(a) Welchem Bereich der Biotechnologie wird die Herstellung von Enzymen zugeordnet, die Waschmitteln zugesetzt werden?
(b) Wovon leitet sich die Bezeichnung blaue Biotechnologie ab?
a) Herstellung von Enzymen zugeordnet, die Waschmitteln zugesetzt werden kommen aus dem Bereich der Waschmittelindustrie und damit der weißen Biotechnologie (Industrie)
b) Als Aquatische Biotechnologie, auch Blaue Biotechnologie, wird die Anwendung der Methoden der Biotechnologie auf Lebewesen aus dem Meer bzw. grundsätzlich wasserlebende Organismen bezeichnet. (blau-Meer, Wasser)
(a) Was ist der grundlegende Unterschied zwischen Naturstoffen und rekombinanten biopharmazeutischen Produkten?
(b) Zu welcher Gruppe von Naturstoffen gehört Cephalosporin?
a) Naturstoffe- Substanzen, die über verschiedene Stoffwechselwege natürlicherweise von Organismen hergestellt werden.
rekombinante biopharmazeutische Produkte- gentechnisch hergestellte Arzneimittel, nicht in Natur vorkommend, künstlich erzeugte Genkombi mit Wirkstoff.
b) zu Antibiotika
(a) Wie bezeichnet man die Klasse von Impfstoffen, die vermehrungsfähige (aktive), aber abgeschwächte (attenuierte) Krankheitserreger enthalten?
(b) Zu welcher Gruppe von Impfstoffen gehört der Tetanus-Impfstoff?
a) Lebendimpfstoffe
b) Totimpfstoffe-> Toxoidimpfstoffe: enthalten inaktivierte Exotoxine
Eine kodierende DNA-Sequenz hat eine Länge von 615 Basenpaaren inkl. Start- und Stop-Codon.
(a) Welche Länge hat die kodierende Sequenz in der resultierenden mRNA?
(b) Durch welchen Schritt der Proteinbiosynthese wird auf Basis der mRNA ein Protein generiert?
(c) Aus wie vielen Aminosäuren besteht das resultierende Protein?
a) kodierende Sequenz in mRNA hat 615 Basenpaare, da Start- & Stopcodon nicht abgezogen werden, Teil der Sequenz sind.
b) Translation
c) 1 Aminosäure = 3 Triplet -> 615/3= 205 - Stopcodon( keine Aminosäure, da keine tRNA)
Startcodon wird zur Aminosäure!
Antwort: 202 Aminosäuren
(a) Was versteht man unter der Glykosylierung eines Proteins?
(b) Was unterscheidet die Primär- und Sekundärstruktur eines Proteins?
a) Glykosylierung beschreibt eine Gruppe von enzymatischen und chemischen Reaktionen, bei denen Saccharide an Proteine, Lipide oder andere Aglykone gebunden werden. Das so entstandene Reaktionsprodukt wird als Glykosid, im Falle von Proteinen als Peptidoglycan bezeichnet.
b)
Primärstruktur- exakte lineare Reihenfolge von Aminosäuren (Sequenz) ->Pro-Protein
Sekundärstruktur- durch Ausbildung von H-Brücken faltet sich lineare Aminosäurekette zu
alpha-Helix ->rechtsgängig ->Faserproteine
beta-Faltblatt ->längst nebeneinander ->Antikörper
In der Abbildung ist ein typisches E.-coli-Expressionsplasmid dargestellt.
Quelle: Bechthold A. (2013) Pharmazeutische Biotechnologie, S. 77, 1. Auflage, Wiss. Verlagsges., Stuttgart
(a) Welcher Abschnitt des Plasmids ist für die Bindung der RNA-Polymerase wichtig?
(b) Wozu dient der Abschnitt T?
(c) Wofür ist der Abschnitt „rbs“ wichtig?
a) RNA-Polymerase bindet am Promotor = Basensequenz aus Thymin und Adenin, so genannte TATA-Box, die als Startpunkt für die Transkription dient.
b) bezeichnet Termination/Ender der Transkription -> UAA = Stop-Codon
UAG
UGA
c) rbs = ribosomale Bindungsstelle, Startstelle für die Transkription-> AUG- Start- Codon
ermöglicht Proteinbiosynthese
Was versteht man unter einem dominanten Marker(gen)?
Markergen- Selektionsmarker, dient um Zellen zu identifizieren, die neue Gene aufgenommen haben und zu prüfen, ob Transformation erfolgreich war.
Dominante Marker- vermittelt Resistenz gegen eine Substanz im Medium-> nur Zellen mit Marker überleben.
(a) Welche Form der Expression wird bei der Entwicklung von Säugerzelllinien angestrebt und was zeichnet diese aus?
(b) Bei der Generierung von Zelllinien kommen häufig Reportergene zum Einsatz. Wozu dienen Reportergene?
(c) Säugetierzellen als Produzenten von biopharmazeutischen Produkten bringen Herausforderungen mit sich. Nennen Sie zwei Herausforderungen, die bei der Auslegung der Fermentationsbedingungen berücksichtigt werden müssen.
a) eukaryotische Genexpession- stabile Expression = Intergation des Fremd-Gens ins Genom vom Wirt-> dauerhafte Expression.
b) Ein Reportergen ist ein Gen, mit dessen Hilfe die Expression anderer Gene verfolgt werden kann.
c) Herausforderungen:
• Hohe Scherempfindlichkeit
• Hohe Ansprüche an Medienzusammensetzung
• Langsames Zellwachstum
• Kontaminationsgefahr durch virale Humanpathogene ->Hohe Produktionskosten
Welchen Vorteil bietet ein definiertes/synthetisches Nährmedium gegenüber einem komplexen/technischen Nährmedium aus GMP-Sicht?
Vorteil: exakt bekannte Zusammensetzung
Nährmedienarten
• Definiertes, synthetisches Medium: exakte bekannte Zusammensetzung
• Komplexes, technisches Medium: Zusatzstoffe enthalten (z. B. Pepton, Hefeextrakt), deren genaue chemische Zusammensetzung undefiniert ist
Ergänzen Sie in der nachfolgenden Tabelle die Angaben zu einer einzelzellig wachsenden bakteriellen Kultur.
Spezifische Wachstumsrate µ
Wachstumsphase
µ < 0
Absterbephase
µ = µ max
Logarithmische Phase
µ = 0
Stationäre Phase
Bioreaktoren
(a) Wie hängt die Reynoldszahl von der Rührerdrehzahl ab?
(b) Weshalb erfolgt die Einleitung von Luft bei Rührkesselreaktoren unterhalb der Rührorgane?
(c) Welchen Vorteil hinsichtlich Patientensicherheit bieten Single-Use-Bioreaktoren
a) direkt proportional ( je mehr,desto mehr)
je höher Drehzahl n, desto turbulenter die Strömung
je niedriger Drehzahl, desto laminarer die Strömung
b) Durchmischung durch homogene Strömung-> Blasen leichter als Medium-> steigen nach oben
c) Ausschluss von Kreuzkontamination
Kinetik
(a) Welche Einheit hat die spezifische Wachstumsrate µ?
(b) Wie hängt bei der Sättigungs-/Monod-Kinetik die Sättigungskonstante KS mit der Substratkonzentration zusammen?
(c) Welche Wachstumsrate ergibt sich auf Basis der Monod-Kinetik (siehe Formel), wenn eine sehr kleine Substratkonzentration (~ 0) vorliegt:
a) µ [h^-1]
c) µ ~ 0
Welcher Typ der Produktbildung liegt vor, wenn Backhefe hergestellt wird, die Zellen selbst also Produkt sind? Begründen Sie Ihre Auswahl. qP = Produktbildungsrate.
Typ 1: streng wachstumsgekoppelte Produktbildung
Bei der Produktion von z.B. Backhefe, also wenn Zellen selbst ein Produkt sind, handelt es sich um wachstumsgekoppelte Produktbildung-> das heißt wie dem Diagramm zu entnehmen, ist das Wachstum proportional zur Produktbildung (was bei Hefe der Fall ist).
Was gehört zur Vorbereitung eines SIP-fähigen Bioreaktors nach Beendigung des CIP-Verfahrens?
Sterilisation-in-Place (SIP)
•Vorbereitung und Kalibrierung der Sensoren zur Überwachung
• Einbau von Gasfiltern (Zuluft- und Abluft)
• Sterilisation des Bioreaktors inkl. Sicherstellung der Sterilität der Peripherie, d. h. aller Medienzu- und Ableitungssysteme, Belüftungssysteme, Messstutzen, Probenahmeventile, Filter
Prozessführung
(a) Welcher Parameter neben dem Gelöstsauerstoff und dem pH-Wert wird bei allen Fermentationen überwacht und geregelt?
