Skript 5/6

• posttranslationale Modifikation und korrekte Faltung der Proteine

• keine Modifikation des Vektors für mögliche Synthese notwendig

• langsameres Wachstum

• schwierige Aufreinigung (proteine sind so stabil)

• niedrigere Ausbeute

• anspruchsvollere Kultivierung

• schwerer genetisch zu manipulieren

• Leberzellen; Lebersinusoiden

• Funktion: Strukturaufklärung

• Strukturanalyse kleinerer Moleküle

• Vorteil ist, dass man hier keine Kristalle benötigt

• Proteine bis 100 kD untersuchen und auch solche analysieren die sich einer Kristallisation verweigern

• kleines Volumen einer gereinigten und konzentrierten Proteinlösung wird in ein starkes Magnetfeld eingebracht

  • Atomkerne, ins besondere der Wasserstoff besitzen ein magnetisches Moment (Spin)

  • Der Spin richtet sich in einem starken magnetischen Feld parallel zu diesem aus. Durch Einstrahlung von Pulsen elektromagnetischer Strahlung Radiofrequenzbereich (RF) lässt sich die Ausrichtung des Spins stören und wird in einen angeregten Zustand versetzt. Wenn angeregte Wasserstoffkerne in den Grundzustand zurückkehren und sich wieder ausrichten emitteren sie die RF-Strahlung. Die Frequenz und Intensität der Emission hängt von der Umgebung jedes einzelnen Wasserstoffkerns ab. Ist ein Kern angeregt, beeinflusst er die Absorption und Emission der Strahlung benachbarter Kerne.

• Überdies kann man Informationen zur Faltung von Proteinen und Änderungen bei Bindungen mit anderen Molekülen (Dynamik) erhalten

• Mit entsprechenden Alignmentprogramen (BLAST, FASTA, ClustalW) kann man nun nach Homologien zu anderen Proteinen suchen und das Protein in eine Familie einsortieren

• Proteine finden und welche Stoffwechselwege sind beteiligt?

• Welchen Einfluss hat das Protein auf das Wachstum und auf die Entwicklung des Organismus?

• Proteine replizieren und transkribieren DNA, sie bilden, verarbeiten und sezernieren andere Proteine

• Proteine kontrollieren den Zellzyklus, den Stoffwechsel sowie den Fluss von Substanzen und Informationen und aus der Zelle

• Daher ist es wichtig, Proteine zu charakterisieren. Zum Verständnis der komplexen Zusammenhänge in einer Zelle benötigt man Auskünfte über

  • 
     Wo

  • 
     Mit welchen

  • 
     In welchem

  • 
     Welchen

  • 
     Welchen

    
    

• Somit wurden Methoden entwickelt um die Struktur der Proteine zu bestimmen, Homologien zu anderen Proteinen herzustellen, Funktionen vorherzusagen und Protein-Protein-Wechselwirkungen festzustellen.

• Funktion: Strukturaufklärung, Aufklärung von Molekülstrukturen

• Aus einer genügend großen Menge gereinigtem Protein muss ein Kristall hergestellt werden

• Ein enger gebündelter Röntgenstrahl wird auf die reine, kristallisierte Proteinprobe gelenkt

  • Beugung des Röntgenstrahls -> Gammastrahl —> sehr energiereich

• Ein kleiner Anteil der Strahlen werden von den Atomen im Protein abgelenkt und gebeugt. Mit einem Röntgenstrahlendetektor wird dieses Ereignis erfasst

• Die Lage und Intensität jedes Flecks in einem Röntgenbeugungsmuster enthält Informationen über die Position der Atome im Protein

• Die Herstellung des Proteinkristalls ist nach wie vor schwierig und insbesondere Membranproteine entziehen sich dieser Analyse, weil sie sich nicht kristallisieren lassen.

• Einen Durchbruch bei der Analyse makromolekularer Komplexe hat die Aufklärung der Ribosomenstruktur gebracht. Diese komplexe Übersetzungsmaschine besteht aus mehreren RNAs und über 50 Proteinen.

• Atomkerne —> megnetisches Moment —> SPIN

• Spin richtet sich in einem magnetischen starken Feld parallel zu diesem aus

• —> durch Einstrahlung von Pulsen elektromagentischer Strahlung im Radiofrequenzbereich —> Ausrichtung des Spins wird gestört —> wird in einen angeregten Zustand versetzt

• wenn angeregte Wasserstoffkerne in den Grundszustand zurückkehren und sich wieder ausrichten —> emittieren sie RF Strahlung

• Frequenz und Intensität der Emission hängt von der Umgebung jedes einzelnen Wasserstoffkerns ab

• 
  

• Aufenthaltsport eines Proteins festzustellen —> seine Funktion aufdecken —> Fusionsproteine werden benötigt

  • z. B. Kernproteine: verfügen über kurze Aminosäuresequenzen, die als Signal für den Import in den Kern dienen —> Regionen lassen sich via Sequenzanalyse identifizieren

