Skript 2/3

• Ein Klonierungsvektor ist ein Vektor, der im Gegensatz zum Expressionsvektor nur zur Klonierung verwendet wird.

• besitzen einen Replikationsursprung für die Replikation der DNA

• eine Sequenz zur Selektion des Expressionsvektors (z. B. eine Antibiotikumresistenz oder eine Auxotrophie)

• einen Polylinker, in die eine zu klonierende DNA-Sequenz (das Insert) eingefügt wird

• Meistens werden Klonierungsvektoren in Form eines Plasmids verwendet

• Klonierungsvektoren werden verwendet, um die DNA des Inserts in Bakterien zu vermehren oder um die Restriktionsschnittstellen des Inserts über den Polylinker zu ändern

• für das Polyacrylamid

• TEMED = Katalysator der radikalischen Polymerisation

  • Polyacrylamidgel —> radikalische Polymerisation in einer Form erzeugt, die aus zwei abgedichteten Glasplatten mit Abstandshaltern zwischen den Glasplatten besteht

• 
  

• zum Auftrennen von DNA Fragmenten nach Länge

• die DNA der Länge nach aufteilen

• Zum Auftrennen von Proteinen nach Größe

• durch SDS —> Proteine negative Ladung

  • SDS = Natriumdodecylsulfat

    • anionisches Tensid (Detergens)

  • DTT und Beta-Mercatoethanol reduzieren die Disulfidbrücken im Protein

  • Polyacrylamid und Bisacrylamid bilden eine Netzstruktur im Gel aus

  • die positiven Ladungen sind zudem im basischen pH-Wert-Bereich eines Trenngels nach Laemmli stark verringert

  • Die negativen Ladungen des SDS führen zu einer gegenseitigen Abstoßung, was zusammen mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der zuvor gefalteten Proteine führt

  • Dies erlaubt eine Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zur Molekülmasse, denn die längeren Proteine werden im Gel stärker zurückgehalten als kürzere Proteine.

  • laufen zum Pluspol

• SDS-PAGE wird zur Analyse von Proteinen verwendet

  • SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese

• Trennmedium —> diskontinuierliches Gel auf Polyacrylamidbasis

• 
  

• Probenpuffer und somit SDS im Überschuss zu den Proteinen hinzugegeben

• Probenvergleich vor der uftragung

  • überall wird gleich c benötigt wenn z. B. Exprimierung gecheckt werden soll

• Probe anschließend für fünf Minuten auf 95 °C erhitzt, um Sekundär- und Tertiärstrukturen durch das Unterbrechen von Wasserstoffbrücken und das Strecken der Moleküle aufzubrechen

• Optional können Disulfidbrücken durch Reduktion gespalten werden

  • Dazu werden reduzierende Thiole wie β-Mer- captoethanol (β-ME, 5 % Volumenanteil), Dithiothreitol (DTT, 10 Millimolar) dem Probenpuffer zugesetzt

  
  

• Polyacrylamidgel —> radikalische Polymerisation in einer Form erzeugt, die aus zwei abgedichteten Glasplatten mit Abstandshaltern zwischen den Glasplatten besteht

  • Die Abstandshalter besitzen eine Dicke von 0,75 mm oder 1,5 mm, welche die Ladekapazität des Gels bestimmt

• Erst Sammelgel, dann Trenngel

• Die Platten —> das Gießen der Gellösung in einen Ständer eingespannt, der die sonst offene Unterseite der Glasplatten mit den beiden Abstandshaltern vorübergehend abdichtet

• Für die Gellösung werden Acrylamid als Gelbildner (meistens 4 % V/V im Sammelgel und 10–12 % im Trenngel), Methylenbisacrylamid als Quervernetzer, Gelpuffer sowie Wasser und SDS gemischt

• Durch Zugabe des Katalysators TEMED und des Radikalstarters Ammoniumpersulfat (APS) wird die Polymerisation begonnen

• Lösung—> blasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen

• Probenkamm kann nach der Polymerisation herausgezogen werden, so dass die Probentaschen entstehen

• Jede Probe/Standard wird in eine Tasche im Gel pipettiert

• Der Standard besteht aus Proteinen von bekannter Größe und ermöglicht dadurch die Abschätzung der Größe der Proteine in den eigentlichen Proben, die parallel in unterschiedlichen Spuren des Gels wandern

• Southern Blot —> DNA

• Northern Blot —> RNA

• Western Blot —> Protein

• Je nach zu trennender Proteingröße verschiedene Netzgröße aus Polyacrylamid und Bisarcylamid im Gel möglich

