Klausur

• ß-Gal Assay

• Wachstum von Bakterien, welche 2 verschiedene Zuckerarten als Kohlenstoffquelle zur Verfügung haben

  • z. B. Glucose und Lactose

• oft zeigte sich biphasisches Wachstum

  • erst wird nur ein Zucker, z. B. Glucose, und dann erst der zweite Zucker, z. B. Lactose, verwertet bzw. von den Bakterien verstoffwechselt

• —> Resultat: lac-Operon und seiner Regulation

  • Operon = DNA Abschnitt mit mehreren Genen, die gemeinsam reguliert werden

  • —> Operon = grundlegendes Konzept, bei allen Organismen zu finden

• Genabschnitt, der für Proteine codiert, die für die Aufnahme und den Abbau von Lactose verantwortlich sind

• Genabschnitt wird in 2 Teile unterteilt:

  • Strukturgene und

  • Regulatorische Elemente

• 3 Strukturgene

  • lacZ —> codiert für Enzym ß-Galactosidase -> spaltet Lactose in Glucose und Galactose

    • natürliches Substrat = Lactose

    • neben Lactose kann auch ONPG von ß-Gal gespalten werden

  • lacY —>Permease, ein Transmembransymporter, der Lactose über die Membran schleust, indem er einen Protonengradienten ausnutzt und die Protonen in die gleiche Richtung transportiert

    • —> Transporter

  • lacA —> codiert für ß-Galactosid-Transacetylase

    • Enzxm, das Acetylgruppen von Acetyl-CoA auf ß-Gal überträgt

      • scheint nicht für den Lactosestoffwechsel nötig zu sein

• Genabschnitt, der für Proteine codiert, die für die Aufnahme und den Abbau von Lactose verantwortlich sind

• Genabschnitt wird in 2 Teile unterteilt:

  • Strukturgene und

  • Regulatorische Elemente

• Regulatorische Elemente

  • wäre Energieverschwendung für die Zelle, andauernd lacA, lacY und lacZ zu produzieren

  • Transkription des lac-Operons wird eingestellt, wenn keine Lactose oder eine bessere Kohlenstoffquelle, wie z. B. Glucose, vorhanden ist

  • —> Glucose schaltet das lac-Operon ab!

• Regulator —> Promoter —> Operator /Repressor

• hat mehr Repressoren

• Aktivität ist geringer als bei K12, da 2 Gene für den Repressor codieren

• mutiertes lacI Gen —> veränderter Repressor

• Effekt ist da, Glukose inhibiert

• Startpunkt für die Transkription der lacZ Gene —> Promoter, LacP

• Damit RNA Polymerase an Promoter binden kann, ist RNAP-Untereinheit sigma 70 nötig

  • -> σ70 ist ein Housekeeping-Sigmafaktor

    • istimmer und in ausreichender Menge in der Zelle vorhanden ist

  • ständige Anwesenheit σ70 —> lac-Operon würde ohen weitere regulatorische Elemente ununterbrochen transkribiert werden

• —> Regulation über Repressor/Operator!

• Zelle bildet einen Repressor

  • —> LacL Protein

  • = monotetrameres Protein, bindet an eine Palindromstruktur in der DNA

    • Palindromstruktur liegt zwischen lac-Promoter und den Strukturgenen —> wird als Operator bezeichnet

  • Bindung des Repressors an den Operator —> erlaubt die Bindung der Polymerase an den Promoter, DNA wird dadurch so gebogen, dass die Polymerase die DNA nicht transkribieren kann

• Transkription des LacL-Gens steht unter der Kontrolle des eigenen Promoters —> LacP

• Lac-L Gen —> Gen für den Lac-Repressor —> mRNA —> Repressor

• Repressor (Tetramer) hat Symmetrieübereinstimmung mit Operator (Palindrom)

• synthetisches Substrat wie Lactose

• wird von ß-Gal gespalten

• in Anwesenheit von Lactose —> in der Zelle wird Allolaktose gebildet

• Allolaktose fungiert als Induktor

  • bindet an den Lac-Repressor —> Repressor verliert seine Affinität zu dem Operator

  • Repressor löst sich von dem Operator —> Polymerase kann die Strukturgene transkribieren

• —> Induktion von Allolaktose ist keine eigentliche Aktivierung, sondern eine De-Repression!

