oder Laktose)

    • IPTG = Zucker-Derivat, das besonders fest an den lac-Repressor bindet

  • bindet an den lac-Repressor

    -> Konformationsänderung

  • lac-Repressor kann nicht mehr binden und RNA-Polymerase ist nicht mehr blockiert

    —>Transkription findet statt


Hefeexpressionsvektoren (Promotor und Selektion)


Hefeexpressionsvektoren

  • induzierbare Promotoren

  • Resistenzselektion häufig über Magelmutanten


Vektoren für Säugerzelllinien

(Promotor und Selektion)

  • konstitutive Promotoren oder induzierbare Promotoren

  • Resistenzselektion meist über Antibiotikaresistenz


Baculovirus

(infizierter Organismus + Funktionsweise)


  • Baculoviren infizieren Insektenzellen

  • für die rekombinante Expression wird das Gen für Polyhedrin mit dem GOI ausgetauscht


Säugerzelllinien (3 nennen)

  • HeLa

  • HEK-293

  • CHO


Zellfreie Systeme

(Was sind sie und woraus bestehen sie?)


  • Verwendung von Zelllysat aus:

    • Bakterien: Expression mit E.coli-Extrakten

    • Säugerzellen: Expression mit Reticulozytenlysat

    • Pflanzenzellen: Expression mit Weizenkeimextrakten


Definition von

  • Transformation

  • Transduktion

  • Transfektion


Transformation

  • nicht virale Übertragung freier DNA in E.coli, Hefe,Pilze, Pflanzenzellen

  • bei Säugerzellen Entartung einer gesunden Zelle zur Tumorzelle

Transduktion

  • virale Übertragung von DNA

Transfektion

  • nicht virale Übertragung freier DNA in Säugerzellen


Sterilisation von … mit …

  • Glaspipetten

  • Medien für E. coli

  • Medien für Säugerzellen

  • Impföse

  • Einweg-Pipettenspitzen

  • fester Laborabfall, verunreinigt mit GVOs

  • Reagenzgläser

  • Glasgeräte


trockene Hitze:

  • Glaspipetten

  • Glasgeräte

  • Reagenzgläser


Autoklavieren:

  • Medien für E.Coli

  • Einweg-Pipettenspitzen

  • fester Laborabfall, verunreinigt mit GVOs

Filtrieren:

  • Medien für Säugerzellen

Abflammen:

  • Impföse



Phasen einer Batch-Kultur

In welcher Phase erfolgt die Induktion der Expression?

Batch-Kultur

  • lag-Phase->log-Phase->stationäre Phase->Absterbephase


  • Induktion der Expression in der log-Phase


Fed-Batch (halb-kontinuierliche Kultur)

Wie kann das Monitoring erfolgen?

  • dient zur Verlängerung der Phase der Produktionsbildung. Es wird frisches Medium dazugegeben -> Volumen nimmt zu

  • Monitoring offline (einfacher, aber zeitverzögert) oder online


Turbidostat und Chemostat vergleichen

Beides kontinuierliche Kultur


Maßstabsvergrößerung schwierig oder einfacher und warum?

In welchen Schritten erfolgt die Maßstabsvergrößerung und womit erfolgt das Animpfen?

Wie kann eine Durchmischung erfolgen, wofür wird welche Methode genutzt?

Welche Verfahren gibt es und welche wird bevorzugt?

  • scale-up schwierig aus physikalischen Gründen

  • Schritte der Maßstabsvergrößerung:

    • Erlenmeyerkolben->Pilotanlage->Produktionsfermentor

  • Animpfen aus Vorkultur/en

  • Airliftreaktor für empfindliche Zellen

  • Rührwerksreaktor für unemfindliche Zellen

  • Submers-Verfahren wird dem Oberflächen-Verfahren vorgezogen


Aus was ist Lignocellulose aufgebaut und wie können die einzelnen Bestandteile abgebaut werden?