  • erst Sammel-, dann Trenngel

  • Acrylamid giftig, Polyacrylamid nicht

• denaturierten Proben auf ein Gel aus Polyacrylamid geladen, das in einen Elektrophoresepuffer mit geeigneten Elektrolyten eingelegt ist

• Dann elektrische Spannung (meist um die 100 Volt, 10–20 V pro cm Gellänge) angelegt, die eine Migration der negativ geladenen Moleküle durch das Gel in Richtung der Anode (Plus-Pol) bewirkt

• Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb

  • Kleine Proteine wandern relativ leicht durch die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden und dadurch langsamer durch das Gel wandern

• je nach verwendeter Spannung und Länge des Gels —> zwischen einer dreiviertel Stunde und mehreren Stunden

• Die am schnellsten wandernden Proteine (mit einer Molmasse von unter 5 KDa) bilden mit den ebenfalls durch das Gel wandernden anionischen Bestandteilen des Elektrophorese- puffers die Laufmittelfron

• Der Bereich der Laufmittelfront wird durch den Zusatz von Bromphenolblau zum Probenpuffer sichtbar gemacht

• Aufgrund der relativ geringen Molekülgröße des Bromphenolblaus wandert es schneller als Proteine

• Durch die optische Kontrolle anhand der wandernden farbigen Bande kann die Elektrophorese beendet werden, bevor der Farbstoff und somit auch die Proben das Gel vollständig durchwandert haben und es wieder verlassen

-> Elektroblot, Immundetektion

• Blocken der unspezifischen Stellen mit Milch/TBST

• Ponceaufärbung -> Kontrolle, ob alle Lanes geblottet sind

• Ponceau färbt alle Proteine

  • Färbung reversibel, mit PBS abwaschbar, anschließend Immunochemische Färnung

• 
  

1. Immundetektion —> Deswegen “Immunblotting”

   1. Elektrophorese

   2. Transfer

      1. + Kontrolle it Ponceaublau -> ob alle Lanes geblottet sind

   3. Blockingpuffer

   4. erster AK

   5. Waschen

   6. Zweiter AK

   7. Waschen

   8. Detektion

• ELISA-Test basiert auf einer enzymatischen Umsetzung eines Substrates und des Nachweises des Produktes über eine Farbveränderung

• Mit diesem Test können unterschiedliche Stoffe wie z.B. Toxine, Antigene, Viren usw. selektiv nachgewiesen werden

• Antikörper oder das Antigen werden vor der Reaktion mit einem Enzym markiert (Enzymtracer)

• Kommt es zu einer enzymatischen Umsetzung, wird dieser Vorgang z.B. mittels eines Farbumschlages der Lösung sichtbar und messbar gemacht

• Nach dem Abstoppen der Reaktion wird dann die Absorption bzw. die Signalstärke der Lösung gemessen

• Diese sind proportional zur Konzentration des spezifischen Stoffes

• Mitgeführte Standards lassen eine quantitative Aussagen zu

• Membran —> hohe Proteinaffinität

• Target Protein —> hier bindet der 1. AK

• erster AK —-> Bindet mit spezifischem Teil an das target Protein

• enzyme-linked 2. AK —> am 2. AK, der an den 1. AK (Fc-Teil) bindet, ist ein Enzym gekoppelt

• Enzym Substrat —> wird in einer Farbreaktion umgesetzt -> Nachweis des Proteins

• Radioaktive Erkennung

  • früher -> AK für Western Blot radioaktiv merkiert

  • -> nicht mehr populär, wg. Strahlengefahr

• Enzymatische Erkennung -> mit Enzymen konjugierte sekundäre Antikörper, Detektion —> Zugabe von Substrat

  • kolorimetrisch

    • an den 2. AK gebundene Enzym löst eine Reaktion mit einem Substrat aus —> gefärbter Niederschlag

    • HRP -> kosteneffektiv, bei Licht -> lässt nach, unspezifische Färbungen können verursacht werden

    • AP -> erzeugt stabiles Substrat, verblasst nicht, versch. Substrate können verwendet werden, um verschiedene Farben auf einer Membran zu erzeugen

  • chemilumineszenz

    • an den sekundären AK gebundene Enzym löst eunbe Reaktion mit einem Luminiszenzsubstrat aus, das als Nebenprodukt Licht erzeugt

