Seminare

Abhängig von Form des einzelnen Tensids

• Konus: Mizelle

  • Tensid, mit evtl. sogar geladener Kopfgruppe, dadurch sehr stark hydratisiert durch das Wasser

  • SDS

• Keilform: Bilayer, Lipsomen

  • Substanzen die keilförmig sind oder sogar fast Zylinder

  • Umsetzung mit Phospholipide am besten ( 2FS-Reste)

  • Gallensalze, Lecithin, PG, PS

• Zylindrisch: planare Bilayer

  • PE, PS+Ca2+

• Inverskonisch: Inversmizelle

  • Kopfgruppe so klein, dass großer lipophiler Rest dominiert

  • Öl außen, Kopfgruppen müssen abgeschirmt werden

  • Cholesterol, Phospholipide

Das Größenverhältnis zwischen lipophilen und hydrophilen Teilen des Emulgators bestimmen sowohl dessen Löslichkeit (O/W in Wasser) als auch den Emulgatortyp. Der Größere Molekülanteil bildet die äußere Phase.

Bausteine: Glycerophospholipide (2FS-Ketten, eher Zylinderform)

• CMC sehr niedrig (zwischen 10^-8 und 10^-12 mol/L)

• Kopfgruppen: Cholin —> ergibt zwitterionisches Phospholipid, neutral bei pH = 7; Phosphatidylcholin Hauptkomponente unserer Zell-Membranen

Temperature-buffer: stabilizes membrane by resisting changes in fluidity.

Kann sich gut zwischen Fettsäureketten der Phospholipide einlager. Interaktion zwischen OH-Gruppe und Strukturelementen der Phospholipide.

Erhöht die Packungsdichte der Lipide in fluiden Systemen (T>Tm) (kondensationseffekt)

Reduziert die Packungsdichte der Lipide in der Gelphase (T<Tm)

Kann max. zu 50 mol% zugesetzt werden, danach Sättigung und kein Bilayer mehr

Moderate Temp.: Ch decreases fluidity

Low Temp.: Ch increases fluidity

Gel | Liquid ordered | Liquid disordered

• Schicht so dicht wie möglich packen

• mit Cholesterol Permeabilität verringern

• Packungsdichte wird durch Cholesterol erhöht

  
  

Lbeta’ —> Gelphase (solid phase), hochgeordneter Zustand, sehr langsame Diffusion

Pretransition Temperature (Tp)

Pbeta’ und L*beta’ —> Gelphase mit gekräuselter Morphologie (rippled or crumpled Phase), hochgeordneter Zustand Unterschiede in den Querschnittsflächen von Kopfgruppen und FS-Ketten erfordert besondere Packungsgeometrien

Transition temperature (Tm)

Lalpha —> Flüssigkristalline Phase (fluid Phase), Ungeordneter Zustand, Freie laterale Diffusion, hohe Fluktuatuon in den FS-Ketten

• Fettsäure-Struktur der PL (Länge, Gesättigt/ungesättigt (symmetrisch), asymmetrisch gesättigt

• Kopfgruppe der PL, sehr kleine PE, sehr große PC

• Liposomengröße (kleiner Einfluss, max. 4 Grad unterschied)

• Verunreinigungen (Tm wird kleiner und Peaks breiter); sehr empfindlich

Vorteile und Anwendungen:

• sehr empfindlicher Nachweis von Verunreinigungen in der Lipidmembran

• sehr empfindlicher Nachweis von Änderungen in der Lipidpackung (herstellung)

• Interaktion zwischen bspw. Ionen, Molekülen, Proteinen und Lipidmembranen

• Stabilitätsuntersuchungen

Limitationen:

• nur indirekte Informationen zur Struktur und zu Packung der Lipide

• Bedienung und Interpretation erfordert viel Erfahrung

• viele liposomale Lipide zeigen keine Phasenübergänge zwischen 0 und 100 °C

• Lipidsysteme können nur im Gleichgewicht analysiert werden

• Abhängigkeit der Ergebnisse von der Heizrate —> Vergleichbarkeit!