(b) Wie kann der kLa-Wert bei Rührkesselreaktoren gesteigert werden? Geben Sie einen Aspekt neben der Erhöhung der Rührerdrehzahl an.
(c) Bevor es in den finalen Produktionsbioreaktor geht, ist eine Serie immer größerer Vorkulturen zur Anzucht erforderlich? Was muss dabei beachtet werden?
a) Parameter Temperatur
b) kLa-Wert steigt wenn:
Gasblasen gut dispergiert(klein) sind-> mehr Fläche-> mehr O2 Eintrag
O2 Eintrag ins Medium hoch ist-> gutes Wachstum
Gasleerrohrgeschwindigkeit UL hoch ist (Geschwindigkeit mit der Gas ins Medium geblasen wird)
c) Je nach Größe des Bioreaktors ist eine Serie immer größerer Vorkulturen (Anzuchtfermenter) erforderlich, wobei die Zellen ununterbrochen in der exponentiellen Wachstumsphase bleiben sollen
(a) Wie bezeichnet man ein Fermentationsverfahren, bei dem das Medium nur zum Teil vorgelegt wird und eine Zufütterung im Laufe der Fermentation erfolgt, wobei das Reaktionsvolumen zunimmt?
(b) Welche Form der Inhibierung kann hiermit sehr gut umgangen werden?
a) Fed-Batch-Verfahren
b) Umgehen der Substrathemmung
Downstream Processing
(a) Bei einer biopharmazeutischen Produktion mit E. coli können Inclusion Bodies auftreten. Welche beiden Probleme/Konsequenzen bringen diese für das Downstream Processing mit sich?
(b) Eine Filtrationsmembran hat einen Cut-off von 1000 Dalton. Was bedeutet dies konkret?
(c) Wie bezeichnet man bei chromatographischen Verfahren das Ablösen des Produkts von der stationären Phase?
a) Inclusionbodies= Einschlusskörperchen= Proteinaggregate, die unlöslich in der Zelle vorliegen= Ansammlungen fehlerhafter/unvollständig gefalteter Proteine, die im Zytoplasma ausfällen.
Probleme/Konsequenzen für DPS:
Proteine mit inclusion bodies lassen sich zwar leicht aufreinigen, aber es ist schwer daraus aktive Proteine herzustellen.
um Proteine zu gewinnen, müssen Zellen bzw. Einschlusskörper eröffnet werden-> kompliziertes Vorgehen.
b) Trenngrenze (= Cut-Off)
Dalton-> Molekulargewicht
Filtrationsmembran 1000 Dalton [Da] = Stoffe unter Molekulargewicht von 1000 Da können Membran passieren, größere Substanzen bleiben zurück
c) Elution
(a) Welchen Zweck erfüllt eine Trocknung eines biopharmazeutischen Wirkstoffs?
(b) Zur Validierung des biopharmazeutischen Herstellprozesses gehört die exakte Ermittlung von Abreicherungs- und Inaktivierungsfaktoren für alle Schritte im Downstream Processing. Welchen Gesamtabreicherungsfaktor benötigt man, wenn eine Kontamination vor dem Downstream Processing mit einem Anteil von 10 % vorliegt und ein Zielwert von 100 ppm nach Abschluss aller Aufreinigungsschritte erreicht werden soll?
a) Zweck: Verlängerung der Stabilität durch Absenkung des aW-Wertes
b) ppm= parts per million
100 ppm 10^-6 = 10^-4
vorher: 10% = 0,1 = 10^-1
nachher: 100 ppm = 10^-4
dazwischen Faktor 10^3-> Faktor 1000 weniger
Ordnen Sie nachfolgenden biotechnologischen Produkten jeweils die passende Farbe der Bereiche der Biotechnologie zu.
Herbizidresistente Sojabohnen:
Katalase (zur Entfernung des Bleichmittels Wasserstoffperoxid aus Textilien):
Herbizidresistente Sojabohnen: grüne Biotechnologie
Katalase (zur Entfernung des Bleichmittels Wasserstoffperoxid aus Textilien): weiße Biotechnologie
(a) Unter welchem Begriff werden alle katabolen und anabolen Stoffwechselwege zusammengefasst, die für das Wachstum, die Entwicklung und die Reproduktion eines Organismus benötigt werden?
(b) Für welche Gruppe von Naturstoffen stellen Actinomyceten, darunter vor allem Streptomyceten, eine ergiebige Quelle dar?
a) Primärstoffwechsel
b) Antibiotika
Was ist das Prinzip von nukleinsäurebasierten Impstoffen?
Nukleinsäurebasierte Impfstoffe: DNA- oder RNA-basierte Vakzine, die für ein entsprechendes Proteinantigen kodieren
• Lipid-Nanopartikel (LNP) als Vehikel (mRNA) oder Elektroporation (pDNA)
• Vektorimpfstoffe: Einbringen der kodierenden Nukleinsäure mittels harmloser Vektorviren, z. B. gegen Ebola
-> DNA/RNA-Abschnitt vom Erreger wird mit Vakzine injeziert.-> gelangt ins menschliche Zelle, wird bei Proteinbiosynthese integriert-> Zellen produzieren Proteinerreger-> Immunsystem reagiert.
(a) Welcher Schritt einer Genexpression wird durch die Repression des Gens unmittelbar verhindert?
(b) Das grün fluoreszierende Protein (GFP) hat eine Länge von 238 Aminosäuren. Welche Länge in Basenpaaren hat dann das für GFP kodierende Gen?
a) Transkription
b) 238 * 3 (Triplet) = 714 Basenpaare + 3 Basenpaare(extra Stopcodon,nicht in Aminosäure!) = 717 Basenpaaren hat das kodierende Gen.
Bei der Biosynthese von Kollagen, einem wichtigen Strukturprotein v. a. unseres Bindegewebes, entsteht nach der Translation in einem Zwischenschritt aus drei sogenannten Präpro-α-Ketten das Prokollagen. Dabei wird bei jeder Präpro-α-Kette eine Signalsequenz enzymatisch abgespalten und einzelne Aminosäuren werden hydroxyliert und glykosyliert. Die drei Präpro-α-Ketten, die jeweils eine Helix-Struktur besitzen, werden schließlich über mehrere kovalente Bindungen zwischen Schwefel-Atomen jeweils zweier Cysteine verbunden.
(a) Welche Enzymart ist für die Abspaltung der Signalsequenz verantwortlich?
(b) Wie bezeichnet man die Helix-Struktur jeder Präpro-α-Kette? Primär-, Sekundär- Tertiär- oder Quartärstruktur?
(c) Mit welchem Begriff bezeichnet man die kovalente Bindung zwischen den Schwefel-Atomen zweier Cysteine?
a) Signalpeptidase
b) Sekundärstruktur
c) Disulfidbrücken
(a) Welcher Abschnitt des Plasmids ist für die spätere Bindung der mRNA ans Ribosom wichtig?
(b) Mit welchem Begriff bezeichnet man das Einbringen des Plasmids ein eine prokaryotische Zelle?
(c) Nach dem Einbringen des Plasmids mit dem Fremdgen in die Zelle kann diese als GVO bezeichnet werden. Wofür steht die Abkürzung GVO?
a) Bindung der mRNA ans Ribosom findet an Stelle rbs (Ribosomenbindestelle) statt -> Ribosom bindet dort an mRNA = AUG Start-Codon.
b) Transformation - Übertragung von Plasmid-DNA in prokaryotische Zelle
c) GVO = Gentechnisch veränderter Organismus (deren Erbanlagen wurden gezielt mittels gentechnischer Methoden verändert.
Corynebactrium glutamicum dient als wichtigster Produktionsorganismus für die biotechnologische Herstellung von Aminosäuren. Die zur Aminosäureproduktion eingesetzten Stämme werden vor dem Einsatz in der Produktion einem gerichteten Stammoptimierungsverfahren unterzogen. Was ist darunter zu verstehen?
gerichteter Stammoptimierungsverfahren= wird mittels gentechnischer Manipulation erzeugt-> z.B Genregulation/ Regulation v. Stoffwechselwegen durch Änderung v. genetischen Material vom Organismus (Integration von spez. Gen/ Vektor/ Plasmid…)
(a) Nennen Sie zwei Nachteile, die E. coli als Produktionsorganismus gegenüber Bacillus subtilis bietet.
