Wie funktioniert ein Western-Blot (Skizze)? Welche Art von Epitopen lässt sich nachweisen, welche nicht? Begründen Sie!
Nachweis von kontinuierlichen Epitopen (=Sequenzepitope) möglich
Nachweis von diskontinuierlichen Epitopen (=Konformationsepitope) nicht möglich -> Grund: Dem Western Blotting geht i.d.R. eine Gelelektrophorese voraus, bei der Proteine denaturiert und aufgetrennt werden; Konformationsepitope werden durch Denaturierung von Proteinen (→Antigenen) „zerrissen“, Sequenzisotope bleiben hingegen intakt und werden „zugänglich“ gemacht
5) Inkubation mit spezifischen AK -> waschen
7) indirekter enzymmarkierter Nachweisantikörper -> je stärker die Färbung, desto mehr AG gebunden
Über welchen Enzym-Immuntest ließe sich ein Hapten quantitativ bestimmen?
Kompetitives ELISA
Wie könnte ein Enzymimmuntest zur quantitativen Bestimmung des Haptens Digitonin durchgeführt werden
der Urin einer schwangeren Frau enthält HCG
Teststreifen bestehen aus einem mobilen Anti-HCG-AK, der mit Goldkügelchen markiert ist, einem fixierten Anti-HCG-AK und einem weiteren fixierten Anti-Maus-AK
Kein Sandwich-ELISA, da nur eine Bindungsstelle -> Kompettitives Immunoassay
Kompetitiv = je höher die Konz. An Anitgen, desto geringer die Farbreaktion -> markiertes AG und AG aus Serum konkurrieren um denselben AK -> immobilisiertes AG und freies AG in Serum konkurrieren um denselben markierten AK (AG-AK-Komplex, das frei gelöst ist, geht beim Waschen verloren)
Wie funktioniert ein Sandwich-ELISA (2-Seiten-Immuntest)? Welchen Anforderungen müssen Analyt und verwendete Antikörper genügen?
eine feste Phase wird mit für den Analyten (Antigen) spezifischen monoklonalen Antikörpern beschichtet; freie Stellen auf der festen Phase werden durch irrelevantes Protein „blockiert“
Probe wird aufgetragen; Inkubation, danach Waschen (enthält die Probe das Antigen, bindet dieses an den spezifischen Antikörper und wird nicht abgewaschen)
Auftragen von enzymmarkierten Detektions-Antikörpern, die spezifisch für das Antigen von Interesse sind; erneut Waschen (wenn Antigen vorhanden, bindet der enzymmarkierte Detektions-Antikörper und wird nicht abgewaschen)
Zugabe von chromogenem Substrat: Enzym am markierten Detektions-Antikörper setzt Substrat in farbiges Produkt um; je stärker die Färbung, desto mehr Antigen ist vorhanden (genaue Bestimmung mittels photometrischer Messung)
-> Analyt (Antigen): muss groß genug sein bzw. genügende Bindungsstellen (Epitope) aufweisen, um zwei Antikörper binden zu können; wenn das Antigen diskontinuierliche Epitope besitzt, darf es nicht denaturiert sein
→ Antikörper: müssen spezifisch für Analyt (Antigen) sein
Welche Materialien werden für ein Sadwich-ELISA benötigt?
Mikrotiterplatte, Pipetten (z.B. halbautomatisch)
spezifische monoklonale Antikörper
Probe (z.B. Serumprobe mit möglicherweise dem Antigen von Interesse)
irrelevante Proteine zum „Blockieren“ freier Stellen auf der festen Phase (Mikrotiterplatte) enzymmarkierte Detektions-Antikörper
H2O zum Waschen
Substrat für Enzym
Photometer
Wie würden Sie nachweisen, dass das Serum eines Geimpften Antikörper gegen Hepatitis-B Viren enthält (z. B. zur Kontrolle des Vakzinierungserfolges)? Gereinigtes Antigen (rekombinantes HBsAg, 25,4 kDa) steht zur Verfügung. Welche Substanzen benötigen Sie außerdem und wie müsste der Test aufgebaut sein?