• Enzym Adenylat-Cyclase synthetisiert cAMP aus ATP

  • 2 Moleküle cAMP können an das homodimere CRP binden

    • Komplex au cAMP und CRP —> bindet an eine DMA-Konsensus-Sequenz, die CRP Bindestelle

    • —> auch Aktivator Region genannt

• ATP —> Adenylat Cyclase —> cAMP —> cAMP bindet an CRP —> cAMP/CRP Komplex —> bindet an Aktivator-Region —> beugt DNA —> Aktivierung verschiedener Promoter die am Kohlenstoffwechsel beteiligt sind

• Begriff irreführend, da

  • kein Katabolit der Glucose an dem Mechanismus beteiligt

  • KEINE Repression

    • der cAMP/CRP-Komplex aktiviert das lac-Operon

• wenn Glucose im Kulturmedium vorhanden —> gelangt Glucose über Rezeptoren in die Zellen —> Adenylat-Cyclase wird gehemmt —> es kommt zu verminderter cAMP Produktion —> verminderte Transkription des lac-Operons

• Glucose vorhanden —> kein cAMP, keine Transkription

  • Anwesenheit von Glucose —> schaltet das lac-Operon ab

• Glucose nicht vorhanden —> cAMP wird produziert, CAP-cAMP-Komplex aktiviert die Transkription

  
  

1. Repression

   1. das lac-Operon wird durch den lac-Repressor —> Repression/unterdrückt/deaktiviert

   2. Repressor bewirkt negative Genexpression

2. De-Repression

   1. De-Repression des lac-Operons durch Induktor Allolaktose

      1. durch Induktor Allolaktose wird duch Bindung der Repressor deaktiviert —> Konfirmationsänderung des Repressors —> Promoter & Operator sind angeschaltet, Strukturgene werden transkribiert —> RNAP kann ablesen, da Repressor nicht mehr binden kann —> lac Z -> ß-Gal, lacY -> Permease, LacA -> Acetyl-Transferase

3. Aktivierung

   1. Voraussetzung: GLUCOSEMANGEL

      1. ATP —> Adenylat Cyclase —> cAMP —> cAMP bindet an CRP —> cAMP/CRP Komplex —> bindet an Aktivator-Region —> beugt DNA —> Aktivierung verschiedener Promoter die am Kohlenstoffwechsel beteiligt sind

   2. Bei Anwesenheit Glucose —> lac-Operon wird abgeschaltet!

• E II a + Phosphatgruppe + Glucose

• Transport von außen nach innen

  • —> phosphoryelierung von Glucose

  • Glykolyse -> Glucose -> Glucose-6-P

• nicht phosphoryeliertes E II a —> hemmt Adenylat-Cyclase —> kein cAMP

• De-Repression, Lac-Repressor wird inaktiviert, Transkription findet statt

  • Operon wird angeschaltet

• Repression, Lac-Repressor bindet an Operator, Transkription findet nicht statt

  • Operon wird abgeschaltet

    
    

• Durch Bindung regulatorischer Proteine an die DNA wird die DNA gebogen

  • die Verformung führt zu verändertem Bindungsverhalten

  • die DNA kann dadurch besser oder schlechter abgelesen werden

• die RNA-Polymerase bindet zwischen der -10 und -30 Region

• die Polymerase besteht aus 5 verschiedenen Untereinheiten

  • 2 x alpha

  • 2 x ß

  • 1 x Sigma Untereinheit

    • Housekeeping-Sigmafaktor

• ß-Galactosidase-Assay

  • indirekte Messung der Promoteraktivität

• —> wird beeinflusst durch die Translationsgeschwindigkeit, die wiederrum von der Shine-Dalgarno-Sequenz beeinflusst wird