Was sind Cellusomen?

  • Cellulose: beta-1,4-Glucose mit Cellulase abbaubar

  • Hemicellulose: verzweigter Zucker-Polymer

  • Lignin: sehr heterogen, chemisch und enzymatisch schwer abbaubar, oxidative Spaltung durch Lactase und Peroxidase

  • Cellusom= multi-Enzym-Komplex mit verschiedenen Cellulase-Enzymen auf der Zelloberfläche



Produktionsorte mit den jeweiligen Vorteilen und Nachteilen nennen.

Produkt sezerniert ins Medium:

  • Vorteil: wenig bis keine Fremdproteine

  • Nachteil: Produkt ist stark verdünnt -> großes Volumen

Produkt in der Zelle:

  • Periplasma (oxidierende Verhältnisse)

    • Vorteil: geringer Anteil an Fremdproteinen

    • Nachteil: geringere Expressionsrate

  • Cytoplasma (reduzierende Verhältnisse)

    • Vorteil: relativ hohe Produktkonzentration

    • Nachteil: hoher Anteil an Fremdproteinen

  • Inclusion Body

    • Vorteil: Produkt relativ rein und in hoher Konzentration

    • Nachteil: Rückfaltung relativ schwierig bis unmöglich


Insulinproduktion

  • Biosynthese von Insulin in Stichpunkten

  • frühere Methode zur Insulinproduktion

  • heutige Insulinproduktion


  • Präproinsulin

    -> Abspaltung der hydrophoben Signalsequence

  • Proinsulin

    ->Ausbildung Disulfidbrücken

    ->Abspaltung C-Peptid

  • reifes Insulin

  • früher Produktion in zwei Stämmen (jeweils einer pro Kette), Produktion als Fusion an beta-Galactosidase

    ->Ausbildung falscher Disulfidbrücken (Problem)

  • heute Produktion: Expression in E.coli oder Hefe, Produktion als Proinsulin

    ->C-Peptid bewirkt korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken


Antibiotika

  • Was sind es für Metabolite

  • In welcher Phase werden diese gebildet und wie nnent man die Phase noch?

  • Wo wirken Antibiotika (3)

  • Zu welchen Antibiotikan gehört Penicillin und wie wirkt es

  • Wie erfolgt die Synthese von Penicillin


  • Sekundärmetabolite

  • Bildung in der stationären Phase = Idiophase

  • Proteinbiosynthese, Replikation, Zellmembran/Zellwand

  • Penicillin:

    • beta-Lactam ->Wirkungsort Zellmembran/Zellwand

    • blockieren die Transpeptidase und verhindern Quervernetzung des Mureingerüstes

  • Synthese

    • halbsynthetische Synthese

    • Penicillium chrysogenum mit Phenylessigsäure kultiviert

      -> Penicillin G

    • Acylase führt zur Abspaltung von Benzylgruppen

      -> 6-Aminopenicillansäure

    • weitere Modifikationen erfolgen chemisch


Nennen sie vier generelle Antibiotika-Resistenzmechanismen.

  • Efflux-Pumpen

  • verminderte Aufnahme

  • Inaktivierung Antibiotikum über Enzyme

  • Mutation der Zielstruktur


  • Antibiotika-Resistenzgene sind …?

  • Über welche Mechanismen kann eine Resistenz gegen beta-Lactam Antibiotika erfolgen?



  • mobile genetische Elemente

  • Antibiotika-Spaltung durch Enzym beta-Lactamase und Mutation der Zielstruktur (Transpeptidase)




Welche Lösungen gibt es gegen Antibiotika-Resistenzen ?

Welche Substanzen kann man für welche Lösung im Fall von beta-Lactam Antibiotika verwenden?

  • neue oder modifizierte Antibiotika

  • Reserve-Antibiotika

  • Substanzen, die Resistenzen überwinden

    • Clavulansäure

    • Olivansäure

      => Inhibieren beta-Lactamase (binden irreversibel)


single cell protein

  • aus welchen Organismen wird dies gewonnen

    • Welche Organismen zählen zu diesen?

