Welche der nachfolgenden Enzyme werden verwendet, um DNA Moleküle abzubauen?
Nukleasen
Die Funtion der 3’-5’-Exonukleaseaktivität ist…
nicht korrekt eingebaute Nukleotide aus dem neu synthetisierten DNA-Strang zu entfernen
proof reading Aktivität
bei maximaler Sequenzgenauigkeit !
Welche Methode wird angewandt, um unterschiedliche DNA-Fragmente zu trennen?
Gelelektrophorese
Warum enthalten bei der Klonierung Plasmide Gene für Antibiotikaresistenzen?
Ist ein Selektionsmarker
durch die auf dem Klonierungsvektor liegende Antiobiotikaresistenz wachsen nur die reistenten Bakterien auf der Agarplatte und die, die gegen das Antibiotikum sensitiv sind, nicht
Restriktionsenzyme vom Typ II gehören zu den …
DNAsen
REBASE ist..
eine Datenbank für Restriktionsenzyme
Ampicillin ist ein..
Selektionsmarker für E.coli mit pUC 8
beta-Laktam-Antibiotikum
ein Medikament
pUC8 ist ein…
einfacher Klonierungsvektor
Ein Polylinker..
ist eine Ansammlung von Restriktionsschnittstellen
Die beta-Galaktosidase ..
spaltet Laktose -> aus E. coli hydrolisiert Laktose zu Glucose und Galaktose
kann X-Gal (gelber Farbstoff) zu blauem Farbstoff umsetzen
Aufbau Bakteriophage
Welche Grundkomponenten benötigen Sie für einen PCR-Ansatz? (6)
Probe -> bekannte DNA Sequenz
Reagenzien
Primer -> auf Sequenz abgestimmt
DNA-Polymerase
Nukleotide
Detektionssystem
In welche Schritte kann die PCR einteilen (3 DAE)?
Dentaturierung
Aufspaltung der doppelsträngigen DNA in ihre beiden Einzelstränge
Annealing
Primer Anlagerung, Vorgang, bei dem der Kopiervorgang starten kann
Kurze komlpementäre Oligonucleotide (Forwars-Reverse-Primer), die das zu amplifizierende DNA Stück einrahmen, lagern sich an die DNA
Elongation
die DNA Polymerase lagert sich an die Primer an und rutscht über das Template
dabei synthetisiert das Enzym einen komplementären Strang
Wie kann ich die Basenpaarlänge in einem Agarosegel bestimmen?
das Agarosegel trennt die Probe der Größe nach auf
—> eine Leiter bzw. ein Standard mit bekannten Basenpaar Größen muss als Probe in eine Tasche aufgetragen werden (meist logarythmisch), um nach der Gelelektrophorese die Größe der Proteine zu bestimmen
Was würde passieren, wenn die Konzentration der Didesoxinucleotide in der Kettenabbruchreaktion zu hoch wäre?
Polymerase arbeiter ungenau, die synthetisierten Stränge können eine falsche Basenabfolge haben -> Sequenzierug hätte ein falsches Ergebnis
Wie werden die sequenzierten DNA-Fragmente nach dem Cycle-Sequenzing nachgewiesen?
DNA Matrize als Vorlage
Primer -> bindet an Matrize
DNA-Polymerase -> synthetisiert komplemenräten Strang aus dNTPs und ddNTPS in einem Reaktionsgefäß
ddNTPs -> 4 versch. je Base & verschiedener Farbstoff
bei zufälligem Verbau ddNTP -> Abbruchreaktion
Synthetisierung kommt zum Erliegen -> es entstehen viele unterschiedlich lange Basenabfolgen
Auftrennung der Produkte mittels Kapillarelektrophorese
Produkte mittels Laser zur Fluoreszenz angeregt
jedes der 4 ddNTPs hat eigenen Farbstoff -> Identifikation möglich
Detektor misst die Fluoreszenz -> gibt Elektropherogramm wider -> Sequenz der Basen der sequenzierungen DNA-Strangs ist ablesbar
Wenn Elektropherogramm unsicher ist, welche Base -> gibt “N” aus
Wann wendet man eine „nested PCR“ an und was ist ihr Vorteil?
im Gegensatz zu herkömmlicher PCR -> gesteigerte Sensitivität und Spezifität
ist eine verschachtelte PCR
-> zwei PCR Reaktionen werden hintereinander geschaltet
zweites Primerpaar benötigt, das an Sequenzbereich der ersten Matrize bindet
das Produkt der ersten PCR ist die Matrize für die 2. PCR, deswegen auch sensitiver & spezifischer
-> wird verwendet wenn die Spezifität der gewünschten Zielsequenz gesteigert werden soll, z. B. für Diagnostik
Welche Aussage ist richtig? Die Restriktionsenzyme ...