  • leicht veränderte Shine-Dalgarno-Sequenzen können zu veränderter Enzymaktivität führen

• Aktivität des Promoters = Maß dafür, wie oft die RNA-Polymerase an einem Promoter bindet und wie viele Transkripte sie erstellt

  • Transkripte —> bei lac-Operon —> Expression ß-Gal —> enzymatische Aktivität ist proportional zu der Aktivität des Promoters —> Enzymaktivität = readout für die lac-Promoteraktivität

• Promoteraktivität —> Transkription —> ß-Galactosidase mRNA —>Translation —> ß-Galactosidase Protein

• Lyse der Zellen

• ß-Gal-Assay mit ONPG als Substrat

  • Kultur und Induktiion eines Bakteriums mit intaktem lac-Operon

• Substrat für ß-Gal

• enzymatische Spaltung von ONPG —> setzt o-Nitrophenol frei —> gelbe Farbe —> bei 405 nm photometrisch gemessen

• Induktor —> anstelle Allolaktose

• Lösung sollte frisch angesetzt werden, da ONPG nach einiger Zeit autohydrolysiert und gelb wird.

• ist ein Strukturanalogon der Lactose

  • Vorteil in Kultur: ist in Kultur stabiler und kann von der Zelle nicht verstoffwechselt werden!

  • bleibt so länger aktiv

• wird zur Induktion des lac-Operons eingesetzt

  • da von den Zellen nicht abgebaut, steht IPTG für die Induktion länger zur Verfügung

• kann an den Repressor binden und ihn so von dem Operator lösen

• enthält

  • Proteine, NaCl, Hefeextrakte, Vitamine, Spurenelemente

  • Trypton (Proteine und Aminosäuren)

• KEINE ZUCKER!!!

• spaltet Lactose in

  • Glucose

  • Galactose

• Aktivität ß-Gal —> proportional zu der Anzahl der Transkripte

  • OD405 des enzymatischen Produktes o-Nitrophenol —> proportional zur Promoteraktivität (wird in Miller Units angegeben)

• Aktivität ist abhängig von der Inkubationszeit und Zellzahl

  • muss bei der Berechnung standardisiert werden, Ergebnis = 1 ml Zellvolumen, Zelldichte OD600 = 1, Zeitintervall 1 Min

• 
  

• zwischen verschiedenen Promotoren kann nicht verglichen werden, da diese u. U. verschiedene Shine-Dalgarno-Sequenzen haben

• Messung innerhalb eines Promoters kann aber erfolgen, da alle weiteren Einflüsse identisch sind

  • verschiedene Wachstumsbedingungen können verwendet werden

  • Promoteraktivität —> indirekt proportional zur ß-Galactosidase Aktivität

Zellen lysieren

SDS ist ein Detergenz, bricht die Doppellipidschicht der Membran auf, Zelle wird lysiert

Expression eines Proteins aus einem Organismus in einem anderen Organismus.

• grünes Fluoreszenz Protein

  • im Labor: CFP —> cyanes Fluoreszenz Protein

• —> Expression des GFP aus Qualle in E. coli

• Durch Mutationen in dem GFP Gen —> verschiedene Varianten

  • CFP, eGFP (enhanced GFP) usw.

• dient als Reportergen

  • unsichtbare Dinge sichtbar machen

  • Menge des produzierten Proteins kann nicht gemessen werden —> stattdessen wird die Fluoreszenzintensität des Fusionsproteins gemessen

    • zur Messung der Menge der Promoteraktivität

  • dient auch der Lokalisation von Proteinen

• cfp-Gen in einem Expressionsvektor (pRSET) kloniert

  • Vektor besitzt alle Informationen um auf der Grundlage des cfp-Gens das CFP-Protein in E. Coli produzieren zu lassen

  • E. Coli Stamm = BL21(DE3)

• besitzt Gen für die T7-Polymerase

  • aus dem T7-Phagen; T7-Phage baut sein Genom in das bakterielle Genom ein

  • Gen codiert für die T7-Polymerase (T7-RNAP)