Mittels kompetitivem Immunassay (ELISA):
Antigen an feste Phase adsorbieren, freie Stellen mittels irrelevanter Proteine „blockieren“
enzymmarkierten monoklonalen Antikörper, der Antigen ebenfalls spezifisch binden kann sowie Serum, das möglicherweise die Antikörper von Interesse enthält auftragen -> enzymmarkierte Antikörper und Antikörper von Interesse konkurrieren gegebenenfalls um die Bindung an das Antigen, das an der festen Phase sitzt
Waschen und anschließend Zugabe von Substrat für das Enzym -> je mehr Antikörper von Interesse an das Antigen gebunden haben, desto schwächer die Färbung, da weniger enzymmarkierte Antikörper binden konnten (-> Auswaschung); genaue Bestimmung mittels photometrischer Messung
Bei einem Patienten wurde ein Colonkarzinom operativ entfernt. Für das postoperative Monitoring wird der Tumormarker CEA (carcinoembryonales Antigen, 180 kDa) im Serum gemessen. Wie könnte dieser Enzymimmuntest aufgebaut sein?
AG CEA (Tumormarker im Serum) wird gesucht → Kompetitionsassay (vom MW her könnte aber auch Sandwich ELISA gehen)
Eine Patientin leidet an autoimmuner Hyperthyreose (Morbus Basedow). Zur Verfolgung des Therapieerfolges wird im Serum die Thyroxinkonzentration (C15H11I4NO4; MW 777 Da) bestimmt. Wie könnte ein geeigneter Enzymimmuntest aufgebaut sein?
oder:
Wie könnte ein Enzymimmuntest aufgebaut sein, der zur quantitativen Bestimmung von Digitoxin (MW 765 Da) in Fingerhutextrakt oder Patientenserum geeignet ist? Ihnen stehen u. a. ein kopplungsfähiges Digitoxin-Derivat, ein monoklonaler Antikörper gegen Digitoxin, ein Markerenzym und Rinderserumalbumin zur Verfügung.
Kompetitionsassay
Welche Methode verwenden Sie, um die zytotoxische Aktivität lymphoider Zellen in vitro zu messen?
Cytotoxizitäts-Assay:
Markierung der Zielzellen mit radioaktivem Chrom (51Cr) → wird während der Inkubation durch die Zielzelle aufgenommen
Aufreinigen durch Zentrifugation → Entfernung nicht aufgenommener radioaktiver Atome
Inkubation mit zytotoxischen T-Zellen, dann Messen des freien 51Cr
Wie lässt sich die Proliferation von lymphoiden Zellen messen?
„lymphocyte stimulation test“
Isolierung von lymphoiden Zellen aus Blut, Inkubation mit Antigen-Suspension, Kulturmedium und 3H-Thymidin
gelöstes 3H-Thymidin bei Zellernte entfernen
Radioakivität durch Szintillationszähler nach Zellernte messen → wenn Proliferation stattgefunden hat, muss 3H-Thymidin es als eine der vier Basen zwangsläufig in die DNA der hervorgehenden Zellen eingebaut worden sein und Radioaktivität kann detektiert werden
Wie gehen Sie vor, wenn Sie zytotoxische T-Lymphozyten (Tc) aus dem Blut eines Patienten isolieren wollen? Welches Unterscheidungsmerkmal der Tc-Zellen würden Sie nutzen, wie würden Sie sie markieren und welche Geräte würden Sie einsetzen?
Aus einem operativ entfernten Tumor sollen zytotoxische T-Lymphozyten isoliert werden, da vermutet wird, dass viele von Ihnen tumorspezifisch sind. Wie gehen Sie vor und welche Antikörper benötigen Sie?
Tc-Zellen tragen CD8 -> AK muss gegen CD 8 gerichtet sein
AK muss Fluoreszenz- oder elektronendichte Markiert sein (Kolloides Gold, Ferritin)
Untersuchung durch FACS oder MACS bzw. AKaffinitätskromatographie
Wie können Antikörper zur Isolierung von T-Helfer-Zellen genutzt werden; welche Geräte können dafür verwendet werden und welches Antigen sollten die verwendeten Antikörper binden?
