Vorlesung 5

Abkratzden des Kieselgels vom Trägermaterial

Elution der GSL aus dem abgekratzten Kieselgel

effizienteste Methode, um GSL für analytische Zwecke rein darzustellen

oberen und unteren Banden können sauber voneinander getrennt isoliert werden

durch mehrmalige Chromatographie einer GSL in einem Laufmittel niedrigerer Polarität kann verbesserte Trennung der Einzelkomponenten voneinander erzielt werden

durch Änderung der Zusammensetzung des Laufmittels zwischen den Chromatographien (z.B. schrittweise Erhöhung der Polarität) kann Gradientenchromatographie auf der DC-Platte erzielt werden

erfolgt alles automatisch in dem Gerät, so können beliebig viele Chromatographien hintereinander durchgeführt werden

weniger polares Laufmittel besteht aus Chloroform/Methanol/Wasser (120/85/14) + 2mM CaCl2 anstelle der Standardkonzentration für Ganglioside (120/85/20) + 2mM CaCl2

Erniedrigung der Polarität durch Verringerung des Wasseranteils erreicht

Trennverbesserung erheblich, erleichtert die präparative DC von eng beieinander separierenden GSL

Trennverbesserung betrifft besonders Glykananteil, also hydrophilen Part der GSL

Trennung der jeweiligen Fettsäuren (obere und untere Bande) keine relevante Trennverbesserung

in Eluat aus abgekratztem Kieselgel die Struktur eines GSL mittels MS ermittelt

funktioniert sehr gut für die immunchemisch mittels TLC overlay assay detektierten GSL

zwei Strategien:

• Strategie1, wie man GSL aus Kieselgelextrakten massenspektrometrisch analysieren kann

• Strategie2, GSL direkt auf der Platte mittels MS strukturell charakterisiert

Kieselgel von immunpositiver Einzel- oder Doppelbande abgekratzt

GSL beispielsweise mit Solvent A, bestehend aus Chloroform/Methanol/Wasser (30/60/8) aus Kieselgel extrahiert

dazu muss erst Kunststoff (Plexigum) entfernt werden -> dreimaliges Eintauchen der DC-Platte in Chloroform, äußerst hydrophobe Plexigum entfernt, in reinem Chloroform unlöslichen GSL bleiben im Gel enthalten

Primärextrakt zusammen mit aufgeschlämmten Kieselgel mit Ultraschall behandelt, dann zentrifugiert

Übestand, der GSL enthält, wird abgenommen, 2x wiederholt

Lösungsmittel der vereinigten Überstände unter Stickstoffstrom abgezogen, Rückstand in Methanol wieder aufgenommen, kann ohne weitere Aufreinigung für MS verwendet werden

Mirkogramm-Mengen an GSL für diese Prozedur ausreichend

wird als IR-MALDI-TOF MS bezeichnet

kein Extraktionsschritt erforderlich

langwelliger IR-Laser verwendet

auch hier zuvor Plexigum entfernt werden, wie bei Strategie1 durch dreimaliges Eintauchen in Chloroform erreicht

Nanogramm-Mengen an GSL ausreichend

in Lipidrohextrakten lassen sich GSL nur schwer nachweisen, da nur Minorität der zellulären Lipide (ca. 5%)

Phospholipide dominieren und “überdecken” die GSL bei DC und ionisieren sehr gut -> verschlechtern die MS

-> Lipidrohextrakte vor DC oder MS-Analyse mit Phospholipase C (PLC) behandeln

PLC spaltet die hydrophile PL-Kopfgruppe einschließlich der Phophatgruppe, eliminiert insbesondere das in menschlichen und tierischen Plasmamembranen dominante und gut zu ionisierendes Phosphatidylcholin

Endotoxine: bakterielle Lipisaccharide (LPS), die wesentlicher Bestandteil der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien sind, bekannte Aislöser von Fieber bei bakteriellen Infektionen

Exotoxine: Proteine, die von Bakterien freigesetzt werden

Adhäsin: von einem Bakterium produzierter Faktor, mit dem ein Erreger an Zellen des Wirts anheften kann

Choleratoxin (CT) aus Vibrio cholerae, Rezeptor: Gangliosid GM1 (II3Neu5Ac-Gg4Cer)

Shiga Toxin (Stx) aus Stx-produzierenden Escherichia coli (STEC), Rezeptor: Globotriaosylceramid (Gb3Cer/CD77)

verursachen schwere und akute Diarrhöen, sowie lebensbedrohliche hämolytisch-urämische Syndrom (HUS)

weltweit jählich für mehr als 1 Mio Todesfälle verantwortlich