    • das Gen steht unter Kontrolle des lacUV5 Promoters

    • lac-Promoter kontrolliert das lac-Operon (Aufnahme und Abbau von Lactose oder Allolactose)

• in BL21 liegt hinter dem lac-Promoter nicht das lac-Operon, sondern das Gen für die T7-RNAP

• —> in Anwesenheit von Lactose (oder Allolactose) wird in diesem Bakterienstamm das Gen für die T7-RNAP transkribiert (durch die bakterieneigene RNA-Polymerase) —> anschließend wird in der Translation das Enzym T7-RNA-Polymerase hergestellt

1. His-Tag wird an das N-terminale Ende des CFP fusioniert bzw.

   1. das mit Hilfe des pRSET-Vektors exprimierte CFP ist ein Fusionsprotein mit einem M-temrinalen 6xHis-Tag

   2. hat 2 Oris:

      1. f1 Ori und pUC Ori

   3. bla-Gen

      1. Ampicillin Resistenz, E. coli kann wachsen bei Zugabe Amp, andere Baks nicht

2. T7-RNA-Polymerase (mit Hilfe gene1 produziert) bindet an T7 Promoter in der Vektor-DNA

3. —> cfp-Gen liegt stromabwärts von dem T7-Promoter

   • Bindet die Polymerase an T7-Promoter —> Transkription cfp-Gen

4. Transkriptionsstart: Nukleotid, an dem die T7-RNAP beginnt die cfp-mRNA zu bilden

5. Terminator: Stopp-Signal für die T7-RNAP, liegt hinter dem Stop-Codon

6. Shine-Dalgarno-Sequenz: an diese Sequenz binden die Ribosomen an die mRNA

7. Start-Codon: hier beginnen die Ribosomen mit der Translation des CFP (und der davor liegenden Sequenzen)

8. Stopp-Codon: Ende der Translation

9. pUC ori: Startpunkt für die Replikation des Vektors

   1. multicopy plasmid

• Wirtszelle

  • lacUV5 —> lac-Promoter

  • T7-PO7 —> Gen, das aus T7-Phagen stammt

    • Gen für Polymerase aus T7 Phagen

• Vektor

  • T7-Promoter

• T7-Promoter-Region + T7-Polymerase

  • Vektor Wirtszelle

• T7-RNA-Polymerase bindet an die T7-Region/Promoter von pRSET

  • Fluoreszenzprotein wird abgelesen bzw. hergestellt

• 6 x Histidin

  • dient als Tag / Erkennungzeichen

• 6 Codons, die für 6 Histidins codieren

• Expressionsvektor pRSET wird in den E. coli Stamm BL21 (DE3) transformiert

  • —> dieser Zustand = uninduziert = es wird keine T7-Polymerase produziert

• Voraussetzung: Anwesenheit von Lactose/Allolactose

  • —> lac-Promoter wird angeschaltet

  • —> Bindung der bakterieneigenen RNA-Polymerase an den lac-Promoter

  • —> Expression der T7-Polymerase wird induziert

  • —> Bindung T7-Polymerase an den T7-Vektor

  • —> Produktion von viel CFP-mRNA (Transkription des cfp-Gens)

  • —> Produktion von viel CFP-Protein (Translation)

• 50 % aller Protine der Zelle ist CFP

  • zur Produktion sollten die Zellen so fit wie möglich sein

• optimal bei OD600 0,6-0,8 in der mid-log-Phase

  • Zeitpunkt der Induktion ist ausschlaggebend für die Menge des produzierten CFP

  • zu frühe/zu späte Induktion —> geringere Ausbeute des cfp

• IPTG wird hinzugegeben —> Induktion —> lac-Promoter wird angeschaltet —> Transkription cfp-Gen / regt die Zellen zur Transkription des cfp-proteins an

  
  

• Induktion regt die Produktion einer großen Menge cfp an

  • Produktion beansprucht viel Energie —> beeinträchtigt das Wachstum der E. coli Zellen

