His-Tag for purification
Die Aminosäuresequenz des Polyhistidin-Tags ist eine Folge von mindestens sechs Histidinen, deren Gensequenz N-terminal nach dem Start-Methionin-Codon oder C-terminal vor das Stopcodon in das offene Leseraster eines Gens kloniert wird. Dadurch entsteht ein Fusionsprotein mit einem Polyhistidin-Tag. Gelegentlich wird eine Schnittstelle für eine Protease oder ein Intein zwischen Protein und Polyhistidin-Tag eingefügt, um eine Abspaltung des Tags nach einer Proteinreinigung zu ermöglichen.
Das Polyhistidin-Tag bindet mit mikromolarer Affinität an zweiwertige Nickel- oder Cobalt-Ionen und bildet einen Chelatkomplex. Werden die Ionen durch Bindung an einen Feststoff-gekoppelten Chelator immobilisiert, können die Proteine mit Polyhistidin-Tag in einer Affinitätschromatographie (genauer: in einer Metall-Chelat-Affinitätschromatographie) selektiv gebunden werden und durch Spülen der Säule mit 20 mM Imidazol von den ungebundenen Proteinen befreit werden.
Codon Usage
Codonverwendung (englisch Codon Usage), auch Codon Bias, beschreibt das Phänomen, dass Varianten des universellen genetischen Codes von verschiedenen Spezies unterschiedlich häufig verwendet werden. Bestimmte Codons des degenerierten Codes werden bevorzugt benutzt, was letztlich der tRNA-Konzentration innerhalb der Zelle entspricht. Die Codonverwendung spielt eine große Rolle bei der Regulation der Proteinbiosynthese. Selten verwendete Codons können die Translation bremsen, während häufig genutzte Codons die Translation beschleunigen können.
Tiere als Produktionswirte
Säugetierzellen als Produktionswirte
Pflanzenzellen als Produktionswirte
N-Glykosylierung
Die kovalente Verknüpfung von Kohlenhydraten an Proteine erfolgt im Endoplasmatischen Retikulum. Die N-Glykosylierung kann nur an einem Asparaginrest erfolgen. Es können aber nicht alle Asparagin-Reste ein N-Glykan akzeptieren. Ein N-Glykan ist ein Polysaccharid, das kovalent mit dem Stickstoff der Aminogruppe in der Seitenkette von Asparagin (Asn) verknüpft ist. Die minimale Erkennungs-Sequenz ist Asparagin, gefolgt von einer beliebigen Aminosäure mit Ausnahme von Prolin und endet mit Serin oder Threonin (Asn-X-Ser oder AsnX-Thr). Somit ist die Aminosäure-Sequenz Asn-X-Ser/Thr ein “Sequon” für eine N-Glykosylierung in einem Protein. Ein „Sequon“ ist eine Sequenz bestehend aus drei aufeinander folgenden Aminosäuren in einem Protein, die als potentielle Anheftungsstelle an ein Polysaccharid, das als N-Glykan bezeichnet wird, dient.
Bei eukaryoten Zellen ist das an ein Asparagin gebundene Oligosaccharid immer ausnahmslos N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und die Verknüpfung erfolgt -Konfiguration
Alle N-Glykane bestehen aus einer einheitlichen Kern- (Core-) Struktur mit der Sequenz ––!"–4Gl –# -Asn-XSer/Thr.
Sie werden in drei Typen klassifiziert:
High-Mannose: Es sind ausschließlich Mannose Reste mit der Core-Region verknüpft.
Komplex: Antennäre Strukturen werden von N-Acetylglucosaminyltransferasen (GlcNAcTs) an die Core Region angeheftet.
Hybrid: Am –6-Arm der Core Region sind ausschließlich Mannose-Reste angeheftet. Eine oder zwei antennäre Strukturen $% –3-Arm.
O-Glykosylierung
O-glykosylierte Proteine entstehen durch unterschiedliche ProteinGlykan-Verknüpfungen, in denen GalNAc, Fucose, GlcNAc, Mannose, Xylose oder Galactose an die Hydroxylgruppen in den Seitenketten von Serin oder Threonin oder Hydroxyllysin angefügt werden. Die Biosynthese der O-verknüpften Glykoproteine erfolgt im cis- bis transGolgi-Apparat
O-verknüpfte Glykane besitzen im Gegensatz zu den N-verknüpften Glykanen keine einheitliche Kern- (Core-) Struktur, sondern man unterscheidet 7 Core-Strukturen.
Mucine sind hoch O-glykosylierte Proteine, die strukturgebenden Bestandteile des Schleims auf den Schleimhäuten (z. B. von Magen, Darm, Augen und Nase). Diese Glykoproteine besitzen durch die Polysaccharide eine hohe Wasserbindungskapazität, wodurch das Protein vor proteolytischem Abbau geschützt wird.
Glycosylation rules
Insektenzellen als Produktionswirte
Hefezellen als Produktionswirte
Bakterienzellen als Produktionswirte
Mögliche Probleme bei der Produktion in E.Coli
verschiedene (wichtig) E.Coli Stämme
ori in E.coli
Duet-Vektoren für die Koproduktion von mehreren Proteinen
Selektionsmarker E.Coli
Operatoren & Promotor
positive Regulation
Einige wichtige Punkte bei der Wahl des passenden E. coli Stamms:
Troubleshooting E.Coli
Zellaufschluss (Bakterien)
Aussalzen
Strep-Tag
GST-Tags
Wie kann man feststellen, ob zwei Plasmider der gleichen INkompatibilitätsgruppe angehören?
Haben Plasmide die gleiche INkompatibilitätsgruppe (Inc), dann haben sie den gleichen Mechanismus zur Regulation ihrer Replikation und sind verwandt.
Hat eine Wirtszelle zwei Plasmide mit gleicher Inc, kann sie sich nicht entscheiden, welches Plasmid repilizert werden soll. SOmit verschwindet eins der Plasmide (bei Tranfer eines neuen Plasmid in eine Zelle, die bereits ein Plasmid mit gleicher Inc enthält, verschwindet das transferierte Plasmid). Plaside mit verscheidenen Inc-Gruppen können in einer Zelle koexistieren
Andere Inc-Gruppen kännen über eine leichter Veränderung, z.B. in der RNA I, erschaffen werden
Last changed2 years ago