Fragen Teil I

Nukleasen

nicht korrekt eingebaute Nukleotide aus dem neu synthetisierten DNA-Strang zu entfernen

• proof reading Aktivität

• bei maximaler Sequenzgenauigkeit !

Gelelektrophorese

Ist ein Selektionsmarker

durch die auf dem Klonierungsvektor liegende Antiobiotikaresistenz wachsen nur die reistenten Bakterien auf der Agarplatte und die, die gegen das Antibiotikum sensitiv sind, nicht

DNAsen

eine Datenbank für Restriktionsenzyme

Selektionsmarker für E.coli mit pUC 8

beta-Laktam-Antibiotikum

ein Medikament

einfacher Klonierungsvektor

ist eine Ansammlung von Restriktionsschnittstellen

spaltet Laktose -> aus E. coli hydrolisiert Laktose zu Glucose und Galaktose

kann X-Gal (gelber Farbstoff) zu blauem Farbstoff umsetzen

Probe -> bekannte DNA Sequenz

Reagenzien

• Primer -> auf Sequenz abgestimmt

• DNA-Polymerase

• Nukleotide

Detektionssystem

Dentaturierung

• Aufspaltung der doppelsträngigen DNA in ihre beiden Einzelstränge

Annealing

• Primer Anlagerung, Vorgang, bei dem der Kopiervorgang starten kann

• Kurze komlpementäre Oligonucleotide (Forwars-Reverse-Primer), die das zu amplifizierende DNA Stück einrahmen, lagern sich an die DNA

Elongation

• die DNA Polymerase lagert sich an die Primer an und rutscht über das Template

• dabei synthetisiert das Enzym einen komplementären Strang

das Agarosegel trennt die Probe der Größe nach auf

—> eine Leiter bzw. ein Standard mit bekannten Basenpaar Größen muss als Probe in eine Tasche aufgetragen werden (meist logarythmisch), um nach der Gelelektrophorese die Größe der Proteine zu bestimmen

Polymerase arbeiter ungenau, die synthetisierten Stränge können eine falsche Basenabfolge haben -> Sequenzierug hätte ein falsches Ergebnis

DNA Matrize als Vorlage

Primer -> bindet an Matrize

DNA-Polymerase -> synthetisiert komplemenräten Strang aus dNTPs und ddNTPS in einem Reaktionsgefäß

• ddNTPs -> 4 versch. je Base & verschiedener Farbstoff

• bei zufälligem Verbau ddNTP -> Abbruchreaktion

• Synthetisierung kommt zum Erliegen -> es entstehen viele unterschiedlich lange Basenabfolgen

Auftrennung der Produkte mittels Kapillarelektrophorese

Produkte mittels Laser zur Fluoreszenz angeregt

• jedes der 4 ddNTPs hat eigenen Farbstoff -> Identifikation möglich

Detektor misst die Fluoreszenz -> gibt Elektropherogramm wider -> Sequenz der Basen der sequenzierungen DNA-Strangs ist ablesbar

Wenn Elektropherogramm unsicher ist, welche Base -> gibt “N” aus

im Gegensatz zu herkömmlicher PCR -> gesteigerte Sensitivität und Spezifität

ist eine verschachtelte PCR

-> zwei PCR Reaktionen werden hintereinander geschaltet

zweites Primerpaar benötigt, das an Sequenzbereich der ersten Matrize bindet

das Produkt der ersten PCR ist die Matrize für die 2. PCR, deswegen auch sensitiver & spezifischer

-> wird verwendet wenn die Spezifität der gewünschten Zielsequenz gesteigert werden soll, z. B. für Diagnostik

schneiden die DNA an hochspezifischen Erkennungssequenzen

hängen Methylgruppen an spezifische DNA-Sequenzen

wandern die kleineren Fragmente schneller zum positiv gelandenen Pol

Mehrere Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym, was verwendet werden soll

die Translation

Als Folge der RNAi wird die mRNA in mehrere Bruchstücke gespalten

die zu übertragende Information wird zerstört oder eine Translation in ein Protein verhindert

wird aus RNA synthetisiert

wird durch eine Reverse Transkription hergestellt

rekombinant -> Tet s, Amp r

• Aussat auf: Amp -> Wachstum

nicht rekombinant -> Tet r, amp r

• Aussat auf: Tet und Amp -> Wachstum

kein -> tet s, amp s

• Aussat auf: Agar mit Tet und Amp -> kein Wachstum

Ein YAC (Yeast Artificial Chromosome) ist ein künstliches Chromosom, welches der Hefe nachempfunden ist

Es dient als Vektor und erlaubt im Gegensatz zu den Cosmiden eine Klonierung von größeren Genomabschnitten