  • optimaler Zeitpunkt: 1/3der log-Phase

  • Kompromiss zwischen Fitness und Zellzahl (PD600 = 0,7)

• zu frühe Induktion:

  • vermindertes Wachstum der Bakterien —> gerine Menge cfp

• zu späte Induktion:

  • zu viele Nährstoffe im Medium bereits verbraucht —> nicht mehr genug Energie vorhanden um viel CFP zu produzieren

• Bakterium: E. coli BL21(DE3)

• Vektor: pRSET-Vektor; E. coli schon vor dem Versuch transformiert und auf Ampicillinhaltigen LB-Platten ausplattiert

  • LB = Kulturmedium

  • —> Amp weil: so wachsen nur die Amp-resistenten E. colis, nicht noch andere Bakterien

• Versuchsdurchführung:

  • Über-Nacht-Kultur in 50 ml Medium angelegt

  • Subkultur aus der ÜN-Kultur

    • Regelmäßige Proben bis die OD600 ca. 0,7 beträgt —> optimaler Induktionszeitpunkt

  • Induktion

    • IPTG wird hinzugegeben, 2 Stunden wachsen/schütteln lassen

  • Zellernte

    • in Falcon überführen —> zentrifugieren —>Überstand verwerfen —> Pellet weiter verwenden

• Eigenschaft von Stoffen, kurzwelliges Licht (Anregungslicht) zu absorbieren und längerwelliges Licht (Emissionslicht) wieder abzugeben

• Elektronen fluoreszierender Moleküle im Präparat absorbieren die Photonen des Anregungslichtes

  • —> werden auf ein höhreres Energieniveau gehoben, auf dem sie sich aber nicht halten können

  • —> die Elektronen fallen auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurück —> setzen aufgenommene Energie wieder frei

  • das energieärmere Emissionslicht (505nm) hat eine größere Wellenlänge und eine andere Lichtfarbe als das energiereichere Anregungslicht (452nm)

• Emissionsfilter —> nur das Emissionslicht trifft auf den Detektor

  • der Detektor nimmt die Probe in der jeweiligen Emissionsfarbe vor einem schwarzen Hintergrund wahr

• das mit Hilfe des pRSET-Vektors exprimierte CFP ist ein Fusionsprotein mit einem N-terminalen 6xHis-Tag

• 
  

• lag Phase

  • Bakterien stellen sich auf das neue Medium ein, ca 30 Minuten

  • = langsames Anwachsen einer  Bakterienkultur in frischem, nährstoffreichen Wachstumsmedium

• log Phase

  • Nährstoffe sind verfügbar, Zellen vermehren sich, Transkription/Translation fängt an

  • = optimale Wachstumsphase unter optimaler Nährstoffversorgung. Die Bakterien teilen sich ca. alle 20 Minuten durch Zweiteilung. Die Individuenzahl steigt exponentiell an.

• stationäre Phase

  • Wachstumsphase ist vorbei, die Nährstoffe sind verbraucht

  • = Nährstoffe im Medium sind verbraucht. Die Bakterienpopulation stirbt ab, kann sich nicht mehr vermehren oder fällt einfach nur in eine "Wartehaltung". Die Messung der Suspension zeigt identische Messwerte über lange Zeiträume (mehrere Stunden) an, bevor die Suspension von ihrer Trübung in eine klare Lösung übergeht.

• Absterbephase

  • Die Bakterien sterben unter lange andauerndem Nährstoffmangel und lösen sich auf

—> bedeutet immer, dass eine Veränderung vorliegt

• setzt die genetische Information, die auf dem Vektor ist, in ein Protein um

• hat alle genetischen Informatuonen um ein Protein zu produzieren

• Promoter

• Haarnadelstreifen

• Shine-Dalgarno-Sequenz

  • Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist eine Sequenz der mRNA bei Prokaryoten, die als Teil der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) von den Ribosomen erkannt wird und damit den Startpunkt der Translation markiert.