(b) Die biotechnologische Herstellung von Proteinwirkstoffen in Säugetierzellen ist im Vergleich zur Nutzung von Bakterien als Produzenten deutlich teurer. Nennen Sie zwei Gründe weshalb.
a)
Bildung von Inclusion Bodies
“Stoffwechselproblem”- Acetatbildung während der Produktion verhindert Zellwachstum-> nur gen.veränderte E.coli verwendet
b) teuerer als Bakterien, weil
hohe Ansprüche an Medien-Zusammensetzung-> spez. Stoffe + viel Aufwand
langsames Zellwachstum = spez. Bedingungen nötig
(a) Bei transgenen Pilzen als Produzenten kommen häufig prototrophe Marker zur Komplementation von auxotrophen Mutanten zum Einsatz. Was versteht man unter auxotroph?
a) Als auxotroph werden in der Mikrobiologie häufig Bakterienstämme bezeichnet, die aufgrund einer Mutation Synthesefähigkeiten verloren haben ("Mangelmutante") und sich somit vom Wildtyp unterschieden. Das Gegenteil von auxotroph ist prototroph.
(a) Was zeichnet ein komplexes/technisches Nährmedium aus?
(b) Weshalb muss ein Nährmedium das Element Schwefel enthalten?
a) Komplexes, technisches Medium: Zusatzstoffe enthalten (z. B. Pepton, Hefeextrakt), deren genaue chemische Zusammensetzung undefiniert ist
b) Schwefel ist für die Synthese von Aminosäuren, Vitamine und Coenzyme.
(a) Wie nennt sich die Wachstumsphase einer einzelzellig wachsenden Kultur, in der das Maximum der spezifischen Wachstumsrate erreicht wird?
(b) In welcher Wachstumsphase einer einzelzellig wachsenden Kultur erreicht die Zelldichte ihr Maximum / ein Plateau?
a) Maximale Wachstumsrate μmax: Wachstumsrate während der exponentiellen Phase
b) Dezelerationsphase-> max. Zelldichte
Danach nimmt das Gewicht v. Zelle ab, da zelleigene Speicherstoffe ( wegen Substratabnahme) abgebaut werden. -> Wachstum wird geringer.
(a) Nennen Sie zwei der grundlegenden Aufgaben eines Bioreaktors neben Homogenisieren und Suspendieren.
(b) Nennen Sie zwei Faktoren, von denen die Leistungsaufnahme eines Rührers in einem Rührkesselreaktor abhängt.
(c) Fotobioreaktoren kommen zur Kultivierung von Mikroalgen zum Einsatz. Weshalb ist dabei die Reaktordicke sehr gering und welches Gas wird für das Wachstum der Algen zwingend benötigt?
a) • Dispergieren
• Energie- und Stoffaustausch mit der Umgebung
• Sterilbarriere
b) Leistungsaufnahme eines Rührers
P: Leistung hängt von folgenden Faktoren ab:
Ne: Newton-Zahl
ρ: Dichte
n: Drehzahl
d: Rührerdurchmesser
c) Fotobioreaktoren
• Zur Kultivierung von Mikroalgen
• Benötigen neben Nährstoffen Licht, Kohlendioxid und Salzwasser
• Platten- oder Rohrreaktoren
Reaktordicke gering, weil Algen zum Wachstum Licht benötigen
(a) Was versteht man beim Wachstum einer Kultur unter der Verdopplungszeit tD?
(b) Ergänzen Sie im nachfolgenden Diagramm der Monod-Kinetik die Beschriftungen in den weißen Feldern.
(c) In welche Richtung würde sich die Kurve im Diagramm (siehe b) verschieben, wenn auch der Erhaltungsstoffwechsel mitberücksichtigt wird?
(d) Neben der Substratüberschussinhibierung kann bei Fermentationsprozessen, z. B. bei der alkoholischen Gärung, eine andere Form der Inhibierung auftreten. Wie nennt man diese?
a) Verdopplungszeit td: Zeit, die die Gesamtzellzahl oder Zelldichte zur Verdopplung braucht [h]
c) nach unten
d) Produktinhibierung= Produkte wirken wachstumsinhibierend, z.B Alkohole/ org.,Säuren-> µ sinkt ab.
Von Zelllinien zur biotechnologischen Wirkstoffherstellung werden Zellbanken angelegt. Geben Sie zwei Prüfungen an, die an den Zellbanken durchgeführt werden müssen.
Prüfungen bei Zellbanken auf:
Kontaminationsfreiheit (muss Virus/ MO-frei sein)
Langzeitstabilität (ob genetische Ausstattung nach Zeit gleich ist)
Auftaukontrollen (zellresistenz zu 0°)
Identität (ob Ziel Gen inTakt, Nukleotide stimmen)
(a) Wie bezeichnet man das Hinzufügen der Vorkultur in einen Bioreaktor?
(b) Welcher Parameter neben der Temperatur und dem pH-Wert wird bei aeroben Fermentationen überwacht und geregelt?
a) Inokulation = Hinzufügen der Vorkultur
b) Gelöstsauerstoff
(a) Wie läuft ein Fed-Batch-Verfahren ab?
(b) Nennen Sie einen Vorteil, den eine kontinuierliche Fermentation gegenüber einer Fed-Batch-Fermentation bieten kann.
a) Verlauf:
teilweise Befüllung vom Fermenter mit Ausgangsstoffen (Edukten)
Reaktion von Edukten zu Produkten plus Zufuhr neuer Edukte bis Fermenter voll ist.
Entleerung & DSP-> Aufreinigung etc.
b) hohe Raum-Zeit Ausbeute
Bei der biotechnologischen Proteinherstellung strebt man i. d. R. eine Sekretion des Zielproteins aus der Zelle an. Nennen Sie zwei Gründe, weshalb es von Vorteil ist, wenn der zu produzierende Stoff an das Nährmedium abgegeben wird?
kein Zellaufschluss nötig-> einfache Abtrennung
weniger Proteinfaltungsprobleme-> keine inclusion bodies
weniger Proteolyse (Abbaugefahr)
(a) Eine Abtrennung der Zellen zu Beginn des Downstream Processings erfolgt entweder durch Filtration oder Zentrifugation. Nennen Sie ein für sehr große Volumina geeignetes Zentrifugationssystem mit kontinuierlichem Austrag der abgeschiedenen Zellen.
(b) Durch eine Änderung des pH-Werts kann die Löslichkeit von Proteinen verändert und im besten Fall eine Präzipitation erreicht werden. Wie muss der pH-Wert verändert werden, damit die Proteinlöslichkeit minimal wird?
(c) Was versteht man bei chromatographischen Verfahren unter Retention?
(d) Wann muss eine Renaturierung von Proteinen erfolgen?
a) 1. Tellerseparator: Durchfluss bis 1000/h-> risiege Klärflächen Teller
durch starke Rotation werden Zellen nach außen geschleudert-> Zentrifugalkräfte
Flüssigkeit wird separat ausgetragen-> kontinuierliches Verfahren, solange Anlage läuft.
Dekanter: Zellen werden über rotierende Schraube/Schnecke nach außen geschleudert-> Austrag kontinuierlich.
b) pH-Wert muss so veränder werden, dass Zahl positiver & negativer Ladungen gleich ist-> dann ist Proteinlöslichkeit am geringsten
c) Retention = Rückhaltezeit: Zeit, die Stoff benötigt, um Trennstrecke zu durchlaufen.
d) Renaturierung von Proteinen = bei unlöslichen/missfaltenen Proteinen v.a bei inclusion bodies
Renaturierung:
Denaturierung mit Denaturierungsmittel
Verdünnung & Ausspülen des Mittels -> Austausch stabil. Puffer
Faltung des Proteins in richtige Form ( Renaturierung)-> Ausspülen
Verbinden Sie, wo zutreffend, die jeweilige Substanz jeweils mit der passenden Gruppe von Naturstoffen.
Thyroxin
Polystyrol 1) Antibiotika
Ascorbinsäure 2) Hormone
Streptomycin 3) Alkaloide (aus Arzneipflanzen)
Codein 4) Vitamine
Cephalosporin
Thyroxin - Hormon
Polystyrol - Thermoplast
Ascorbinsäure - Vitamine
Streptomycin - Antibiotika
Codein - Alkaloide (aus Arzneipflanzen)
Cephalosporin - Antibiotika
Wodurch zeichnet sich ein attenuierter Lebendimpfstoff aus?
Lebendimpfstoffe enthalten abgeschwächte (attenuierte) Viren oder Bakterien, die sich noch vermehren können und eine Immunantwort auslösen, in der Regel jedoch keine Erkrankung.
(a) Wie hängt der genetische Code mit der Proteinbiosynthese zusammen?
(b) Bei der Biosynthese von Kollagen, einem wichtigen Strukturprotein v. a. unseres Bindegewebes, wird nach der Translation in einem Zwischenschritt die sogenannte Präpro-α-Kette zum Prokollagen. Dabei wird eine Signalsequenz enzymatisch abgespalten und einzelne Aminosäuren werden hydroxyliert und glykosyliert. Mit welchem übergeordneten Fachbegriff fasst man diese Vorgänge zusammen?
a) = gibt an wie ,RNA die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert: 1 Triplett=codon=3 Basen-> 1 Aminosäure
b) posttranslationale Modifikation
(a) Welche Rolle spielt der Abschnitt „P“?
