02_sample-preparation

Top-Down

Middle-Down

Bottum-Up/Shotgun

• Analyse intakter Proteine, purer Proteine

• nur kleine Anzahl moeglich

• fuer spezielle Aufgaben und Betrachtung ganzer Proteine -> Konfirmation, Komplexe

3 - 10 kDa

• Analyse groessere Stuecke von Proteinen/Peptiden

• speziell fuer Protease oder chemische Teilungen

< 3 kDa

• Analyse kleiner, verdauter Stuecke von Proteinen/Peptiden

  -> Enzyme

• weitreichende, vielzaehlige Analysen vieler Proteine

• sehr komplex

Proteinextraktion

• Lyse-Puffer

• Spaltung

• Aufreinigung/andere Biomolekuele

optional:

Zell-/Organellseparation

Fragmentierung oder Separation auf Proteinlevel

Verdauung/Aufschluss

• Proteasen

• weitere Vorbereitung

• Verdauungs-/Aufschluss-Methoden

  
  

optional:

Fragmentierung oder Separation auf Peptidlevel

Optionale Probenpraeperationsschritte

1. Puffer Komposition / Lyse Puffer

2. Zerstoerung von Zellen und Gewebe

3. Entfernen anderer Biomolekuele

bei Probenvorbereitung (1)

Extraktion des Proteins und Stabilisierung von diesem

• Regulation von pH-Wert, Salzlevel

• Praevention vor Zersetzung durch Inhibitoren

• wmgl. Reduktion der Disulfidbruecken

• native oder denaturierte Proteinstruktur

bei Probenvorbereitung (2)

Zerstoerung der Membranbarrieren von innen nach aussen

• biophysikalisch: Chaotrophe Reagenten (Urea)

  -> Plasmamembran der eukaryotische Zellen

• mechanisch: Druck, Moerser, US-Behandlung

  -> wenn biophysikalisch nicht ausreichend

  -> ECM des Gewebes, Bakterien, Hefe, Pflanzen, Essen

  
  

bei Probenvorbereitung (3)

• Entfernen der DNA: Verdauung, Zerbrechen, Extraktion, Ablagerung

• Entfernen von Zelldebris: keine/Ultra-/Zentrifugation

1. Protease

2. Vorbereitung

3. Methoden der Verdauung/des Aufschlusses

   
   

bei Aufschluss/Verdauung (1)

Zersetzung der Proteine in Peptide in gewuenschte/benoetigte Groesse (700 - 2,500 Da)

• Trypsin: Lysin und Argenin Abspaltung

bei Aufschluss/Verdauung (2)

• Reduktion und Alkylierung: Entfernen von Disulfidbruecken und Bilden einer Kappe am Ende der hydrophilen Thiolgruppe

• Abwaschen der Komponenten aus Proteinextraktion (Chaotrope/Waschmittel)

bei Aufschluss/Verdauung (3)

• in Loesung (typischerweise mit Chaotropen, da hydrophil):

  Reduktion durch Alkylierung -> proteolytischer Aufschluss -> Entsalzung zur Entfernung von Urea, Puffersalzen, etc.

• SDS-Page und in Gel (typischerweise mit Waschmittel, da hydrophob):

  Reduktion durch Alkylierung -> SDS-Page zur Entsalzung und Separation der Proteine durch elektrisches Feld durch Wandern durch Stapel- und Aufloesegel mit Glycin- und Chlorid-Ionen-> Schneiden von Stuecken aus Gel -> Proteolytischer Aufschluss

• FASP: Kombination aus beiden Methoden, aber mit einigen Problemen

• Separation von Zellen-/Organellen nach Proteinextraktion

• Separation auf Proteinlevel nach Proteinextraktion

• Separation auf Peptidlevel nach Aufschluss

• Lasermikrosektion von Gewebe (Onkologie)

• Fluoreszens-aktivierende/magnetische Zellseparation

• Zentrifugation-Techniken mit Sedimentbildung -> Organelle

• Proteinfraktionierung: Gelelektrophorese, Chromatographie

• Proteinanreicherung: (Ko-) Immunobeteiligung, Affinitaetanreicherung

• Peptidfraktionierung: Chromatographie, Spalten/Spitzenbasierte Fraktionierung

• Peptidanreicherung: Antikoerper-basiert, andere durch bspw. Immobilisierung der Metallaffinitaet