  • Ribosomen binden an Shine-Dalgarno-Sequenz —> Translation beginnt am Start-Codon und endet am Stop-Codon

• Start- und Stop-Codon

• Tag (Reinigung!)

• —> Affinitätschromatographie

• Cfp —> Fusionsprotein mit einem N-terminalen 6fach His Tag

  • die 6 His Reste ermöglichen eine Reinigung des Fusionsproteins aus dem Zelllysat über eine Ni-NTA-Agarosematrix

  • —> jeweils 2 His-Reste binden an ein Nickel-Ion in der Matrix

    • Proteine ohne 6fach-His-Tag binden schwach oder garnicht

  • —> um gebundene Proteine von der Matrix zu entfernen wird Imidazol verwendet

    • Imidazol verdrängt die Histidinreste vom Nickel

    • um die 6fach-His-Reste zu verdrängen, benötigt man eine hohe Imidazol Konzentration

  
  

• 
  

• in Lösungen mit niedriger H+-Ionen Konzentration —> neutraler pH-Wert —> binden die His-Reste an die Säulenmatrix

• in Lösungen mit hoher H+-Ionen-Konzentration —> niedriger pH-Wert —> His-Reste lösen sich von der Säule ab

• Erst Equilibrierungspuffer —> Reinigung über das Säulchen, wird mit 1 ml Ni-NTA-Agarose versetzt

  • Eq.Puffer = 25 mM Imidazol

  • —> niedrige Imidazolkonzentration —> nicht oder nur schwach gebundene Proteine werden von der Säule gespült

• Waschpuffer 25 mM Imidazol

  • zwei Mal

  • —> niedrige Imidazolkonzentration —> nicht oder nur schwach gebundene Proteine werden von der Säule gespült

  • 3fach Step Elutionspuffer 250mM Imidazol

  • bei 1. Mal sinkt es lange, Durchlauf ist noch kein Eluat!

  • nur Proteine und Waschpuffer!

  • erst beim 2. Mal kommt Eluat raus —> CFP

    • hier kommt es zum Farbumschwung, da das 6fach His von dem Imidazol verdrängt wird

  • —> hohe Imidazolkonzentration —> Imidazol verdrängt 6fach-CFP von der Matrix

• Damit das funktioniert:

  • Proteine müssen 6fache His Reste haben —> sonst keine Bindung mit Ni-NTA!

• —> die Struktur von Imidazol ist ähnlich wie die Struktur von Histidin

• 
  

• Lysispuffer —> enthält Harnstoff

  • denaturiert Membranproteine —> Lyse der Zellen

  • denaturiert Proteasen —> kein unerwünschter Abbau von Proteinen, inaktiviert Proteasen

• hier kann auch noch Chloroform zugegeben werden —> stärkere Zelllyse!

• 1. Entfernung unerwünschter Proteine

  • Anreicherung 6fach His

• 2. Aufkonzentrieren mithilfe einer Säule

  • Binden —> 6fach His bindet an einer Säule, andere Proteine binden nicht

  • Waschen —> nicht gebundene Proteine werden weggespült

  • Elution —> Ablösen des 6fach His CFP von der Matrix

    • Im Eluat ist das Ziel Ziel: eine möglichst hohe Konzentration an dem gesuchten Protein, hier 6fach His CFP

• Matrix mit bivalent gebundenem Nickel bindet Histidine des 6fach-CFP

• andere Proteine binden nicht oder nur schwach

• 2 Histidine binden an ein Nickelion

• Fritte —> Agarosegel —> Flüssigkeiten laufen durch

• spezifischer Antikörper Nachweis

  • spezifischer als SDS Nachweis/Identifikation gereinigtes Protein

• —> hier: Nachweis 6fach-His-CFP-Fusionsprotein mit einem Antikörper gegen den His-Tag

  • indirekter Nachweis, da CFP an dem Histidin hängt

• Eluat —> Membran bindet Proteine, Eluat aus der Reinigung wird auf eine Membran aufgetropft