(b) Welcher Bereich des Plasmids „ergibt“ das spätere Protein?
a) P= Promotor (am 5´Ende)= Startstelle(TATA-Box) für RNA-Polymerase-> Beginn von Transkription
b) Der Bereich vom Transkriptionsstart bis zum T-> Ende.
Startcodon ist Teil, da passende tRNA bei Translation
Stoppcodon hat keine tRNA-> fällt weg
(a) Welche Form der Expression wird bei der Entwicklung von Säugerzelllinien (z. B. CHO-Zelllinie für die Produktion von MAK) angestrebt und was zeichnet diese aus?
(b) Was ist bei der Generierung einer CHO-Zelllinie unter Transfektion zu verstehen?
a) Eukaryotische Genexpression= stabile Expression: Integration des Fremd-Gens ins Genom vom Wirt-> dauerhafte Expression
b) Transfektion ist der Prozess des Einbringens von Fremd-Gen in eukaryotische Zellen.
Escherichia coli eignet sich sehr gut für Hochzelldichtefermentationen.
(a) Die Verwendung dieses Produktionsorganismus bringt aber auch Nachteile mit sich. Hauptnachteil ist die Bildung von Inclusion bodies. Was sind Inclusion Bodies und welche Probleme/Konsequenzen bringen diese für das Downstream Processing mit sich?
(b) Ein großer Vorteil von E. coli ist die kurze Generationszeit. Wo liegt diese in etwa unter idealen Wachstumsbedingungen?
b) Generationszeit= Zeit, in der MO-Population sich verdoppelt
-> unter Idealbedingungen verdoppelt sich E.coli alle 20 Minuten.
(a) Erklären Sie nachvollziehbar, wie die Selektion von transgenen Klonen mittels eines Antibiotikaresistenzgens funktioniert.
(b) Bei transgenen Pilzen als Produzenten kommen häufig prototrophe Marker zur Komplementation von auxotrophen Mutanten zum Einsatz. Was versteht man unter prototroph?
a) ->Markengen trägt Resistenz gegen Antibiotika (Selektionsgen)
-> im Milieu v. Antibiotika überleben nur Zellen mit dem Markengen, da sie eine Reistenz gegen Antibiotika haben, alle anderen Zellen sterben ab-> damit erfolgt Selektion von Zellen, die ein Markengen haben oder nicht-> Methode um erfolgreiche Integration v. Genom im Klon zu prüfen.
b) Prototroph sind Lebewesen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren selbst synthetisieren können.
(a) Welche kohlenstoffhaltigen Verbindungen sind wichtig für den Energiestoffwechsel von Mikroorganismen?
(b) Welche Rolle spielt das Element Phosphor für den Energiestoffwechsel?
a) CO2, Glucose, Saccharose
b) Phosphor ist wichtig bei ATP
-> ATP wird gespalten in ADP + P wodurch Energie frei wird
-> Phosphat wird auf and. Substanzen übertragen-> Energie frei-> P aufgenommen-> ADP wird zu ATP
Wie findet der Transfer eines Zielgens im Rahmen der Erzeugung einer transgenen Pflanze statt, wenn Agrobacterium tumefaciens zum Einsatz kommt.
Plasmid-DNA-> 2 neue Gene
1 Gen + 1 Markengen
Plasmid wird in Agrobacterium integriert (+DNA)
Pflanzenzelle wird mit Bakterium infiziert-> Plasmid gelangt ins Pflanzengenom
Pflanze bebrütet: Zellteilung (Agar)
Nur Pflanzen mit stabil integrierten Markengen überleben-> Resistenz
Pflanze wird gezüchtet.
(a) Rührkesselreaktor: Welche Rolle spielt der Durchmesser des Rührers hinsichtlich der erforderlichen Rührerleistung?
(b) Wie erfolgt die Durchmischung bei einfachen Blasensäulenreaktoren (ohne Umlauf)?
a) je größer, desto mehr Leistung(Umdrehungen/Energie) nötig, um visköser werdendes Medium zu mischen
-> höhere Drehzahl nötig.
b) Durchmischung( ohne Umlauf)= durch homogene Blasenströmung
-> Gaseintrag im unetren Bereich v. Bioreaktor
-> Gasblasen leichter als Medium-> steigen hoch
-> spez. Gasverteiler: Düsen/Rohre begünstigen Durchmischung
-> hoher Volumenstrom+ Druck
Stellen Sie für die Sättigungskinetik (Monod-Kinetik) den Zusammenhang von Substratkonzentration und spezifischer Wachstumsrate grafisch dar und zeichnen Sie den KS-Wert mit ein. Hinweis: Beschriftung der Achsen nicht vergessen.
Wachstumslimitierung aufgrund der Limitierung eines Substrats
Definieren Sie den Begriff Idiophase in Bezug auf das Wachstum von Mikroorganismen und geben Sie zudem die in dieser Phase bevorzugt gebildeten Produkte an.
Phase der statischen Kultur (mikrobielles Wachstum) von Mikroorganismen, während der bevorzugt Sekundärmetaboliten produziert werden; folgt in der Regel auf die Wachstums- oder Trophophase.
(a) Wie kann der kLa-Wert gesteigert werden? Geben Sie zwei Aspekte an.
(b) Welches pH-Optimum benötigen neutrophile Mikroorganismen für Ihr Wachstum?
a) kLa-Wert steigt wenn:
b) neutrophile= brauchen eine neutrale Umgebung zum wachsen
-> pH 6-8 (mittel)
-> Toleranz 5,5 bis 8,5 pH
[ Acidophile pH<5 (Toleranz 1 bis 5,5); Alkaphile pH 10 (Toleranz 9,5 bis 11,5)]
Welche Fermentationsart würden Sie wählen, wenn das für das Zellwachstum benötigte Substrat schon bei geringen Konzentrationen wachstumsinhibierend wirkt und das entstehende Produkt ebenso bei bereits geringen Konzentrationen toxisch für die Zellen wirkt? Begründen Sie Ihre Auswahl.
kontinuierliches Verfahren, da keine Ansammlung von toxischen Stoffen & Zugabe geringer Substratmenge ausreichend um Produkt zu erhalten.
Downstream Processing:
(a) Welche Herausforderungen ergeben sich für das Downstream Processing eines Proteinwirkstoffs? Nennen Sie zwei.
(b) Eine Filtrationsmembran hat einen Cut-off von 500 Dalton. Was bedeutet dies?
(c) Mit welchem Begriff bezeichnet man bei chromatographischen Verfahren die Verweilzeit der aufzutrennenden Substanz in der Säule?
(d) Bei welcher Chromatographieart nutzt man eine hochspezifische Wechselwirkung zwischen einem Protein und einem Liganden aus?
a) 1. Aufreinigung eines Biomoleküls als homogenes Produkt aus vielen Biomolekülen/Proteinen
hohe Anreicherungsfaktoren nötig
hohe Anforderungen an Reinheit-> Wirkstoff (Arznei)
Filtrationsmembran 500 Dalton [Da] = Stoffe unter Molekulargewicht von 500 Da können Membran passieren, größere Substanzen bleiben zurück
c) Retention
d) Affinitätschromatographie (AFC)
• Hochspezifische Wechselwirkung
Im Rahmen von Stabilitätsuntersuchungen von Proteinarzneimitteln müssen auch relevante Stressbedingungen, die sich aus dem Prozess (z. B. Abfüllung), der Lagerung o. ä. ergeben können, untersucht werden. Geben Sie zwei Parameter an, deren Einfluss untersucht werden sollte bzw. könnte.
Untersuchungen auf Umweltparameter z.b. Temperatur(Einfrieren/Auftauen), Druckbeanspruchung, Feuchtigkeit
Prüfung von Langzeitlagerung
Stabilitätsprüfungen bei Bewegungen(Transport)
Was sind Biosimilars?
Ein Arzneimittel, das einem anderen biologischen Arzneimittel, das bereits in der EU vermarktet wird (das so genannte „Referenzarzneimittel“), sehr ähnlich ist.
(b) Zu welcher Gruppe von Naturstoffen gehört Streptomycin?
