Skript 4

• Mit Hilfe künstlicher Mutationen lässt sich die Bedeutung eines Gens für die Zellfunktion bestimmen

• Durch eine homologe Rekombination kann man diese Frage auf der Ebene des Organismus stellen

• Ziel ist es ein funktionierendes Gen durch ein Defektes zu ersetzten, um dann zu beobachten, welche Veränderung im Organismus auftreten.

• Für solche Knockout-Experimente werden häufig Mäuse verwendet. Das Allel der Maus, das getestet wer- den soll wird in ein Plasmid eingebaut. In der Mitte des Gens wird ein genetischer Marker mittels Restrikti- onsenzyme eingebaut, der die Transkription und Translation des Gens verhindert. Das so manipulierte Gen wird in einen Stammzelle eines Mausembryos transfiziert.

• Für solche Knockout-Experimente werden häufig Mäuse verwendet

• Das Allel der Maus, das getestet werden soll wird in ein Plasmid eingebaut

• In der Mitte des Gens wird ein genetischer Marker mittels Restriktionsenzyme eingebaut, der die Transkription und Translation des Gens verhindert

  • -> Das zu untersuchende Gen wird “ausgeknockt”

• Das so manipulierte Gen wird in einen Stammzelle eines Mausembryos transfiziert

• Zwischen den homologen Sequenzen des defekten Gens auf dem Plasmid und dem normalen Gen im Mausembryo kann es nun zu einer Rekombination kommen

• Das normale Allel in der Stammzelle wird gegen das defekte Allel ausgetauscht

• Dem normalen Allel im Plasmid fehlt nun sein Promotor, so dass es nicht mehr exprimiert werden kann

• Der eingebaute genetische Marker, ein Reportergen hilft dabei die transfizierte Stammzelle zu finden. Die transfizierte Stammzelle wird in ein Mausembryo übertragen. Weitere Manipulationen stellen sicher, dass das Allel am Ende homozygot vorliegt. Die beobachtbaren Veränderungen in der Knockout-Maus im Ver- gleich zur normalen Maus geben Aufschluss über die Funktion des Gens.

• Transkription findet noch statt, Translation nicht mehr!

• weitere Möglichkeit Gene abzuschalten -> antisense-RNA einschleusen

• -> Translation von Genen verhindern

• In normalen Zellen -> seltenen Mechanismus für die Kontrolle der Genexpression durch die Erzeugung eines RNA-Moleküls (antisense-RNA), das zur mRNA komplementär ist

• Die Bildung eines RNA-Doppelstrang-Hybrids hemmt die Translation der mRNA

• Hybrid-RNA im Zytoplasma schnell abgebaut

• Gen weiterhin transkribiert, aber nicht mehr translatiert

  
  

• Zur Herstellung einer antisense RNA sequenziert man das betreffende Gen

• Die antisense RNA wird anschließend in die Zelle eingeschleust, um die Translationsaktivität zu unterdrücken

• Beim Menschen -> mindestens 1600 Antisense-Gene, beispielsweise der Insulin-like growth factor 2 receptor (IGF-2)

  • Bei diesem Gen kann, abhängig von genetischer Prägung, ein zweiter Promotor am 3'- Ende des Gens aktiv sein, über den Antisense-RNA transkribiert wird

• Diese verhindert in der Folge die Translation beider Allele dieses Gens

• Eingesetzt wird Antisense-RNA zum Beispiel in der Biotechnologie, beispielsweise bei der kommerziell wenig erfolgreichen Flavr-Savr-Tomate

  • Hier wurde ein künstliches Gen in die Tomate eingebracht, das Antisense-RNA gegen ein am Reifungsprozess beteiligtes Gen produziert, das für das Enzym Polygalacturonase codiert

  • Hierdurch kann der Reifungsprozess der sogenannten Flavr- Savr-Tomate verzögert werden

• Weiterhin findet das System der Antisense-RNA zunehmend Verbreitung in der Medizin und Pharmakologie (Medikament, das auf der Antisense-Technik beruht: das Virostatikum Fo- mivirsen gegen das Cytomegalievirus)

• Antisense -> wirkt temporär, die Translation wird eine Zeit lang unterdrückt

• KnockOut -> ist in dem Genom der Maus, alle Nachkommen werden diese genetische Information ebenfalls tragen

• -> RNA Interferenz

  • ähnlich zu Antisense RNA

• Hier finden Micro-RNAs Verwendung.