• 1. Zugabe Antikörper (Maus) —> spezifisch für His-Tag des CFP, IgG —> Anti-His-IgG

• 2. Zugabe Antikörper (Schaf) —> gegen AK der Maus —> Anti-Maus-IgG

  • spezifisch für den Fc-Teil des 1. Antikörpers, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase

  • —> Anti-Maus-IgG/AP-Konjugat

    • Alakalische Phosphatase —> überträgt Phosphatgruppen; arbeitet im alkalischen Mileu

    • setzt die Substrate NBT und BCIP um —> führt zu farbigem Niederschlag an der Stelle der Membran, an der das Eluat aufgetropft worden ist

1. PVDF-Membran vorbereiten

2. Einlegen Membran in Methanol

   1. sonst würde die Probe einfach abtropfen und die Proteine nicht binden

3. Waschung mit Oxidan für 30 Sek

4. Abtupfen

5. 2x Waschen mit TBS (Tris buffered saline)

6. Inkubation in Blocking Puffer

   1. BSA besetzt alle freien Stellen auf der Membran, sodass hier später keine unspezifischen Bindungen mit AKs stattfinden können.

7. 2x Waschen mit TBS/Tween/Triton

8. Waschen mit TBS

9. Inkubation mit 1. AK --> Anti-His-IgG in Blocking Puffer; AK bindet nur an spezifischem Protein

   1. AK wird nach Inkubation aufgehoben

10. 2x Waschen mit TBS/Tween/Triton

    1. entfernt Antikörper,die nicht an das His-Tag gebunden haben

11. Waschen mit TBS

12. Inkubation mit 2. AK --> Anti-Maus-IgG/AP in Blocking Puffer

    1. AK wird nach Inkubation aufgehoben

• nur Nachweis der Proteingröße, nicht ganz eindeutig

• kann auch als Nachweis der Sauberkeit verwendet werden

• 3 % BSA in TBS

  • BSA = bovines Albumin Serum, viel Protein

• —> Absättigung der Membran durch Proteine —> damit die AK nicht binden können

• —> überschüssige Proteine werden mit 2x TBS gewaschen

• Membran mit BCIP und NBT bedecken —> im Dunklen, da Farbstoff im Licht zerfällt

• Sobald Punkte mit dem aufgetragenen 6xHis-CFP sichtbar werden -> Reaktion mit Oxidan abstoppen

• Farbreaktion im Detail:

  • Probe mit 2 Antikörpern und Alkalischer Phosphatase -> Farbreaktion

  • Farbstoff mit 2 Substanzen:

    • BCIP -> P für Phosphat

    • Alkalische Phosphatase spaltet Phoshphatgruppe ab -> es liegt BCI und P vor -> BCI + NBT -> Oyidation -> lila/schwarze Farbe

• An dem 1. Antikörper können mehrere 2. AK binden —> Amplifikation des Signals

• seifenähnliche Substanz

• dient dem Waschvorgang der Membran

• hat eine hohe Affininität zu Aminosäuren

  • führt zu einer Bindung von Proteinen an der Membran

• Muss vorher mit Methanol behandelt werden

  • sonst würden die Proteine an der Membran nicht binden

• Proteine werden der Größe nach aufgetrennt

• Proteine werden durch das SDS negativ geladen

  • laufen zum Plus Pol

• kleine Proteine wandern schneller durch das Gel als große Proteine

• Beim der Gelelektrophorese lässt man einen Marker mitlaufen

  • Leiter

  • logarithmisch

  • so kann nachher die Größe des Proteins bestimmt werden

• 
  

• der lac-Promoter ist leaky

• es wird immer ein bisschen abgelesen, ob Laktose da ist oder nicht

  
  

• es werden mehr His-Reste weggewaschen

• man kann mit der Imidazolkonzentration spielen, um eine reinere Waschung zu erzielen

  • je optimaler der Wascherfolg, desto reiner ist die Bande im SDS Gel

• man kann einen Imidazolgradienten bilden