T-Zellen können unter Einsatz Fluoreszenz-markierter oder Magnetpartikel-markierter monoklonaler Antikörper (MoAK) mittels FACS (Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) bzw. MACS (Magnet-aktivierter Zellsortierer) isoliert werden
Geräte: Laser, Detektor, Ablenkplatten/Kondensator, Auffangkolben, Tropfvorrichtung (FACS) bzw. Magnet, Auffangkolben, Tropfvorrichtung (MACS)
CD8 an der Oberfläche der zytotoxischen T-Zellen
Welche Schritte sind für eine Anreicherung von zytotoxischen T-Zellen aus der Milz einer immunisierten Maus mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS) erforderlich?
Fluoreszenz-Markierung von monoklonalen Antikörpern, die gegen Antigen CD8 gerichtet sind
Mischung mit Zellextrakt aus der Milz und Inkubation (Anikörper, die gegen CD8 wirken)
Isolierung der T-Zellen im FACS (-> Aussortierung der markierten Zellen mittels Laserstrahl)
Erläutern Sie kurz die Funktionsweise eines eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS)!
Prinzip = Emission von optischen Signalen einer Zelle, die durch Laser angeregt wurde
monoklonale Antikörper, die gegen ein spezifisches Antigen gerichtet sind, werden mit Fluoreszenzfarbstoff markiert
markierte Antikörper werden zum Analytgemisch (Einzelzellsuspension) gegeben, das die Zellen enthält, die sortiert werden sollen (darunter also auch die Zellen mit dem spezifischen AG) → Inkubation
die Zellen der Einzelzellsuspension werden durch hydrodynamische Fokussierung wie an einer Perlenkette in einer Kapillare an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet
bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben (=angeregt)
nach dem Laserpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr Ursprungsniveau zurück; die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen Photodetektor registriert wird, verhält sich proportional zur Menge an gebundenen Antikörpern
die Zellen (markierter AK gebunden vs. nicht-gebunden) werden an Ablenkplatten im elektrischen Feld getrennt
Wie funktioniert die magnetische Zellsortierung (MACS)?
monoklonale Antikörper, die gegen ein spezifisches Antigen (z.B. gegen CD4 oder CD8 von TZellen) gerichtet sind, werden mit Magnetpartikeln markiert
markierte Antikörper werden zum Analytgemisch gegeben, das die Zellen enthält, die sortiert werden sollen (darunter also auch die Zellen mit dem spezifischen AG) → Inkubation
Sortierung der Zellen mittels MACS-Gerät (→ Trennung der Zellen, die den markierten AK gebunden haben von den Zellen, die ihn nicht gebunden haben im Magnetfeld)
Warum kann man mit Hilfe der Affinitätschromatographie keine Zellpopulationen isolieren?
Masse und Größe der Zellen sind hinderlich:
Zellen stark genug zu binden durch einzelne an Matrixpartikel adsorbierte AK schwierig
Elution beim Spülen nicht verhinderbar
wenn AK zu stark binden, kann man nicht mehr eluieren
Was versteht man unter Immunaffinitätschromatographie?
= spezielle Form der Affinitätschromatographie
Aufreinigung/Gewinnung von Ag und AK beruht auf der festen, aber reversiblen Ag-AKBindung
Vorgang:
an Partikel gebundene Antikörper gegen Antigen A (MoAK ist an einer unlöslichen Matrix gebunden)
Zugabe von Molekulargewicht
Auswaschen ungebundener Moleküle
gebundene Moleküle spezifisch eluieren (Eluation im sauren oder alkalischen Bereich löst die Antigen-Antikörper-Bindung)
Wie kann man die Antigen-spezifische Antikörperfraktion aus einem polyklonalen Antiserum isolieren?
Wie kann man ein Antigen aus einem Stoffgemisch mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers reinigen?