  • endogene etwa 22 Nukletid große, nicht-codierende RNA-Moleküle

• Zur RNA-Interferenz werden kurze doppelsträngige RNA-Fragmente verwendet (small interference RNA = siRNA)

• RNAi-Prinzip basiert natürlicherweise auf doppelsträngiger RNA (dsRNA), die entweder

  • während einer viralen Infektion bei der Virusvermehrung auftritt oder

  • die von mikroRNA (miRNA) gebildet wird.

• Diese spezielle RNA-Spezies -> erst kürzlich entdeckt -> physiologischer Bestandteil des Genoms

• RNA-Viren wie das Influenza- oder das Hepatitis-C-Virus -> doppelsträngige RNA als Replikationsform

• Säugerzellen können sich sehr effektiv gegen eine Virusinfektion wehren:

  • durch Interferoninduzierte Hemmung der Proteinsynthese und über die RNAi

• virale dsRNA im Zytoplasma von einem dsRNA-spezifischen RNAse-Komplex DICER erkannt

• DICER schneidet aus der dsRNA kleine doppelsträngige RNA-Stücke heraus, am 5’-Ende eine Phosphatgruppe tragen und am 3’-Ende um zwei Basen überstehen -> siRNA

• Die siRNA wird dann von einem weiteren Enzymkomplex namens RISC (RNA-induced silencing complex) gebunden

• Der RISC entwindet den siRNA-Doppelstrang und sucht dann mit jeweils einem der beiden RNA-Einzelstränge nach komplementären mRNA-Sequenzen in der Zelle

• Werden solche identifiziert, wird diese mRNA durch RISC abgebaut

• mRNA steht nicht mehr für die Proteintranslation zur Verfügung

  • die Menge des von der mRNA codierten Proteins nimmt in der Zelle ab

• RNA-Interferenz -> posttranskriptionelle Down-Regulation der Proteinexpression

  
  

• siRNA (3)

  • Bei Viraler Infektion

  • Die RNA Vorläufer entstammen viraler RNA oder endogen aus der Zelle

  • Die siRNA entsteht RNA abhängig (Verteidigung gegen Viren)

• miRNA (7)

  • Inhibition der Translation

  • DNA abhängig

  • codierende oder nicht-coviderende DNA Abschnitte werden von der RNA Polymerase II transcribiert

  • pri-miRNA (primary micro RNA) diese wird durch einen Enzymkomplex zur pre-miRNA verwandelt

  • pre-miRNA bildet eine Haarnadelstruktur und DICER spltet zu miRNA

  • Ziel ist die Hemmung der mRNA

• RNA-Interferenz -> posttranskriptionelle Down-Regulation der Proteinexpression

• Die Replikation von RNA-Viren wird selektiv dadurch unterbunden, dass die RNAi-Maschinerie aus der viralen dsRNA-Replikationsform siRNA produziert und mit deren Hilfe die viralen RNA degradiert

• Die doppelsträngigen siRNAs sind stabiler als die antisense-RNAs

• Beide Techniken finden bei der Untersuchung von Zusammenhängen zwischen Ursache und Wirkung (Genotyp-Phänotyp) häufig Anwendung

• Codierende RNAs ca. 4 % -> prä mRNA (hnRNA) -> mRNA

• Funktionelle RNAs -> kann man nochmal aufteilen, ca. 96 %

  • Prä rRNA -> rRNA

  • prä tRNA -> tRNA

  • sn RNA

    • snoRNA

    • miRNA

    • siRNA

• mRNA -> Zellkern, Zytoplasma – Prozess: Transkription, Processing, Translation

  • hnRNA -> high nuclear RNA

• t/rRNA -> Zytoplasma – Prozess: Zytoplasma, Translation

• snRNA /snoRNA -> Zellkern – Prozess: sn -> Splicing, sno -> chemische Modifikation von RNAs