schneiden die DNA an hochspezifischen Erkennungssequenzen
hängen Methylgruppen an spezifische DNA-Sequenzen
Wenn unterschiedlich lange DNA-Fragmente in einem Agarosegel in ein elektrisches Feld gebracht werden,...
wandern die kleineren Fragmente schneller zum positiv gelandenen Pol
Bestimmen Sie anhand der folgenden Liste die Reihenfolge der Schritte, um ein Stück Fremd-DNA in einen Plasmidvektor zu klonieren:
Zerschneiden des Vektors und der Fremd-DNA mit EcoRI, was das Antibiotikaresistenzgen inaktiviert.
Ligation der geschnittenen Vektor-DNA mit der Fremd-DNA.
Transformation von kompetenten Zellen
Selektion auf die fehlende Antibiotikaresistenz
Welches Merkmal eines Vektors ist für die Klonierung von Genen nicht wünschenswert?
Mehrere Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym, was verwendet werden soll
Ergänzen sie den Satz: RNA Interferenz hemmt...
die Translation
Als Folge der RNAi wird die mRNA in mehrere Bruchstücke gespalten
die zu übertragende Information wird zerstört oder eine Translation in ein Protein verhindert
Komplementäre DNA (cDNA)...
wird aus RNA synthetisiert
wird durch eine Reverse Transkription hergestellt
Sie haben das Plasmid pBR322. Dieses Plasmid trägt ein Resistenzgen für Tetrazyklin. Mit dem Restriktionsenzym BamHI können Sie das Tetrazyklingen durchschneiden um an dieser Stelle ein Fremd- Gen zu inserieren. Danach führen Sie das rekombinante Plasmid in einen E.coli Stamm ein der AmpS und TetS ist. Wie unterscheiden Sie nun die E.coli-Zellen, die ein rekombinantes Plasmid tragen von E.coli die nur das nicht-recombinate Plasmid tragen von E.coli der kein Plasmid aufgenommen hat?
rekombinant -> Tet s, Amp r
Aussat auf: Amp -> Wachstum
nicht rekombinant -> Tet r, amp r
Aussat auf: Tet und Amp -> Wachstum
kein -> tet s, amp s
Aussat auf: Agar mit Tet und Amp -> kein Wachstum
Was sind YAC-Vektoren und wozu werden sie verwendet?
Ein YAC (Yeast Artificial Chromosome) ist ein künstliches Chromosom, welches der Hefe nachempfunden ist
Es dient als Vektor und erlaubt im Gegensatz zu den Cosmiden eine Klonierung von größeren Genomabschnitten
Sind in Cosmiden Gensequenzen aus Lambda-DNA enthalten?
Ja
Cosmide -> Plasmide, die cos-sites enthalten
-> cos-sites = DNA Sequenzen aus lamda Phagen
Für die Hybridisierung von Primer und DNA benötigen Sie die Annealingtemperatur. Diese errechnen Sie anhand der Primersequenz.
a) Was geschieht, wenn die Annealingtemperatur zu niedrig ist?
b) Was geschieht, wenn die Annealingtemperatur zu hoch ist?
c) Was passiert, wenn der Primer zu lang ist?
d) Was passiert, wenn der Primer zu kurz ist?
-> Temperatur: max. Temp. bei welcher sich die Polynukleotidsequenz noch an den komplementären DNA-Strang bindet
gewählte Annealing-Temperatur ist während einer PCR entscheidend für die Spezifität der Bindung an die Zielsequenz
Eine maximale Übereinstimmung der Basenpaarungen hat eine maximale Bindungsstärke zur Folge und somit auch eine optimale Spezifität.
a) Bei einer zu niedrigen Temperatur kann es zu „lockeren“ unspezifischen Bindungen der Primer kommen und in der Folge unter Umständen zu unerwünschten Produkten
Basenpaarungen stimmen nicht immer überein -> lockere Bindungen
b) Bei zu hohen Temperaturen entsteht kein Produkt
Erhöht man die Temperatur, so kommt es zum Aufschmelzen der Basenpaarungen/Verbindungen, da ihre Bindungsenergie nicht groß genug ist
Als Regel lässt sich formulieren „Je höher die Temperatur, desto spezifischer das Annealing an die Zielsequenz“
optimale Primerlänger = 16-18 Nukleotide, max. 24 -> Temp. abhängig von Primerwahl
c) zu kurzer Primer -> zu geringe Spezifität des PCR-Produkts
führt zu einer zu geringen Annealing Temperatur
d) zu langer Primer -> kein Produkt, zu hohe °C Temp.
führt zu einer zu hohen Annealing Temperatur
Wie hoch ist die Fehlerrate der Taq-Polymerase?