    • HRP + AP als Substrat

    • empfindlichste Methode, Detektion -> muss schnell erfolgen, solange die enzymatische Reaktion auf der Membran noch stabil ist

• Erkennung mittels Fluoreszenz

• direkter ELISA

• indirekter ELISA

• Sandwich ELISA

  • —> viel Farbe = viel Antigen

• kompetitiver ELISA

  • Viel Farbe = wenig Antigen, mehr Antigen = mehr Inhibitor Antigen = weniger Substratumsätze

• Alle quantitativen ELISA-Systeme werden mit Standards kalibriert

• Daher werden die Proben mit unbekannten Konzentrationen sowie eine Reihe von Standards mit bekannten Konzentrationen parallel auf einer Platte analysiert

• Das Ergebnis ist eine Kalibrationskurve (mit der zugehörigen mathematischen Formel), die aus den gemessenen OD-Werten und den Konzentrationen der

  Standards aufgebaut is

• Auf dieser Basis kann die Konzentration des Analyten in der Probe berechnet werden

• Y-Achse = Absorption, X-Achse = Konzentration

  
  

• Immunoassay Label ->meist AP, HRP oder radioaktive Isotope

• Störung durch Kreuzreaktion -> oft bei kompetitiven Assays oder Western Blot

• Störung durch unspezifische Bindungen -> durch Inhaltsstoffe -> Bindungspartner unbekannt

• kompetitiver ELISA

  • wenig Analyt -> fast alle Paratope von markiertem Kompetitor besetzt -> starke Farbreaktion

  • viel Analyt -> schwache Farbreaktion

  • —> Farbintensität verhält sich genau umgekehrt

• Weitere Störungen möglich durch

  • Matrixeffekte

  • durch MAAA (?)

  • durch heterophile AK z. B. Rheumafaktoren

  • der Hook Effekt

• Als High-Dose-Hook-Effekt wird im Rahmen serologischer Methoden ein Phänomen beschrieben, welches bei Vorliegen sehr hoher Konzentrationen eines nachzuweisenden Stoffes (Analyt), zu falsch-niedrigen oder sogar falsch-negativen Untersuchungsergebnissen führen kann

• Zum Nachweis von Krankheitserregern, Antigenen oder auch Antikörpern werden häufig sogenannte Immunassays und Lateral-Flow-Tests eingesetzt

  • Diese basieren auf dem Sandwich-Prinzip, wobei die gesuchte Substanz von zwei Antikörpern gebunden und wie bei einem Sandwich in der Mitte „eingeklemmt“ wir

  • Diese Reaktion kann beispielsweise mittels eines Farbprodukts sichtbar gemacht werden, wenn einer der beiden Antikörper als Immunkonjugat vorliegt (also entsprechend präpariert ist

• AK Überschuss + AG Überschuss -> jedes AG wird von AK erfasst

• AK reichen nicht aus, um jedes AG aufzunehmen —> Hook-Effekt —> deshalb muss man verdünnen

  • wenn AG bei dem Pat. zu hoch ist -> kann AK die AG nicht alle erfassen -> führt zu falsch niedrigen Ergebnissen

  • 
    

• Fibrose - nicht schlimm

• Zirrhose —> schlimmer

• Tumor —> ganz schlimm

• Initiation:

  • ruhender Lipozyt

    • + Kupffer-Zellen Faktoren

    • + Hepatozyten Faktoren

    • -> bildet Zytokinrezeptoren, Typ IV Kollegenase, Smooth-Muscle-alpha-Actin

• Perpetuation

  • aktivierte Lipozyten

    • + Proliferative Zytokine z. B. PGDF

    • +Fibrogenic Zytokine z. B. TGF beta1 (Enzym, das an Rezeptoren andocken kann)

  • -> Autokrine Zytokine -> Proliferation

  • -> Narbenbildung (Fibrogenesis)