• mi/siRNA -> Zytoplasma – Prozess: Regulationsfunktion, Expressionskontrolle

• gRNA (crRNA, tracrRNA) -> Crispr-Cas-Systeme

• ursprünglichere Nukleinsäure, Kompartimentierung -> DNA „nur noch“ Informationsspeicher, RNA aber auch Informationsweitergabe und haben eigene Aufgaben wie Proteine schneiden

• Ein paar RNAs -> ein paar Prokaryoten spleißen nicht, haben keine Exone/Introne, die Gene sind durchgängig, polycistonische RNA

o   Prä mRNA -> eukaryotisch

• Antisense RNA -> Strategie bei Säugern

• siRNA -> Strategie bei Säugern gegen Viren

• dsRNA -> Säuger erhöhen Interferonproduktion -> Folge: inhibiert virale Proteine und schickt Zelle in die Apoptose

• Pflanzen/Nematoden/Insekten: RNAse DICER -> schneidet die dsRNA auf -> siRNA (etwa 22bp)-> bindet als ssRNA an RISC-Komplex und degradiert die komplementäre mRNA, gibt es auch bei höheren Eukaryoten

• CRISPR CAS -> Strategie Prokaryoten gegen Bakteriophagen/Viren

• Abwehr auf Protein- und Nukleinsäureebene, Prokaryoten -> DICER/RISC Komplex, Crispr Cas

• Genschere hat zwei funktionelle Domänen

  • -> DNA-Bindedomäne -> Zielsequenz suchen

  • -> Endonuklease-Domäne -> Zielsequenz schneiden

• Korrektur eines Gendefekts bei Erbkrankheiten

• Ausschalten unerwünschter Genfunktionen -> Carcinome, Infektionskrankheiten

• Gegenwärtig finden drei Arten von Genscheren Anwendung in klinischen Studien:

  • Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)

  • Transkriptionsaktivator-artige Effektornukleasen (TALEN) und

  • das CRISPR/Cas9-System

• Vier Genscheren können beim Genome Editing verwendet werden

• Sie werden entsprechend ihres Erkennungsbereichs für eine gewünschte Stelle der Ziel-DNA eingeteilt in:

  1. Zinkfinger-Nukleasen

     • Erkennungsdomäne mit Zinkfinger-Protein künstlich gebaut

     • Nicht sehr zielgenau

     • Herstellung dauert lange und ist sehr aufwändig

     • Kleinste aller bisher bekannten Genscheren

     • z. B. HIV

       
       

  2. TALEN (transcription activator-like effector nucleases = Transkription-Aktivatorartige Effektor-Nukleasen)

     1. Erkennungsdomäne basiert auf Proteinen, die bei Xanthomonas-Bakterien vorkommen und die für diese Genschere umgebaut wird

     2. Länge der Zielsequenz beliebig wählbar

     3. Zielgenauer als CRISPR-Cas-Systeme, weil Protein die Zielsequenz genauer findet als Leit-RNA; je länger die Zielsequenz, desto zielgenauer

     4. z. B. HPV, HIV

  3. Meganukleasen

  • Erkennungsdomäne basiert auf natürlich vorkommenden und dann veränderten Enzymen

  • Sind zielgenauer als Zinkfinger-Nukleasen, weil sie längere Sequenzen erkennen

  • Herstellung ist dermaßen aufwändig, dass sie kaum in Forschung und Anwendung genutzt werden.

  1. CRISPR-Cas

     1. z. B. bei HIV, Sichelzell- und Thalassämie

• Gesund: zwei alpha, zwei beta Ketten

  • Glutamin wird durch Valin ersetzt

• HbAs: eine ungesunde beta Ketta, heterozygot bei Sauerstoffmangel kann es zu Bildung von Sicherzellkrise kommen

• homozygote Erkrankte mit zwei defekten beta Ketten

  • Sichelzell: strukturelle Veränderung

  • Thalassämie: quantitative Veränderung

  • Hämoglobinopathie

• 3 Strategien der Gentherapie

  • Gen-Addition: LV -> Überexpression ß-Globin ->

    • Entnahme von weißen Blutkörperchen

    • CD34+ Zellen werden selektiert und aufgereinigt (-> Stammzellen der Erythorzyten)