(c) Protamin (bestehend aus 33 Aminosäuren), das aus Lachssperma gewonnen wird, wird u. a. als Wirkverstärker für Impfstoffe eingesetzt. Welcher Stoffgruppe ist Protamin zuzuordnen?
a) Naturstoffe= Substanzen, die über versch. Stoffwechselwege natürlicherweise v. Organismen hergestellt werden
rekombinante biopharmazeutische Produkte= gentechnisch hergestellte Arzneimittel-> nicht in natur vorkommend-> künstlich erzeugte Genkombi mit Wirkstoff
b) Streptomycin = Stretomyceten Bakterium gebildetes Antibiotikum—> Naturstoff aus Bakterium
c) nukleäre Proteine- Protamine
(a) In der Abbildung ist die postranslationale Prozessierung von Präproinsulin zu sehen. Aus welchen zwei Schritten setzt sich die Umwandlung von Präproinsulin in Proinsulin zusammen?
(b) Welche Enzymart ist für die Abspaltung des C-Peptids verantwortlich?
(c) Nennen Sie eine weitere posttranslationale Modifikation, die im abgebildeten Beispiel nicht vorkommt.
a) Prä-pro-Insulin= inaktives Prohormon, besteht aus Signalpeptid-B Kette-C Peptid-A Kette
Umwandlung:
Singbalpeptid sorgt dafür, das Prä-pro-Insulin ins Innere des ER transportiert wird-> Transport- Funktion
Im ER wird Signalpeptid enzymatisch durch Protease abgespalten
Falrung der Primärstruktur in die Sekundärstruktur durch di-sulfid-brücken
b) C-Kette wird durch Protease abgespalten-> Proinsulin-> Isulin
c) 1. Anhängen v. Molekülresten-> Glykosidierung
Faltung-> zur Quartärstruktur
Bei der Entwicklung von Hochleistungsstämmen zur Antibiotikaproduktion können klassische (ungerichtete) und gerichtete Stammoptimierungsverfahren angewandt werden. Erklären Sie den Unterschied.
Stammoptimierung
klassische= Mutagenese= Erzeugung von Mutationen im Erbgut z.B. mit UV-Stralung oder chemisch
gerichtet= gentechnische Manipulation-> Multicopy-Gene/Genregulation
(a) Wofür ist der Abschnitt „ori“ wichtig?
(b) Was muss noch an welcher Stelle in das Plasmid eingebracht werden, um die Expression eines Ziel-Proteins zu ermöglichen?
(c) Wozu dienen der N-tag bzw. der C-tag?
a) ori = origin of Replikation - Replikationsursprung : Ort an DNA-Sequenz, an dem Initiationsprotein bindet -> Ausgangspunkt für DNA- Replekation
b) Für Protein Expression wichtig:
P = Promotor (am 5`) -> Startstelle RNA- Polymerase
c) DAN-Fragment, das für N-oder C-terminalen Fusions-tag kodiert-> markiert Protein= wichtig für Aufreinigung von Proteinen. Bewirkt erhöhte Proteinlöslichkeit.
Wie unterscheiden sich stabile und transiente Expression?
Eukaryotische Genexpression
stabile Expression = Integration des Fremd-Gens ins Genom vom Wirt—> dauerhafte Expression
transiente Expression = Einbringen vom Fremd-Gen ohne Integration ins Genom —> Expression kurze Zeit
(a) Nennen Sie zwei nicht-betriebswirtschaftliche Vorteile der Gewinnung von Viren in Säugerzelllinien im Vergleich zum klassischen Verfahren über die Infektion von Hühnereiern?
(b) Bei Totimpfstoffen unterscheidet man u. a. zwischen Vollimpfstoffen und Subunitimpfstoffen. Was zeichnet Subunitimpfstoffe aus?
a) Vorteile:
kurze Herstellungsdauer, ca. 4 Monate
Impfstoff löst bessere Immunantwort aus, weil Konformation der Zuckerreste bei Säugetieren passender ist
geeignet für Patienten mit Hühner- eiweis- Allergie
besserer Umsatz!
b) Subunitimpfstoffe:
• Enthalten aufgereinigte Komponenten des Erregers, z. B. gegen InfluenzaViren
• Impfstoffe auf Basis rekombinant hergestellter Proteinantigene, z. B. gegen Hepatitis B, Papillomaviren
• Konjugatimpfstoffe: Antigen an Proteinträgermolekül gekoppelt, z. B. gegen Pneumokokken
• Virusartige Partikel: Virushülle ohne funktionale Nukleinsäuren
(a) Nennen Sie zwei Vorteile, die Bacillus subtilis als Produktionsorganismus gegenüber E. coli bietet.
(b) Säugetierzellen als Produzenten von Biopharmazeutischen Produkten bringen Herausforderungen mit sich. Nennen Sie zwei Herausforderungen, die bei der Auslegung der Fermentationsbedingungen berücksichtigt werden müssen.
a) 1. sehr hohe Ausbeute
keine inclusion bodies
b) 1. hohe Ansprüche an Medien-Zusammensetzung-> spez. Stoffe + viel Aufwand
Bei transgenen Tieren als Wirkstoffproduzenten kommen gewebespezifische Promotoren zum Einsatz. Weshalb?
gewebespezifische Promotoren(Tiere)
-> Produkt reichert sich z.B. in Milch oder Urin an, weshalb Tiere nicht getötet werden
Nährmedien enthalten häufig essentielle Aminosäuren. Was sind essentielle Aminosäuren?
Eine essentielle Aminosäure (lebensnotwendige Aminosäure) ist eine Aminosäure, die ein Organismus benötigt, aber nicht aus elementaren Bestandteilen aufbauen kann.
(a) Welchen Einfluss haben der Rührerdurchmesser und die Dichte des Nährmediums auf die Leistungsaufnahme eines Rührwerks?
(b) Weshalb ist es wichtig, dass in Rührkesselreaktoren turbulente Strömungsverhältnisse vorliegen?
(c) Nennen Sie einen regelbaren Parameter, durch dessen Erhöhung sich der Turbulenzgrad in einem Rührkesselreaktor steigert.
a) je größer das Rührwerk desto mehr Leistung zum bewegen wird benötigt
Je höher die dichte des Mediums desto stärker/ schneller muss gerührt werden für eine Turbulente Strömung
b) für eine homogene Verteilung der Nährstoffe
c) n: Drehzahl
Nennen Sie zwei Vorteile, die Single-Use-Bioreaktoren bieten.
• Ausschluss von Kreuzkontamination
• ready-to-use / vorsterilisiert
• keine Reinigung
• Flexibilität
(b) In welcher Wachstumsphase tritt die maximale Wachstumsrate auf?
(c) Stellen Sie den Zusammenhang von Substratkonzentration und spezifischer Wachstumsrate für den Fall einer Substratüberschussinhibierung im nachfolgenden Diagramm grafisch dar und zeichnen Sie den Ks-Wert ein.
b) Maximale Wachstumsrate μmax: Wachstumsrate während der exponentiellen Phase
c)
Was versteht man unter der Induktion eines Gens?
Aktivierung eines reprimierbaren Promotors durch einen Induktor
Was versteht man unter Scale-Up?
Übertragung eines im Labor entwickelten Verfahrens auf den Produktionsmaßstab
Scale-Up-Einfluss-Faktoren:
• Chemisch: Qualität der eingesetzten Medien
• Biologisch: Anzahl der Generationen
• Physikalisch: Unterschiede in Geometrie, Ausstattung, Design, Mischzeiten
(a) Nennen Sie zwei Gründe, weshalb es von Vorteil ist, wenn der zu produzierende Stoff an das Nährmedium abgegeben wird?
(c) Mittels Cross-Flow-Filtration soll ein Insulin-Wirkstoff (M = 5.700 g/mol) von Verunreinigungen (< 1.000 g/mol) befreit werden. Sie sollen eine Filtrationsmembran mit einem passenden Cut-Off auswählen. Welcher Cut-Off ist hier sinnvoll? Begründen Sie Ihre Wahl.
(d) Wie bezeichnet man bei chromatographischen Verfahren das Ablösen des Produkts von der stationären Phase?
a) 1. kein Zellaufschluss nötig-> einfache Abtrennung
b) pH-Wert muss so verändert werden, dass Zahl positiver und negativer Ladungen gleich ist-> dann ist Proteinlöslichkeit am geringsten.
c) Ein Cut-Off von 1,000g/mol [Da] wäre hier sinnvol, da Verunreinigungen kleiner sind und durch die Membran passieren während Insulin Wirkstoff zurück bleibt.
d) Elution
Weshalb müssen das Einfrieren und Auftauen von Protein-Wirkstoffen intensiv untersucht werden?
Zur Prüfung von Produktstabilität und -qualität
Weil jedes Protein verschieden auf Temperaturschwankungen reagiert-> Veränderungen nicht vorhersehbar sind.
Die Herstellung monoklonaler Antikörper erfolgt in Säugerzellen über zahlreiche Kultivierungsstufen.
(a) Vorstufen des Fermentationsprozesses erfolgen in Wave-Bioreaktoren. Wie erfolgt hier die Durchmischung der Kultur?