  • Mateix induzierte Activation

• hepatische Sternzellen -> Myofibroblasten

• Kupferzellen -> Lebermakrophagen

• Hepatozyten

• KC, SEC, PIT cells

• Zentrifugation mit Gegenstromprinzip

• Zentrifugal Kraft -> bleibt gleich

• Gegenstrom -> nimmt immer zu, Sedimentation findet statt -> Partikeltrennung

• wenn Gegenstrom sinkt = kleine Partikel werden elutriert

  • wenn Gegenstrom stiegt = mittlere Partikel werden elutriert

  • wenn Gegenstrom hoch ist = große Partikel werden elutriert

1. Die im Medium suspendierte Probe gelangt in die Kammer

2. Sedimentationstendenz der Partikel durch Gegenstrom ausgeglichen

3. Strömung erhöht langsam sedimentierende Partikel, die aus der Kammer ausgeschleust werden

• Alles muss steril sein

  • Ozonieren/sonografieren/alkohol -> Sterilisieren

• Stroboskop Lampe -> sieht den Effekt bessser, wie die Zellen durchlaufen

• Nachteile

  • schwierig zu gewinnen

  • schwierig zu propagieren/vermehren

    • teilen sich nicht lange

    • verändern sich physiologisch bei der Vermehrung

  • oft komplexe Kultivierungsansprüche

  • schwer zu transfizieren (-> Einbringen von genetischem Material)

• Vorteile

  • viele physiologische Vorgänge lassen sich nur in primären Zellen beobachten

• Nachteile

  • stabile Zelllinien sind oft verändert und entsprechen nicht mehr ihrem physiologischen Ursprung

• Vorteile

  • leicht verfügbar

  • leicht zu vermehren

  • leicht zu kultivieren -> sind anspruchslos

  • leicht zu manipulieren/transfizieren

  
  

• Ca2+-DNA Präzipitat

• Elektroporation

• Gun-Shot

• lentvirale/Adenovirale Vektoren

• Lipofektion

  
  

1. Kanulieren der Pfortader

2. Pronase & Collagenase

3. evtl. Nachverdau (bei KC, EC)

4. Nycodenz Gradientenzentrifugation

5. evtl. Elutration (bei KC, EC)

6. Aussaat

• mehrere primäre Zellen in Kammern halten

• z. T. Simulation des Organs

• Zellen können untereinander kommunizieren

1. Beim Einführen der DNA in Embryostammzellen integriert sich diese meist an zufälliger Position in das Genom

   1. Transfektion

2. Wenn sie aber eine ähnliche Struktur, wie ein bereits existierender Teil der DNA hat, wird diese vom Genom „erkannt“ und es kommt zur homologen Rekombination, wobei nur eine Einzelkopie der DNA an einer bestimmten Position in das Genom aufgenommen wird

3. Diese Embryozellen müssen dann wachsen, werden in einen Wirtsembryo injiziert und somit Teil der Maus, die aus diesem Embryo entsteht

4. Die Maus, die aus diesem Wirtsembryo entsteht, wird als Chimäre bezeichnet und entwickelt sich aus den Embryozellen zweier verschiedener Mäuse

5. Einige der Spermien, die diese Chimäre produzieren, sind transgen – sie enthalten also die fremde DNA. Wenn diese Spermien eine normale Eizelle befruchten, wird die sich daraus entwickelnde Maus vollständig transgen sein, die fremde DNA wird also in allen Zellen vorhanden sein.

1. Plasmid mit Zielgen -> Geninaktivierung durch Einfügen eines Reportergens

2. Plasmid in Mausstammzelle transfiziert

3. Zielgen im Plasmid -> lagert sich zusammen mit chromosomalen Mausgen

4. Rekombination

   1. Teile der DNA oder RNA neu angeordnet werden, so dass eine veränderte genetische Information entsteht

5. Plasmid geht bei Zellteilung verloren

6. Einführung Stammzelle -> in Mausembryo

7. Phänotypbetrachtung

—> mittels einer genetischen Manipulation (Gene-Targeting) gezielt ein oder mehrere Gene deaktiviert wurden (Gen-Knockout). Diese Manipulation geschieht an den embryonalen Stammzellen (von Mäusen), die dann in die Keimbahn einer Maus eingebracht werden

• Einfluss von TFG-ß und Dexamethason auf PAl-1 und die CTGF Expression auf die Sekretion in primären Hepatozyten

• Primärzellen sind unter verschi. Bedinungen inkubiert worden, danach Western Blotting -> Proteinnachweis

• WB zeigt, dass Dexamethason TGF Expression verstärkt

• Abhängigkeit der Reibungskraft sphrärischer Körper

  • von ihrem Radius

  • der Viskosität des Fluids, in dem sich das Partikel befindet

  • der Geschwindigkeit des Partikels

• —> Sedimentationsgeschwindigkeit eines Partikels kann berechnet werden

• Transgene Maus

  • exprimiert typischerweise eine oder mehrere Kopien eines Gens (cDNA), das nach dem Zufallsprinzip in sein Genom integriert wird

• Knockout Maus

  • Maus, bei der beide Allele eines Gens durch homologe Rekombination gezielt gelöscht werden