    • Nach Qualitätskontrolle wird Blut zurück gegeben

  • Genom-Editierung -> Korrektur -> der Mutation

  • Genom-Editierung -> Knockout -> Einführen der kompensierenden Mutation z. B. BCL11A inaktivieren -> aktiviert gamma Globin

  • 
    

    
    

• -> kann vererbt werden, wenn Stamm- oder Keimzellen verändert werden

• konventionell

  • -> kontinuierliche Medikamenten Gabe

  • oft: symptomatisch, chronische Anwendung

• Gen-Addition

  • Vektor wird in den Zellkern eingebracht -> richtiges Protein wird exprimiert

  • episomal:

    • Chromosom wird nicht verändert, Im Zellkern aber nicht im Genom, Vektor mit Gen wird eingeschleust und richtiges Protein wird hergestellt

  • z. B. in vivo Injektion —> AAV Vektor -> Gen Addition mittels Transduktion der Zielzellen

  • kurativ, einmalige Anwendung

• Genom-Editierung

  • Gen wird verändert -> richtiges Protein wird exprimiert

  • chromosomal integrierend:

    • Genom wird verändert. Bei Vermehrung des Genoms werden alle nachfolgenden Zellen verändert

    • z. B. ex vivo -> Transplantation -> integrierend -> Blut-Stammzellen, Immunzellen mit lentiviralem Vektor

    • Stammzellen werden entnommen, verändert und dann zurück transplantiert

  • kurativ, einmalige Anwendung

• Klassische Gentherapie

  • zufällig

  • Gentransfer mit hoher Effektivität

  • Nebenwirkungsarm

  • Nur für bestimmte Krankheiten geeignet

• Zielgerichtete Genom-Editierung

  • zielgerichtet

  • Ausschalten unerwünschter Genfunktionen

• Chancen

  • Krankheiten heilen mit Eingriff ins Erbgut

  • einmalige Therapie

• Risiken

  • Langzeitfolgen noch unbekannt

  • hohe Kostem & hoher Aufwand

  
  

• CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats

  • natürlicherweise ein Teil des Erbguts von Mikroorganismen

  • eine „Bau-Anleitung“ für kurze RNA- Einzelstrang-Moleküle („Leit-Molekül“, „CRISPR RNA“, „crRNA“), die wiederum eine Genschere an eine bestimmte Stelle des Erbguts dirigieren —> crRNA

    • CRISPR -> RNA-Einzelstrang Moleküle -> dirigieren Genschere an bestimmte Stelle im Erbgut

  • Ein Teil dieser Sequenz kann künstlich „buchstabiert“ werden – analog zu jenem Abschnitt der DNA, an dem die Genschere ansetzen soll

  • Erste CRISPR-Sequenz 1987 in Bakterium Escherichia coli (E. coli) entdeckt

  • Das CRISPR-Cas9-System ist von Streptoccocus pyogenes.

• Cas-Proteine (CRISPR-associated proteins)

  • Cas-Gene codieren für Proteine, die mit einer Helikase- und mit Nukleaseaktivität ausgestattet sind, die einige Bakterien nutzen, um eindringende Bakteriophagen zu zerstören

    • Cas -> Endonuklease

  • Cas9 von Streptococcus pyogenes wird mit Hilfe von zwei Molekülen zur Zielsequenz der DNA geleitet und schneidet dort den Doppelstrang der DNA durch

  • Cas9 besteht aus mehreren Domänen:

  • Die HNH-Domäne ist in der Lage das doppelsträngige RNA:DNA-Hybrid zwischen crRNA und Target-DNA-Strang zu zerschneiden

  • Die RuvC-Domäne greift den zweiten, nicht gepaarten Strang der Target DNA an

  • Cas9 Protein-> Doppelstrangbruch in der Ziel-DNA

• Die PAM-Erkennungsstelle stellt sicher, dass nur Fremd-DNA geschnitten wird

  
  

• Zentraler Aspekt des CRISPR-Cas Genome Editing ist die Paarung zwischen der cRNA und der Ziel-DNA

• Andere Systeme, wie bei Zinkfingernukleasen und TALENs, beruhen auf Protein-DNA Wechselwirkungen

• Methode des Immunsystems von Bakterien -> eindringende Viren erkennen und abwehren