Wie kann man ein Antigen aus einem Stoffgemisch (z. B. Faktor VIII = Thromboplastinogen aus Spenderserum) mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers reinigen?
Eine Ziege wird mehrfach mit je 100 μg Maus-Immunglobulin immunisiert. Wie lässt sich die spezifische Fraktion aus dem gewonnenen polyklonalen Antiserum isolieren?
durch Affinitätschromatographie
Wozu wird Immunaffinitätschromatographie eingesetzt, welche Moleküle bzw. Substanzen werden mit ihrer Hilfe gereinigt?
Sonderform der Affinitätschromatographie, die auf spezifischen, reversiblen Wechselwirkungen von Antikörpern und Antigenen beruht: Bindung von Molekülen an einen trägerfixierten, immobilisierten Bindungspartner und danach Elution; im Falle der Immunitätschromatographie Bindung von spezifischen Antikörpern an spezifische Antigene
Isolierung/Aufreinigung von Molekülen → Antikörper bzw. Antigene
Welche Liganden werden in der Affinitätschromatographie an feste Träger gekoppelt?
Spezifisch und reversibel bindende Liganden
Passende AK und AG
Charakterisieren Sie die Unterschiede der Antigenerkennung durch Antikörper und T-ZellRezeptoren!
AK (Ig) -> B-Zell-Rezeptor
TcR -> T-Zell-Rezeptor
Antigenerkennungsmoleküle von B-Zellen
Antigenerkennungsmoleküle von T-Zellen
als membrangebundene Rezeptoren (B-ZellRezeptoren auf der Zelloberfläche) oder als sezernierte AK, die Antigene binden und eine humorale Effektorfunktion auslösen
binden an viele verschiedene, chemisch unterschiedliche Antigene
Antigen-Antikörper-Bindung ist hoch spezifisch
Antigenbindungsstellen liegen in den konstanten Regionen
nur als Rezeptoren auf der Zelloberfläche (es gibt keine sezernierte Form des Rezeptors) → zellständige Abwehrmoleküle, die ihre Wirkung vor Ort entfalten
erkennt nur Peptidfragmente fremder Proteine, wenn sie an MHC-Moleküle gebunden sind, die auf allen Zelloberflächen vorkommen
AK erkennen Antigendeterminanten (Epitope) an der Oberfläche von Antigenmolekülen
somatische Hypermutation
mittlere bis hohe Affinität
TcRs erkennen einen Komplex von Peptiden und MHCs an der Oberfläche von körpereigenen APC
keine somatische Hypermutation
niedrige Affinität
Wie erkennen zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen virusinfizierte Zielzellen? Welche Gemeinsamkeiten haben diese Zellen?
zytotoxische T-Zellen:
erkennen fremde Antigene, die von MHC-I-Molekülen präsentiert werden
Viruspeptide werden von MHC-I-Molekülen präsentiert, zytotoxische T-Zellen erkennen MHCI-Peptid-Komplexe Virus-infizierter Zellen mit ihrem T-Zell-Rezeptor (über CD8+
Protein der zytotoxischen T-Zellen)
NK-Zellen:
erkennen Zellen, welche die eigenen MHC-I-Moleküle verloren haben oder mit Antikörpern markiert wurden (→ ihre Inhibierung wird dadurch aufgehoben)
Welche Bestandteile des BCR- bzw. des TCR-Komplexes besitzen ITAM’s und sind für die Initialisierung der Signaltransduktion verantwortlich?
(ITAM = Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)
BCR: Ig α & Ig β (= CD79 α & β-Ketten)
TcR: ϵ/ δ-Ketten (= CD3) & ζ-Ketten
Wie ist ein B-Zell-Rezeptor aufgebaut, welche Funktion hat er?
Lingandenbindung durch membranständiges Ig
Signaltransduktion über Heterodimer CD79 (ITAM-Motiv auf cytosolischer Seite -> intrazelluläre Signalweiterleitung)
Wie ist der T-Zell-Rezeptor-Komplex aufgebaut?
Komplex aus 2 ProteinUE (α & β), jeweils bestehend aus konstanter und variabler Domäne
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