  • Wozu werden diese kultiviert?


  • einzellige Organismen

    • Algen,Bakterien, Hefe, Pilze

  • Lieferant von Protein


Bierherstellung

  • Welche Zutaten werden benötigt?

  • Schritte der Bierherstellung in der Richtigen Reihenfolge und kurze Beschreibung was dort passiert


  • Gerste, Hopfen, Wasser und Hefe

  1. Malzen

    • Bildung von Stärke- und Protein-abbauenden Enzymen (Amylasen und Proteasen)

  2. Darren

    • Abtöten der Keime

  3. Maischen

    • Amylasen und Proteasen bauen Stärke und Proteine ab

  4. Läutern

    • Gewinnung der klaren Würze und Abtrennen des Trebers

  5. Zugabe von Hopfen

    • wirkt als Antiseptikum

  6. Würze Kochen

    • Inaktivierung der Enzyme

  7. Fermentierung/Gärung

    • Hefe setzt Zucker zu Alkohol um

  8. Reifen

    • Geschmacksverbesserung

  9. Filtration/Pasteurisierung

    • zur verbesserten Haltbarkeit


Unter welchen Sauerstoffbedingungen verläuft die Bierherstellung und ist dieser Prozess effektiv?

Bierherstellung ist ein anaerober Prozess.

Es ist ein ineffektiver Prozess (Erzeugung von 2 mol ATP pro mol Glucose

Im Gegensatz dazu:

aerob Prozess: Erzeugung von 38 mol ATP pro mol Glucose).

Weinherstellung

  • Aus welchem Ausgangsprodukt wird Alkohol gewonnen?

  • Schritte vor der alkoholischen Gärung einfacher/schwerer im vergleich zur Bierherstellung?

  • Unterschied von Weißwein zu Rotwein


  • Ausgangsprodukt reich an Zucker

    —> Schritte vor der Gärung einfacher

  • Weißwein

    • Filtration nach der Fermentation

    • Mostgärung

  • Rotwein

    • Filtration vor der Fermentation

    • Maischegärung


Milchsäurebakterien

  • Zu welcher Gruppe von Bakterien zählt man sie und wie werden sie genannt?

  • Welche Merkmale kann man ihnen zuordnen und wie stehen sie morphologisch zueinander

  • Was bauen sie ab und welches Produkt entsteht?

  • Nennen Sie Beispiele für Milchsäurebakterien


  • gram+ Bakterien, auch genannt Lactobacillales

  • fakultativ anaerob, können Sauerstoff tolerieren, keine Endosporenbildung, morphologisch sehr unterschiedlich

  • bauen Kolenhydrate ab und bilden bevorzugt Lactat

  • Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus


Milchprodukte

  • Bei der Kefirherstellung setzt man neben Milchsäurebakterien auch … ein ?

  • Edelschimmel im Käse sind Arten von … ?



  • Hefe Saccharomyces

  • Penicillium


Essigherstellung

  • Was ist das Edukt, das Zwischenprodukt und das Endprodukt?

  • Wie verläuft dieser Prozess ab?

    Ist dieser Prozess eine Gärung?

  • Beispiele für essigbildene Organismen


  • Ethanol -> Acetaldehyd -> Essigsäure

  • aerober Prozes und ist keine Gärung

  • Acetobacter und Gluconobacter


Reisweinherstellung

  • Beschreiben sie kurz die Schritte

  • Welchem Prozess ähnelt die herstellung von Reiswein?


  • Stärke vom Reis wird durch Aspergillus gespalten

    -> Zucker wird gebildet

  • Zucker wird durch Saccharomyces umgesetzt

    -> Ethanol

  • ähnelt dem Prozess der Bierherstellung

    (stärkehaltiges Asugangsprodukt)


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Clara K.

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