1000bp/min Elongatiionsgeschwindigkeit -> arbeitet ungenau
aufgrund fehlender proof-reading Aktivität -> hohe Fehlerquote
Bessere Polymerase: Pfu-Polymerase
nur 500 bp/min
dafür aber proof-reading-Aktivität (3’-5’-Exonukleaseaktivität)
Was unterscheidet die Klenow-Polymerase von den anderen Polymerasen und wo findet sie Verwendung?
Polymerase I aus E. coli -> auch Klenow -> Temperaturoptimum bei 37 °C
-> andere Polymerasen, z. B. bei Taq, bei 72°C -> bei PCRs oft hohe Temperaturen verwendet
deswegen Klenow -> verwendet bei z. B. Sequenzier PCR und in vitro Transkriptionen u. Ä.
Sie wollen eine quantitative Real-Time PCR durchführen und müssen sich zwischen der Detektion durch SYBR-Green I oder Hybridisierungssonden entscheiden.
Wo liegt der Unterschied beider Systeme?
SYBR-Green I -> bindet an kleine Furche der dsDNA und interkaliert zwischen den Basenpaaren
qt-RT-PCR wird mit unmarkierten genspezifischen Primern in Anwesenheit von von SYBR Green durchgeführt
durch Reaktion von SYBR mit nicht nur der Zielsequenz, sondern auch mit anderen, wie Primer-Dimeren oder anderen PCR-Produkten —> hohe Sensitivität & geringe Spezifität
Hybridisierungssonden -> spezifisch, aber wenig sensitiv
während eines PCR-Zyklus hybridisieren zwei Sonden in geringem Abstand zueinander an die komplementäre DNA ->
Fluoreszenzübertrag vom Donor auf den Akzeptor -> FRET
Akzeptor-Fluoreszenz steigt proportional mit der Konzentration komplementärer DNA
Wie kann man mittels Real-Time PCR eine Genotypisierung durchführen?
Genotypisierung mittels Schmelzpunktanalyse -> qualitative Real-Time PCR
Schmelzpunktverläufe von homo- und heterozygoten Genotypen können so identifiziert und interpretiert werden
-> Bestimmung der Spezies, Detektion genetischer Risikofaktoren, Mutationsdetektion bestimmter genetischer Erkrankungen wie z. B. Faktor V Leiden
Nennen Sie je eine Anwendungsmöglichkeit der Real-Time PCR aus der...
Hämatologie:
Lebensmittelchemie:
Grundlagenforschung:
Hämatologie: -> Faktor-V-Leiden
Lebensmittelchemie: -> Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel
Grundlagenforschung: -> Vergleich von RNA-Expressionsmustern ganzer Proteinfamilien z. B. Zytokine
Was unterscheidet die Multiplex-PCR von einer „normalen“ PCR? Normal: Multiplex
normal: viele unterschiedliche Anwendungsbereiche
Nachweis nur einer bekannten Basensequenz
Multiplex: nur in der Forensik angewendet
einzlene PCR-Verfahren nicht getrennt, sondern alle in einer PCR-Reaktion durchgeführt
-> PCR-Ansatz mit Nachweis von mehr als einem Genomabschnitt
Welche allgemeinen Methoden werden zur Proteomanalyse angewandt?
Western Blot (Einzelproteinanalyse) / Gelelektrophorese
Immunodetektion
Fluoreszenzmikroskopie
Gel-basierte Analyse
Gel-freie massenspektrometrie-basierte Methoden- gezielte massensprektrometrische Analyse
Proteinarrays / Beas-basierte Arrays
Absolute Quantifizierung using Standards
Welche Nukleinsäuren setzen Sie in die in-vitro-Transkription ein und welches Produkt erhalten Sie?
Die In-vitro-Transkription, also die DNA-abhängige Synthese von RNA-> spezifische in-vitro-Synthese von RNA-Transkripten klonierter Gene oder zellulärer DNA
man benötigt ein Gemische aus Ribonucleotiden durch Transkription der DNA-Matrize um die gewünschte mRNA zu synthetisieren
ist eine molekularbiologische Methode zur Erzeugung von RNA und zur Untersuchung von Promotoren und ihrer Aktivierung durch Transkriptionsfaktoren
Welche Komponenten geben Sie in Ihr Reaktionsgefäß, um eine Sequenzierung nach Sanger durchzuführen?
DNA/Matrize
dNTPs
ddNTPs -> radioaktiv markiert
Primer
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