(b) Für die Aufreinigung der Antikörper kommen in der Regel Protein-A-Säulen zum Einsatz. Um welche Chromatographieart handelt es sich dabei?
a) Durch Wippbewegung-> erzeugt Durchmischungswellen
b) Affinitätschromatographie
Was versteht man unter dem Primärstoffwechsel eines Organismus?
Unter Primärstoffwechsel werden alle katabolen und anabolen Stoffwechselwege zusammengefasst, die für das Wachstum, die Entwicklung und die Reproduktion eines Organismus benötigt werden.
(a) Welche zwei Schritte sind innerhalb einer Zelle erforderlich, um aus DNA Proteine zu generieren?
(b) Nennen Sie einen grundlegenden Unterschied zwischen pro- und eukaryotischen Expressionssystemen.
(c) Was versteht man unter transienter Expression?
a) Transkription und Translation
b) Prokarya-> Transformation =Übertragung v. Plasmid-DNA-> 1 Schritt+ Operon Modell-> viele Proteine
Eukarya-> Transfektion= Übertragung v. Fremd-Gen-> viele Schritte-> 1 Protein
c) Transiente Expression: Einbringen des Fremd-Gens ohne Integration in das Genom-> Expression nur für kurze Zeit
(a) Nennen Sie eine Bakterien-Gattung, die als Antibiotikaproduzent stark gefragt ist.
(b) Nennen Sie einen Naturstoff aus einer Arzneipflanze, der für medizinische Zwecke zum Einsatz kommt.
a) Streptomyces
b) Morphin-> Analgetikum
(a) Nennen Sie zwei Vorteile von Bakterien als Produzenten für biopharmazeutische Produkte.
(b) Ein Nachteil von Bakterien als Produzenten ist, dass posttranslationale Modifikationen nur sehr unzureichend ausgeführt werden. Weshalb sind diese aber sehr wichtig?
(c) Besonders bei E. coli treten zudem Inclusion Bodies auf. Welche Probleme/Konsequenzen bringen diese für das Downstream Processing mit sich?
a) 1. Anzucht in hoher Zellzahl
kurze Fermentationszeit
große Proteinmengen möglich
preiswerte Herstellung
b) posttranslationale Modifikation ist wichtig, um Pro-Protein (inaktive Form) in aktive Form zu überführen mittels verschiedener Reaktionen-> Proteasen/Anhängen von Molekülresten/ Faltung
-> fertiges Protein liegt als Quartärstruktur vor
c) Inclusionbodies= Einschlusskörperchen= Proteinaggregate, die unlöslich in der Zelle vorliegen= Ansammlungen fehlerhafter/unvollständig gefalteter Proteine, die im Zytoplasma ausfällen.
(a) Bei transgenen Pilzen als Produzenten kommen häufig prototrophe Marker zur Komplementation von auxotrophen Mutanten zum Einsatz. Was versteht man unter prototroph?
a) Prototroph sind Lebewesen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren selbst synthetisieren können.
(a) Welche Herausforderungen bringen Säugetierzellen als Produzenten von Biopharmazeutischen Produkten mit sich? Nennen Sie drei Aspekte.
(b) Nennen Sie eine für die biopharmazeutische Produktion eingesetzte Säugetierzelllinie.
a) Herausforderungen:
b) CHO-Hamsterzellen
(a) Wie unterscheiden sich definierte/synthetische und komplexe/technische Nährmedien?
(b) Weshalb muss ein Nährmedium das Element Phosphor enthalten?
(c) Welche stickstoffhaltigen Verbindungen in einem Nährmedium sind wichtig für die Proteinbiosynthese?
a) Nährmedienarten
c) Nitrat-> bei Prokaryoten
Stellen Sie die Wachstumskurve einer einzelzellig wachsenden bakteriellen Kultur dar und benennen Sie die Wachstumsphasen.
Wachstum = Zunahme an Biomasse pro Zeiteinheit
(a) Nennen Sie einen Parameter, durch dessen Erhöhung sich der Turbulenzgrad in einem Rührkesselreaktor steigert.
(b) Wie erfolgt die Belüftung bei Blasensäulenreaktoren?
a) • Drehzahl (n)
Rührerdurchmesser (d)
b) Blasensäulenreaktoren
• Belüftung über Gasverteiler am Boden (statisch o. dynamisch)
• Meist zusätzliche Leitrohre
Blaen leichter als Medium-> steigen nach oben
(a) Was versteht man beim Wachstum einer Kultur unter der Generationszeit g?
(b) Wie hängt diese mit der Teilungsrate v zusammen?
(c) Welche Wachstumsrate ergibt sich bei der Sättigungs-/Monod-Kinetik bei sehr hoher Substratkonzentration? Kreuzen Sie an.
a) Generationszeit g: Zeit, die eine Zelle für eine Verdopplung braucht [h]
b) Teilungsrate 𝜈𝜈: 1 / Generationszeit g [h-1] = Teilungsrate von einer Zelle
c) µ = µ max
(a) Welche drei zentralen Parameter werden bei Fermentationen überwacht und geregelt?
(b) Was ist der kLa-Wert und was drückt dieser aus?
(c) Nennen Sie ein Beispielprodukt bei einer streng wachstumsgekoppelten Produktbildung.
a) • Temperatur
• pH
• Gelöstsauerstoff
b) kLa: volumetrischer Stofftransportkoeffizient
c) • Typ 1: streng wachstumsgekoppelte Produktbildung (Backhefe, Ethanol, Gluconsäure)
• Typ 2: teilweise wachstumsgekoppelte Produktbildung (Citronensäure, Aminosäuren)
• Typ 3: wachstumsunabhängige Produktbildung (Antibiotika, Vitamine, Enzyme)
(b) Weshalb kann hier eine höhere Produktausbeute als bei der Batch-Fermentation erreicht werden?
Verlauf:
• Verlängerung der Produktionsphase durch Zugabe von Medium
• Erhöhte Produktausbeute bei Sekundärmetaboliten (Bildung nach dem Ende der logarithmischen Phase)
• Metabolite können zugefüttert werden -> Steuerung der Produktbildung
• Umgehen der Substrathemmung
Zellernte und –aufschluss:
(a) Welche beiden Möglichkeiten der Zellernte gibt es?
(b) Nennen Sie einen Vorteil, den Verfahren basierend auf Hochdruckhomogenisatoren gegenüber einem Zellaufschluss mit lytischen Enzymen oder Detergenzien haben.
a) Abtrennung der Zellen durch (Durchfluss-) Zentrifugation und/oder Filtration
b) Vorteil(Hochdruckhomogenisatoren):
erzeugt kleine stabile Partikel
gleichmäßige Partikelzerkleinerung
(a) Was versteht man bei chromatographischen Verfahren unter Retention?
(b) Welches chromatographische Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen arbeitet über eine Wechselwirkung mit geladenen Gruppen?
(c) Was ist das Prinzip der Größenausschlusschromatographie?
(d) Welchen Zweck erfüllt die Trocknung eines biopharmazeutischen Wirkstoffs?
a) Retention = Rückhaltezeit: Zeit, die Stoff benötigt, um Trennstrecke zu durchlaufen.
b) Ionenaustausch-Chromatographie-> Stoffe werden nach Ionen-Ladung und Größe getrennt.
c) - Trennung nach Molekülgröße mit porösen Säulematerialien
Poren mit def. Durchmesser
Substanzen mit kleinem Molekulargewicht dringen in kleine Poren ein, bleiben dort länger drin
große Substanzen strömen schneller durch Matrix raus-> Trennung
-> häufig letzte Stuffe bei Proteinaufreinigung
d) Zweck: Verlängerung der Stabilität durch Absenkung des aW-Wertes
Wie unterscheiden sich Biosimilars von Generika? Nennen sie zwei Aspekte.
Anders als Generika, die durch eine chemische Synthese hergestellt werden und den absolut identischen Wirkstoff wie das ehemals patentgeschützte Präparat enthalten, werden Biosimilars mit Hilfe lebender Organismen produziert, meist in Zellkulturen. Die heute auf dem Markt verfügbaren biologischen Wirkstoffe stammen etwa aus Bakterien, Hefezellen oder Säugetierzellen. Mittels Verfahren der Biotechnologie werden sie gentechnisch verändert. Anders als Generika sind sie nie absolut identisch, aber stets vergleichbar.
Biosimilars
Generika
hergestellt in Zellkulturen
hergestellt durch chemische Synthese
vergleichbar mit Original
identisch mit Original
(a) Welchem Bereich der Biotechnologie wird die Herstellung von Peroxidasen zugeordnet, die in der Textilindustrie als Bleichmittel eingesetzt werden?