• Durch die Kopplung des Analyts an ein Reporterprotein, welches leicht nachzuweisen ist, kann man das Protein verfolgen

• Durch den 1. Antikörper und einen passenden 2. markierten Antikörper kann nun die Lage des Proteins im Licht- oder Elektronenmikroskop darstellen

• Man kann ebenfalls an das Gen „of Interest“ ein kurzes GFP-Gen fusionieren und erhält ein Fusionsprotein, das grün leuchtet und mit einem entsprechend ausgestatteten Fluoreszenzmikroskop zu verfolgen ist

• Die GFP-Kopplung ist inzwischen ein Standard zur Darstellung von Verteilung und Dynamik von Proteinen in einer Zelle

• Kombiniert man das GFP mit einem weiteren Fluoreszenzfarbstoff, so kann man (wie bei der Real-Time PCR) mittels FRET (Fluoreszenzresonanz- Energietransfer) die Wechselwirkung zweier Proteine in der lebenden Zelle verfolgen

  • Kommen sich die beiden Proteine nahe, so kann die Energie des von dem einen Farbstoff absorbierten Lichts auf den anderen Farbstoff übertragen werden.

-       Fusionsproteine —> GFP wird gekoppelt, ist in dem Klonierungsvektor

-       Rausfinden wo sich die Proteine aufhalten

-       Dient der Analyse wo das Protein ist

-       Es gibt verschiedene Farbstoffe, duale Detektion möglich

• Kombiniert man das GFP mit einem weiteren Fluoreszenzfarbstoff, so kann man (wie bei der Real-Time PCR) mittels FRET (Fluoreszenzresonanz- Energietransfer) die Wechselwirkung zweier Proteine in der lebenden Zelle verfolgen

  • Kommen sich die beiden Proteine nahe, so kann die Energie des von dem einen Farbstoff absorbierten Lichts auf den anderen Farbstoff übertragen werden.

• Energie überschneidet sich

• Donor kann seine Energie auf den Akzeptor übertragen -> Leuchtet dann

  Beide müssen eine gewisse Nähe haben

  Gutes Mikroskop und entsprechende Filter benötigt

  Man benötigt Fusionsproteine um Aufenthalte aufzudecken

  Man kann den Weg in die Zelle verfolgen, gibt es ein pH Gefälle etc.

  Epitopmarkierung —> durch entsprechenden Antikörper

  Gene of interest Fusion mit GFP -> Fluoreszenzmikroskop

  Wechselwirkung zweier Proteine kann verfolgt werden mittels FRET

• Aufenthaltsport eines Proteins festzustellen —> seine Funktion aufdecken —> Fusionsproteine werden benötigt

• Durch die Kopplung des Analyts an ein Reporterprotein, welches leicht nachzuweisen ist, kann man das Protein verfolgen

• Epitopmarkierung: man konstruiert ein Fusionsprotein aus dem zu untersuchenden Protein mit einem kurzen Peptid von ca. 10 Aminosäuren, welches ein Epitop darstellt, dass mit einem handelsüblichen Antikörper detektiert werden kann

• Funktion: Reinigung

• Diese Methode hilft bei der Isolierung und Identifizierung von Proteinen, die physikalisch miteinander wechselwirken

• In einer Säule befinden sich kleine Polymerkügelchen an die ein „Fänger“-Protein gekoppelt ist

• Das Zielprotein welches mit dem Fänger wechselwirkt kann nun aus einem Gemisch „herausgeangelt“ werden

• Über die Änderung des pH-Werts oder der Ionenstärke kann das Zielprotein danach wieder eluiert werden, so dass es in reiner Form vorliegt

• Die Identität kann mit anderen Methoden, z. B. Massenspektrometrie ermittelt werden

• 
  

• -       Kleine Säulchen, beschickt mit kleinen Kügelchen z. B. aus Agarose

  -       Besonders, weil wie ELISA oder Western Blot, Antigen-Antikörper-Prinzip

  -       Auf die Kügelchen kann ein AK gekoppelt werden

  o   Antigen wird rausgefischt

  -       IgGs können runtergeholt werden

  -       IgGs haben Subtypen

  -       Waschen -> Eluieren

  -       pH Gradient kann hergestellt werden oder direkt von neutralem pH in sauer

  -       Eluat -> wird in Reagenzgläsern aufgefangen werden

  -       Einzelne Fraktionen des Eluats können gemessen werden

• -       Take home message: man kann entweder Antikörper/Antigene binden an die Kugeln, dann geht man mit dem Analyt dadrüber, was bindet bleibt hängen, rest weggewaschen, dann eluiert

  o   Unterschiedliche Eluate werden photometrisch gemessen

• Funktion: Interaktion

  • Protein-Protein-Wechselwirkung

• Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind nur schwach und von kurzer Dauer, was ihre experimentelle Darstellung erheblich erschwert

• Transkriptionsfaktoren -> meist modular aufgebaut

  • DNA-Bindungsdomäne und Transaktivierungsdomäne

• Funktionen wie DNA- Bindung und Transkriptionsaktivierung sind diskreten Domänen zugeordnet

• Nehmen wir an zwei Proteine A und B können beide als Transkriptionsfaktoren die DNA binden

• Mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken wird die DNA-Sequenz, die für das eine Zielprotein codiert (A) mit der DNA fusioniert, die die DNA-bindende Domäne eines Genaktivators enthält.