• grundlegendes Prinzip: Genschere und Reparatur des Schnitts

• Ein Enzym, das natürlich vorkommt und verändert wurde oder das gänzlich künstlich hergestellt wurde, steuert eine vorgegebene Stelle im Erbgut an und zerschneidet dort den DNA-Strang (Sequenz-spezifische Restriktionsnuklease)

• Eine Domäne dieses Proteins enthält die vorgegebene Erkennungssequenz, welche die DNA bindet

• Ein anderer Bereich dieses Proteins schneidet das DNA-Molekül an jener Stelle mit dem „Suchwort“

• Bei CRISPR-Cas-Systemen führt ein Leit-RNA-Molekül guide RNA (= gRNA) das Enzym zu der zu schneidenden Stelle

• Die natürlichen Reparaturmechanismen der Zelle reparieren den Strangbruch automatisch.

• Prokaryot -> Virusattacke -> CRISPR-Cas Verteidigungsmechnismus wird in Gang gesetzt

  • virale DNA-Sequenz wird als “neuer” Spacer in eine DNA Region des Bakteriums eingefügt

  • Spacer = repetitive, palindromische Sequenzen, so wechseln repetitive Sequenzen mit „Spacern“ ab, die nichts anderes sind als virale DNA aus vorherigen Attacken

• Phase 1 -> Akquisition

  • Bakterienzelle führt neuen Spacer ein

• Phase 2 -> Bearbeitung

  • nach Transkription der CRISPR-DNA -> pre-crRNA -> crRNA -> Teil der crRNA komplementär zur Ziel-DNA -> crRNA und tracrRNA paaren sich -> Hybrid entsteht-> crRNA:tracrRNA-Duplex-Einheit -> kann gleichzeitig an das Cas9-Protein und an die Ziel-DNA (-> Virus) binden

• Phase 3 -> Interferenz

  • Cas-Protein schneidet die virale DNA auf beiden Strängen

1. z.B. die Grüne Gentechnik:

   1. Veränderung des Erbguts von Pflanzen, damit sie z.B. widerstandsfähiger gegen Parasiten oder Dürre werden oder mehr Ertrag liefern, z.B. indem Resistenzgene von anderen Sorten derselben Pflanzenart oder von anderen Pflanzenarten hinzugefügt werden.

2. z.B. Medizin: bei Erbkrankheiten (z.B. Sichelzellanämie), Infektionskrankheiten (z.B. HIV) oder Tumorerkrankungen.

   
   

+ Gen-Addition: Es wird ein Gen hinzugefügt.

+ Gen-Editierung: Ein defektes Gen wird korrigiert.

+ in vivo: im Lebenden.

+ ex vivo: Biologisches Material wird außerhalb einer Zelle kultiviert.

+ episomal: Das genetische Material liegt innerhalb des Zellkerns ist aber nicht in die DNA integriert.

+ integrierend: Das genetische Material wird in die chromosomale DNA integriert.

+ on-target: Das genetische Material wird in die Ziel-DNA eingefügt.

+ off-target: Das genetische Material wird in die falsche chromosomale Gensequenz eingefügt.

• Zwei Arten für die Reparatur und Neuanpassung des Genoms:

  • Bei Doppelstrangbruch nach DNA Verdopplung kann der eine DNA bei einem anderen DNA Doppelstrang “abschreiben” und den Bruch fehlerfrei reparieren

• Homologe Rekombination -> nicht häufig

  • In die Zelle wird ein DNA-Fragment (Donor DNA) eingeschleust, das eine Gensequenz enthält, welches wiederum neu in das Erbgut eingebaut werden soll

  • Zudem enthält das DNA-Fragment an beiden Enden eine „flankierende“ Gen-Sequenz, die mit der Sequenz an den Enden des gebrochenen Strangs übereinstimmt

  • Dadurch wird das DNA-Fragment gezielt mit eingebaut

    • Die Zelle kittet einen Strangbruch in der DNA automatisch mit dem Fragment, das vorliegt

    • Ist ein präziseres Reparaturverfahren, aber sehr selten. Um es zu erzwingen, wird versucht, andere Reparaturmechanismen zu unterdrücken, etwa das nicht-homologe Verbinden

• Nicht-homologes Verbinden -> häufig

  • Keine DNA-Fragmente als Vorlage in Zelle eingeschleust

  • Beide Strang-Bruchstellen werden wieder zusammengefügt, wobei gelegentlich kleine Abschnitte (einige wenige Buchstaben, „Nukleotide“) deletiert oder insertiert, so dass ein Gen ausgeschaltet werden kann („knock out“)

• Die Gentherapie ist ein molekularer Ansatz, bei dem genetisches Material in die Zellen eines Patienten übertragen wird, um eine Krankheit zu behandeln.