(b) Geben Sie ein konkretes Beispiel aus dem Bereich der grünen Biotechnologie an.
a) weiße Biotechnologie
b) Hefe und transgene Bakterien in gärendem Wein und Bier
(a) Naturstoffe sind niedermolekulare Produkte des Primär- und Sekundärstoffwechsels. Was versteht man unter dem Sekundärstoffwechsel?
(b) Glucagon ist ein Peptid bestehend aus 29 Aminosäuren, das im menschlichen Körper den Blutzuckerspiegel steigert. Welcher Gruppe von Naturstoffen kann Glucagon zugeordnet werden?
a) Unter Sekundärstoffwechsel werden alle Stoffwechselwege zusammengefasst, die nicht direkt zu den lebenserhaltenden Prozessen eines Organismus gehören.
b) Peptidhormon
(a) Welcher Impfstoffgruppe ordnet man Impfstoffe zu, die durch Behandlung von Influenza-Viren mit Detergenzien oder organischen Lösungsmitteln gewonnen werden?
(b) Welcher Impfstoffgruppe ordnet man Impfstoffe zu, die inaktivierte Exotoxine enthalten?
a) Spaltimpfstoffe: Behandlung der Erreger mit Detergenzien oder organischen Lösungsmitteln
b) Toxoidimpfstoffe: enthalten inaktivierte Exotoxine, z. B. gegen Tetanusbakterien
(a) Eine mRNA enthält eine kodierende Sequenz mit einer Länge von 912 Basen. Aus wie vielen Aminosäuren besteht das resultierende Protein?
(b) Zahlreiche Antibiotika blockieren Untereinheiten des Ribosoms. Welcher Schritt der Proteinbiosynthese wird dadurch inhibiert?
a) 1 Aminosäure = 3 Triplet-> 912 / 3 = 304
304 Aminosäuren - Stopcodon = 301 Aminosäure!
(Stopcodon ist keine Aminosäure! wird abgezogen!
b) Translation???
Posttranslationale Modifikationen sind für die Funktion und Aktivität von Proteinen wichtig.
(a) Nennen Sie eine bei Proteinen vorkommende Sekundärstruktur.
(b) Wodurch erhalten Proteine ihre dreidimensionale, definierte räumliche Struktur (Tertiärstruktur)?
(c) Mit welchem Fachbegriff bezeichnet man das Anhängen von Kohlenhydraten an Amino- oder Hydroxylgruppen von Aminosäuren?
a) Die am häufigsten vorkommenden Sekundärstrukturen sind die α-Helix und das β-Faltblatt.
b) Die Tertiärstruktur beschreibt die dreidimensionale Struktur eines Proteins und entsteht durch die Verwindung der Sekundärstruktur. Jetzt gehen die Seitenketten der Aminosäuren Bindungen miteinander ein.
c) Glykosylierung
Um aus einem Wildstamm (eines identifizierten Natur-/Wirkstoffproduzenten) einen Hochleistungsstamm zu generieren, muss man den Stamm optimieren. Was versteht man dabei unter klassischer Mutagenese?
Bei der klassischen (ungerichteten) Mutagenese wird die spontane Mutationsrate im Erbgut von Lebewesen erhöht, indem sie Erbgut-verändernden (mutagenen) Substanzen oder Strahlen ausgesetzt werden.
(a) Aus welchem Abschnitt des Plasmids resultiert die mRNA?
(b) Nach dem Einbringen des Plasmids mit dem Fremdgen in eine Zelle kann diese als GVO bezeichnet werden. Wofür steht die Abkürzung GVO?
a) rbs (Ribosomaleschnittstelle) bis C-Tag
(P=Promotor, O=Signalpeptid, T=Terminator/ Stopcodon
b) GVO = Gentechnisch veränderter Organismus (deren Erbanlagen wurden gezielt mittels gentechnischer Methoden verändert.
Die biotechnologische Herstellung von Proteinwirkstoffen in Säugetierzellen ist im Vergleich zur Nutzung von Bakterien als Produzenten deutlich teurer. Nennen Sie zwei Gründe weshalb.
teuerer als Bakterien, weil
Bei transgenen Pilzen als Produzenten kommen häufig prototrophe Marker zur Komplementation von auxotrophen Mutanten zum Einsatz. Was versteht man unter „Komplementation von auxotrophen Mutanten“?
Transformiert man eine auxotrophe Mutante mit einem Vektor, der das komplementierende Gen und ein zu untersuchendes Gen trägt, so kann man prüfen, ob beide Gene erfolgreich in den Organismus integriert wurden, denn nur bei komplementierten Mutanten wurde der Vektor und somit das zu untersuchende Gen aufgenommen.
(a) Welche kohlenstoffhaltigen Verbindungen sind wichtig für den Energiestoffwechsel von Zellen?
(c) Mit welchem Begriff bezeichnet man ein Nährmedium, bei dem die exakte Zusammensetzung bekannt ist?
a) a) CO2, Glucose, Saccharose
c) definiertes synthetisches Medium
Alle Inhaltsstoffe sind exakt bekannt und definiert
In der Abbildung ist die Wachstumskurve einer einzelzellig wachsenden bakteriellen Kultur mit den Wachstumsphasen dargestellt. Ergänzen Sie Informationen zur spezifischen Wachstumsrate µ in den jeweiligen Wachstumsphasen.
Lag Phase: 0<
Log Phase: mü(max)
Dezelerationsphase: 0<mü<mü(max)
Statinäre Phase: =0
Sterbe Phase: mü<0
(a) Weshalb wird bei aeroben bakteriellen Kulturen in Rührkesselreaktoren stets mit turbulenter Strömung gearbeitet?
(b) Wie wirkt sich eine Zunahme der Viskosität im Laufe der Fermentation auf die vorliegende Reynolds-Zahl aus.
(c) Wie erfolgt die Durchmischung bei einfachen Blasensäulenreaktoren (ohne Umlauf)?
(d) Fotobioreaktoren kommen zur Kultivierung von Mikroalgen zum Einsatz. Weshalb ist dabei die Reaktordicke sehr gering?
a) weil bei laminaren Strömung Durchmischung inhomogen wäre & Gaseintrag ungleichmäßig
Turbulente Strömung: homogene Stoffverteilung durch Wirbel- Erzeugung + Gaseintrag gleivhmäßiger, da Blasen zerkleinert/dispergiert.
b) Reynoldszahl wird kleiner.
c) Durchmischung( ohne Umlauf)= durch homogene Blasenströmung
-> Gaseintrag im unteren Bereich v. Bioreaktor
d) weil Algen zum Wachstum Lich benötigen
Kinetik 1 (2 Punkte) Stellen Sie für die Sättigungskinetik (Monod-Kinetik) den Zusammenhang von Substratkonzentration und spezifischer Wachstumsrate grafisch dar und zeichnen Sie den KS-Wert mit ein. Hinweis: Beschriftung der Achsen nicht vergessen.
Kinetik 2 und Produktbildung
(a) Geben Sie an, um welchen Faktor sich die maximalen Wachstumsraten von Säugerzellkulturen und Bacillus subtilis (tD = 0,5 h) in etwa unterscheiden.
(b) Was versteht man unter einer rein wachstumsgekoppelten Produktbildung?
b) eine rein Wahstumsgekopppelte Produktion ist wenn ein Stoffwechselprodukt während der Wachstumsphase gebildet wird.
(a) Welcher Parameter neben dem Gelöstsauerstoff und der Temperatur wird bei Fermentationen überwacht und geregelt?
(b) Wie wirkt sich die Erhöhung der Rührerdrehzahl auf den kLa-Wert aus?
(c) Welche Fermentationsart würden Sie wählen, wenn das für das Zellwachstum benötigte Substrat schon bei geringen Konzentrationen wachstumsinhibierend wirkt, das entstehende Produkt jedoch keinerlei wachstumsinhibierende oder toxische Effekte mit sich bringt? Begründen Sie Ihre Auswahl.
a) pH-Wert
b) durch Erhöhung der Rührer Drehzahl erhöht sich kLa Wert (=Durchmischung)
(a) Wann ist ein Zellaufschluss erforderlich?
(b) Mittels TFF soll ein monoklonaler Antikörper (M = 150 kDa) von niedermolekularen Verunreinigungen (< 1.000 g/mol) befreit werden. Sie sollen eine Filtrationsmembran mit einem passenden Cut-Off auswählen. Welcher Cut-Off ist hier sinnvoll? Begründen Sie Ihre Wahl.
(c) Welches chromatographische Verfahren erreicht eine Klassifizierung nach der Molekülgröße?