• Das Konstrukt wird in eine Hefezelle eingeführt. Die Zelle synthetisiert das Zielprotein A.

  • Das Protein A bindet an die Promotorregion eines Reportergens und dient als „Köder“.

  • Es soll nach Proteinen „fischen“ die im inneren der Hefezelle mit dem Zielprotein A wechselwirken (Beute = Protein B).

  • Mitglieder dieser Gene werden einzeln in die Hefezellen eingeführt.

  • Hat die Hefezelle einen Partner (Beuteklon) erhalten, binden beide Proteine A und B die DNA und das Reportergen kann abgelesen werden. Zellen, die das Reportergen exprimiren werden selektioniert und vermehrt.

  • Das „Beute-Gen“ wird analysiert.

• Protein-Protein-Wechselwirkung

• Wenn Bindedomäne und Transkriptionsfaktor zusammen kommen

• 2 Module: eine Domäne, die mit DNA connected (DNA Bindungsdomäne) und eine Domäne, die die Transkription aktiviert

• Frage: haben Protein A und Protein B eine Wechselwirkung?

• Expressionsvektor 1 -> Fusionsprotein Protein A = DNA Bindungsdomäne -> BAIT

• Expressionsvektor 2 -> Protein B =Transaktivierungsdomäne -> PREY

• Können A und B nicht miteinander -> kein Reportersignal

• Funktion: Interaktion

  • Protein/DNA Wechselwirkung

• Die Methode erlaubt Bindungsstellen von Proteinen auf einem DNA-Molekül, z. B. dem Promotorbereich Gens in vitro exakt zu kartieren

• Beim Einsatz reiner Proteine erlaubt der Assay quantitative Aussagen zur Bindung

• die untersuchten DNA-Ketten sind an einem Ende eines der beiden Stränge 32P radioaktiv matkiert

• Sie werden mit Proteinextrakt oder einer Probe von spezifisch ausgewählten Proteinen versetzt

  • Es bilden sich unter Umständen spezifische nicht-kovalente DNA-Protein-Bindungen aus

• Danach wird die DNA von den Proteinen getrennt

• Beim anschließenden Nuklease-Verdau wird gewährleistet, dass DNA-Ketten durch das Enzym einmalig, bzw. an wenigen Stellen gespalten werden

• Es entstehen so DNA-Bruchstücke verschiedenster Länge

  • Insbesondere sind jene Bruchstücke interessant, die das markierte Ende enthalten, denn nur diese sind nach der sich anschließenden denaturierenden Elektrophorese der Autoradiographie sichtbar.

  • In der Gelelektrophorese ergibt sich in der Kontrolle ohne Proteinzugabe eine fast kontinuierliche Verteilung der Bruchstücke

  • In den Reaktionen mit Proteinzugabe kann die Nuklease auf Abschnitten, auf denen Proteine binden, nicht wirken

  • DNA-Fragmente, deren Länge in diesen Bindungsbereich fällt, fehlen, was durch eine Lücke der kontinuierlichen Ausbreitung im Gel sichtbar wird

• Eine solche Lücke wird als Fußabdruck des Proteins auf der DNA bezeichnet.

• TF -> vermitteln der Polymerase, welches Gen aktiviert werden soll

• DNA-Bereiche, an denen sie binden, haben eine spezifische Sequenz -> responsive elements

• binden an RNA-Polymerasekomplex

  • -> höhere Bindungs-Affinität zu dem aktivierten Promoter

  • dieser wird vestärkt gebunden bzw. Promoterstärke wird erhöht -> nachfolgende proteincodierende Sequenz wird verstärkt exprimiert

• haben Histon-Acetyl-Transferase-Funktion

  • oder rekrutieren solche

  • durch Acetylierung von Histonen -> Auflockerung Histone -> RNA-Polymerase hat einen besseren Zugang zu der DNA -> kann besser an diese binden -> effizienter transkribieren

• Repressoren funktionieren nach einem umgekehrten Prinzipien

  • Histon-Deacetylasen führen zu einer dichteren Verpackung DNA

  • -> durch die Blockade von Polymerasebindestellen folgt das Absenken der Bindungs-Affinität

• komplexe Regulation -> kommt durch netzwerkartiges Zusammenspiel der vielen verschiedenen TF zustande

• Beispiele TF:

  • Zinkfingermotiv

  • Leucinzipper

  • Helix-turn-helix-TF / HEix-loop-helix-TF

  • Homöodomänen-TF