• Die einfachste Gentherapiestrategie besteht darin, ein defektes Gen bei einer monogenetischen Krankheit durch eine intakte Version dieses Gens zu ersetzen

• Darüber hinaus kann die Gentherapie zur Behandlung von Krebs, Herz-Kreislauf- und Infektionskrankheiten sowie vielen anderen Störungen eingesetzt werden

• Die Wahl eines geeigneten Vektors für den Gentransfer ist von großer Bedeutung

• Weit verbreitet sind

  • retrovirale Vektoren

  • adenovirale Vektoren und

  • Vektoren auf der Basis von Adenoassoziierten Viren (AAVs)

  • -> unterscheiden sich in ihren Eigenschaften (z.B. Wirkungsdauer, Gewebeverteilung und Effizienz) und in ihren Nebenwirkungen (Insertionsmutagenese, Immunogenität, etc.)

• Während die in der Gentherapie eingesetzten viralen Vektoren in der Regel replikationsdefizient sind, d.h. sie können die Zellen des Patienten nur einmal transduzieren, sich aber nicht verbreiten, vermehren sich onkolytische Viren spezifisch in Krebszellen und können den Tumor zerstören.

• zugelassene Gentherapien derzeit sehr begrenzt -> ernsthafte Probleme mit der Wirksamkeit und Sicherheit gibt

• Kleine RNAs scheinen eine Antwort von Eukaryonten und Prokaryonten auf eine Virusabwehr zu sein:

• Die Antwort höherer Eukaryonten auf Viren:

  • Die dsRNA steigert die Interferonproduktion. Das Interferon inhibiert die Expression viraler Proteine und schickt die Zelle in die Apoptose

• Die Antwort von Pflanzen, Nematoden und Insekten auf Viren:

  • RNAse DICER schneidet die ds RNA die siRNA (~22bp), bindet als ss siRNA an RISC, der ss siRNA-RISC-Komplexbindet an kom-

    plementäre RNA und degradiert diese.

• Die Antwort von Prokaryonten auf Bakteriophagen: Das CRISPR-Cas-System

  • Die Anwesenheit von doppelsträngiger RNA -> RNAi

  • Wenn die RNA Interferenz einmal begonnen hat, ist sie nachhaltig wirksam und kann sogar in den Tochterzellen weiterwirken

  • Zusätzlich kann durch Übertragung von RNA-Fragmenten die RNA-Interferenzaktivität von Zelle zu Zelle weitergegeben werden. Das ermöglicht einer Pflanze, deren Zellen mit dünnen Kanälen verbunden sind, gegen ein RNA Virus resistent zu werden, obwohl nur wenige Zellen infiziert waren.

• Erkennungsdomäne basiert auf CRISPR-Sequenz, die so umgebaut wird, dass sie ein „Leit-Molekül“ erstellt

• dieses separate RNA-Molekül (gRNA) leitet das Cas9-Protein an die gewünschte Stelle der Ziel-DNA, wo das Protein dann schneidet

• Die gRNA ersetzt die crRNA:tracrRNA

  • Damit kann jede beliebige Sequenz bearbeitet werden. Mit CRISPR/Cas modifizierte Zellen gelten nicht automatisch als gentechnisch veränderte Organismen (GVO).

• klassisches besprochenes Schema

  • DNA wird in Oozyte gegeben

  • Manche Mäuse sind chimäre

  • Rückkreuzung zur homozyten Mäusen

  • 18 Monate

• CRISPR Cas Methode

  • 5-6 Monate

  • weniger Mäuse benötigt

• Abwägung: Veränderung von Mäusen im Vergleich zu Pflanzen und Saatgut und Menschen