(d) Was ist das Prinzip der Affinitätschromatographie?
a) Zellen, die ihre Zellinhaltsstoffe nicht selbständig freisetzen, müssen einen Zellaufschlussprozess durchlaufen.
b) Ein Cut-Off von 1,000g/mol [Da] wäre hier sinnvol, da Verunreinigungen kleiner sind und durch die Membran passieren während monoklonaler Antikörper zurück bleibt.
c) Größenausschlusschromatographie
d) Affinität zu natürlichen oder artifiziellen Liganden
Eine Kontamination liegt vor dem DSP mit einem Anteil von 1% vor. Durch das DSP ergibt sich ein Gesamtabreicherungsfaktor von 10.000. Welcher Anteil der Kontamination in ppm (parts per million) und ppb (parts per billion) ergibt sich für das finale Produkt?
vorher: 1% = 0,01
Gesamtabrecherungsfaktor: 10000
nachher: 0,01/10000 = 0,000001 = 10^-6-> 1 ppm -> 1000 ppb
(ppm= parts per million 10^-6)
(ppb= part per billion 10^-9)
(a) Welche Farbe der Biotechnologie gehört zu Insulin?
(b) Was versteht man unter dem Primärstoffwechsel eines Organismus?
(c) Welcher Gruppe von Naturstoffen wird eine Substanz zugeordnet, die Bakterienwachstum hemmt?
a) rote Biotechnologie
b) Unter Primärstoffwechsel werden alle katabolen und anabolen Stoffwechselwege zusammengefasst, die für das Wachstum, die Entwicklung und die Reproduktion eines Organismus benötigt werden.
c) Antibiotika
(a) Aus was besteht ein Vollimpfstoff, der zur großen Gruppe der Totimpfstoffe gehört?
(b) Ein Impfstoff gegen Hepatitis B enthält das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) mit einer Länge von 226 Aminosäuren. Welche Länge in Basenpaaren hat eine für HBsAG kodierende DNA-Sequenz?
a) Vollimpfstoffe sind Impfstoffe, die ganze, inaktivierte oder attenuierte Krankheitserreger (Viren oder Bakterien) enthalten.
b)226*3= 678+3 Basenpaare(Stopcodon)= 681 Basenpaare
Proteinbiosynthese
(a) Durch welchen Schritt der Proteinbiosynthese wird auf Basis der mRNA ein Protein generiert?
(b) Was unterscheidet die Tertiär- und Quartärstruktur?
(c) Was versteht man unter Glykosylierung?
a) Translation
b) Tertiärstruktur – die räumliche Struktur des einzelnen Proteins bzw. einer Untereinheit. Quartärstruktur – die räumliche Struktur des gesamten Proteinkomplexes mit allen Untereinheiten.
c) Glykosylierung beschreibt eine Gruppe von enzymatischen und chemischen Reaktionen, bei denen Saccharide(Kohlenhydrate) an Proteine, Lipide oder andere Aglykone gebunden werden.
Zur biotechnologischen Wirkstoffherstellung gehört u.a. die Entwicklung des Produktionsorganismus.
(a) Die Entwicklung des Produktionsorganismus kann dem USP der biotechnologischen Wirkstoffherstellung zugeordnet werden. Wofür steht die Abkürzung USP?
(b) Ein Mikroorganismus ist ein Produzent für einen Naturstoff. Beschreiben Sie wie eine gerichtete Stammoptimierung hin zu einem Hochleistungsstamm erfolgen kann.
a) USP ist das Akronym für Unique Selling Proposition oder Unique Selling Point. Es handelt sich somit um das Alleinstellungsmerkmal eines Produkts
b) gerichtete Stammoptimirungsverfahren= wird mittels gentechnischer Manipulation erzeugt-> z.B Genregulation/ Regulation v. Stoffwechselwegen durch Änderung v. genetischen Material vom Organismus (Integration von spez. Gen/ Vektor/ Plasmid…)
(a) Benennen Sie die Elemente 1, 2, und 3 in der Abbildung, die für die erfolgreiche Generierung einer mRNA und daraus eines Proteins unerlässlich sind.
(b) Das Plasmid soll in eine E.-coli-Zelle eingebracht werden. Wie bezeichnet man diesen Vorgang?
a) 1. start codon
Hauptteil der DNA Information Codierung
Stop codon
b) Transformation= Übertragung von Plasmid-DNA in prokaryotische Zelle.
Nennen Sie zwei Vorteile, die Bacillus subtilis als Produktionsorganismus gegenüber E. coli bietet.
sehr hohe Ausbeute
GRAS= Generally recognized as safe
keine Endotoxine
E.coli-Zellen soll das Plasmid aus Aufgabe 5 übertragen werden. Bei dem Resistenzgen handelt es sich um ein Antibiotikaresistenzgen. Erklären Sie nachvollziehbar, wie die Selektion von transgenen Klonen mittels eines Antibiotikaresistenzgens funktioniert.
(a) Nennen Sie eine für die biopharmazeutische Produktion eingesetzte Säugetierzelllinie.
(b) Für die Generierung welcher GVOs wird Agrobacterium tumefaciens eingesetzt?
a) CHO-Zelle: Produzent meister biopharmazeutischer Produkte
BHK-21-Zelle: Produzent von Impfstoffen und Viren
b) Das Bakterium wird als Transportmittel (Vektor) eingesetzt, um Fremdgene in Pflanzen einzuschleusen.
(a) Komplexe Medien enthalten häufig Inhaltsstoffe wie Hefeextrakt. Was ist dabei aus GMP-Sicht problematisch?
(b) Ein Nährmedium muss auch Phosphor enthalten. Geben Sie ein in einer Zelle vorkommendes Biomolekül an, das Phosphor enthält?
a) die genaue Zusammensetzung ist dabei unbekannt, daher ist die Nachvollziehbarkeit schwierig
b) ATP
Stellen Sie die Wachstumskurve einer einzelzellig wachsenden bakteriellen Kultur bis zur stationären Phase dar. Benennen Sie die Achsen und Wachstumsphasen.
(b) Nennen Sie zwei Vorteile, die Single-Use-Bioreaktoren bieten.
(c) Welchen Vorteil bietet der Gasliftreaktor (Abb. B) gegenüber einem konventionellen Blasensäulenreaktor (Abb. A)?
a) bei laminarer Strömung die Durchmischung inhomogen wäre-> Gaseintrag ungleichmäßig
Turbulente Strömung-> homogene Stoffverteilung durch Wirbel Erzeugung+ Gaseintrag gleichmäßiger, da Blasen zerkleinert/ dispergiert
c) Blasensäulen wird auf der ganzen Fläche dauerhaft begast während bei Gasliftreaktoren nur ein Teil gleichzeitig begast wird und durch absinken vermichst wird ( hat eine Strömung erzeugt)
Kinetik und Produktbildung
(b) Welche Einheit hat die spezifische Wachstumsrate µ?
(c) Was versteht man unter der Induktion eines Gens?
b) [h^-1]
c) Aktivierung eines reprimierbaren Promotors durch einen Induktor
(a) Mit welchem Begriff bezeichnet man das Hinzufügen der Vorkultur in einen Bioreaktor?
(c) Wie kann der kLa-Wert bei Rührkesselreaktoren gesteigert werden? Geben Sie einen Aspekt neben der Erhöhung der Rührerdrehzahl an.
(d) Wie läuft ein Fed-Batch-Verfahren ab?
c) kLa-Wert steigtwenn:
d)
(a) Welcher Schritt des Downstream Processing entfällt, wenn das Produkt während der Fermentation an das Nährmedium abgegeben wurde?
(b) Welchen Zweck erfüllt eine Präzipitation im Rahmen eines Downstream Processing?
(c) Was bezeichnet man bei chromatographischen Verfahren unter Elution?
(d) Eine Stoffmischung soll mittels Größenausschlusschromatographie getrennt werden. Die Stoffmischung enthält Substanzen mit den Molekulargewichten 100 g/mol, 1.000 g/mol, 10.000 g/mol und 100.000 g/mol. Welche Substanz verlässt die Säule / stationäre Phase zuerst?
a) kein Zellaufschuss nötig
b) Präzipitation- Niederschlag
Zweck- um das Produkt vom Rest zu trennen
c) Elution= das Ablösen des Produkts von der stationären Phase
d) Substanz mit dem größten Molekulargewicht
Ein pharmazeutischer Protein-Wirkstoff wird über Fermentation von rekombinanten Hefe-Zellen hergestellt. Geben Sie auf Basis dieser Information drei Arten von Kontaminanten an, die im Downstream Processing entfernt werden müssen und zudem im Rahmen der Qualitätskontrolle bei der Prüfung auf Verunreinigungen analysiert werden sollten.
Bakterien, Hefe, Pilze
Inclusion bodies
Toxine
Welcher Begriff gehört zur nachfolgenden Definition? „Ein Arzneimittel, das einem anderen biologischen Arzneimittel, das bereits in der EU vermarktet wird (das so genannte „Referenzarzneimittel“), sehr ähnlich ist.“
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