Ja

Cosmide -> Plasmide, die cos-sites enthalten

• -> cos-sites = DNA Sequenzen aus lamda Phagen

-> Temperatur: max. Temp. bei welcher sich die Polynukleotidsequenz noch an den komplementären DNA-Strang bindet

gewählte Annealing-Temperatur ist während einer PCR entscheidend für die Spezifität der Bindung an die Zielsequenz

Eine maximale Übereinstimmung der Basenpaarungen hat eine maximale Bindungsstärke zur Folge und somit auch eine optimale Spezifität.

a) Bei einer zu niedrigen Temperatur kann es zu „lockeren“ unspezifischen Bindungen der Primer kommen und in der Folge unter Umständen zu unerwünschten Produkten

• Basenpaarungen stimmen nicht immer überein -> lockere Bindungen

b) Bei zu hohen Temperaturen entsteht kein Produkt

• Erhöht man die Temperatur, so kommt es zum Aufschmelzen der Basenpaarungen/Verbindungen, da ihre Bindungsenergie nicht groß genug ist

• Als Regel lässt sich formulieren „Je höher die Temperatur, desto spezifischer das Annealing an die Zielsequenz“

optimale Primerlänger = 16-18 Nukleotide, max. 24 -> Temp. abhängig von Primerwahl

c) zu kurzer Primer -> zu geringe Spezifität des PCR-Produkts

• führt zu einer zu geringen Annealing Temperatur

d) zu langer Primer -> kein Produkt, zu hohe °C Temp.

• führt zu einer zu hohen Annealing Temperatur

1000bp/min Elongatiionsgeschwindigkeit -> arbeitet ungenau

aufgrund fehlender proof-reading Aktivität -> hohe Fehlerquote

Bessere Polymerase: Pfu-Polymerase

• nur 500 bp/min

• dafür aber proof-reading-Aktivität (3’-5’-Exonukleaseaktivität)

Polymerase I aus E. coli -> auch Klenow -> Temperaturoptimum bei 37 °C

-> andere Polymerasen, z. B. bei Taq, bei 72°C -> bei PCRs oft hohe Temperaturen verwendet

deswegen Klenow -> verwendet bei z. B. Sequenzier PCR und in vitro Transkriptionen u. Ä.

SYBR-Green I -> bindet an kleine Furche der dsDNA und interkaliert zwischen den Basenpaaren

• qt-RT-PCR wird mit unmarkierten genspezifischen Primern in Anwesenheit von von SYBR Green durchgeführt

• durch Reaktion von SYBR mit nicht nur der Zielsequenz, sondern auch mit anderen, wie Primer-Dimeren oder anderen PCR-Produkten —> hohe Sensitivität & geringe Spezifität

Hybridisierungssonden -> spezifisch, aber wenig sensitiv

• während eines PCR-Zyklus hybridisieren zwei Sonden in geringem Abstand zueinander an die komplementäre DNA ->

  • Fluoreszenzübertrag vom Donor auf den Akzeptor -> FRET

• Akzeptor-Fluoreszenz steigt proportional mit der Konzentration komplementärer DNA

Genotypisierung mittels Schmelzpunktanalyse -> qualitative Real-Time PCR

Schmelzpunktverläufe von homo- und heterozygoten Genotypen können so identifiziert und interpretiert werden

-> Bestimmung der Spezies, Detektion genetischer Risikofaktoren, Mutationsdetektion bestimmter genetischer Erkrankungen wie z. B. Faktor V Leiden

Hämatologie: -> Faktor-V-Leiden

Lebensmittelchemie: -> Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel

Grundlagenforschung: -> Vergleich von RNA-Expressionsmustern ganzer Proteinfamilien z. B. Zytokine

normal: viele unterschiedliche Anwendungsbereiche

• Nachweis nur einer bekannten Basensequenz

Multiplex: nur in der Forensik angewendet

• einzlene PCR-Verfahren nicht getrennt, sondern alle in einer PCR-Reaktion durchgeführt

• -> PCR-Ansatz mit Nachweis von mehr als einem Genomabschnitt

Western Blot (Einzelproteinanalyse) / Gelelektrophorese

Immunodetektion

Fluoreszenzmikroskopie

Gel-basierte Analyse

Gel-freie massenspektrometrie-basierte Methoden- gezielte massensprektrometrische Analyse

Proteinarrays / Beas-basierte Arrays

Absolute Quantifizierung using Standards

Die In-vitro-Transkription, also die DNA-abhängige Synthese von RNA-> spezifische in-vitro-Synthese von RNA-Transkripten klonierter Gene oder zellulärer DNA

man benötigt ein Gemische aus Ribonucleotiden durch Transkription der DNA-Matrize um die gewünschte mRNA zu synthetisieren

ist eine molekularbiologische Methode zur Erzeugung von RNA und zur Untersuchung von Promotoren und ihrer Aktivierung durch Transkriptionsfaktoren

DNA/Matrize

dNTPs

ddNTPs -> radioaktiv markiert

Primer

DNA-Polymerase