Physikalische Stabilität:

lip. integrity, size distribution, unsaturated FA groups, defects in lattice structure (—> liposome fusion, aggregation and leakage of drug)

Chemical stability:

degradation of natural phospholipids by either peroxidation of double bonds present in acyl chains or hydrolysis of ester bonds linking FAS to the glycerol moiety

Solutions:

for peroxidation: usage of high quality lipids, suitable preperation method and storage condition

to reduce oxidation rate: liposomes must be kept from oygen and light

bei NIRF (Nahinfrarot in vivo Imaging)

• colloidal fluorescent semiconductot nanocrystals, roughly spherical

• NP aus Halbleitermaterial wie Cadmiumselenid (CdSe)

• schützende Schicht aus ZnS, darüber PEG, da CdSe toxisch ist

• am PEG sind Biokonjugarmoleküle wie AK, WS, Protein geknüpft

• nicht biologisch abbaubar! kein photobleading

• ~ 100 nm

• Elektronen im QD sind in Beweglichkeit eingeschränkt ( in alle 3 Raumrichtungen) —> Energie nimmt keine kontinuierlichen, nur diskreten Werte an

• Form, Größe und Elektronenzahl beeinflussbar —> maßschneidern von elektronischen und optischen Eigenschaften

• Stimulation mit UV-Licht

• können unterschiedliche Wellenlängen emittieren —> finetuning

• Die QDs absorbieren das Licht & emittieren Licht mit einer Wellenlänge abhängig von dem Kerndurchmesser (Größere Dots —> länger welliges Licht)

• Breitbandlicht wird eingestrahlt & QDs emittieren nur eine Wellenlänge

• Licht im NIR verwendet: Gewebe besser durchdringt, weniger energetisch & verringert somit rauschen

• Warum QDs? —> klein, können Targets besser erreichen, da die emittierte Wellenlänge von der Kerngröße abhängt kann man sehr gut verschiedene Sachen gleichzeitig mit QDs targeten und zusammen visualisieren

Mikrofluidizer:

• Strömung durch Mikrokanäle

• nach Bldg d. Emulsion wird diese mit hohem Druck durch eine y-förmige Interaktionskammer gepresst

• durch Druck & Auftreten des Emulsionsstroms auf den Auffangbereich wird eine hohe Scherwirkung erzielt

• anschließend Sterilisation, Entpyrogenisierung, Vermeidung von Kreuzkontamination

Filmmethode & Homogenisierung durch Extrusion:

• auf Glaswand eines Rundkolbens ein dünner Film des Lipids Soja-Phosphatidylcholin (gelöst in Ethanol oder Chloroform) aufgetragen

• org. LM wird über Rotationsverdampfer & Hochvakuum entfernt

• Rehydratisierung oberhalb der Phasenübergangstemperatur durch Zugabe von Phosphatpuffer & Calcein

• Bildung unterschiedlich vesikulärer Strukturen

• Extrusion dient der Homogenisierung von MLV-Dispersion

• Dispersion wird unter hohem Druck 21x durch eine Polycarbonatmembran (Porengröße 200 und 80 nm) gepresst

Duale Zentrifugation (DC):

• Bildung, Befüllung und Homogenisierung unter Zusatz von Glaskugeln in einem Schritt

• basiert auf überlagerte Zentrifugationsvorgänge

  • Drehumg um zentrale Achse + zweite Rotationsachse

  • führt zur sehr starken Probenbewegung

  • Abh. von Drehzahl, Durchmesser Doppelrotor (Zentrifugalbeschleunigung) Drehgeschwindigkeit um zweite Achse (Frequenz der Richtungsänderung der ZFG)

• kein Trennverfahren (Gegenteil)

• hohe EE (wird geringen Wasseranteilen zuegschrieben

• in den Prä-Liposomen sind die Wassermoleküle mit den wasserlöslichen WS-Molekülen nur an der Oberfläche der polaren Membran verteilt

• durch DC wird die Oberfläche im Inneren der Liposomen fast so groß wie außen

• Konzentration an verwendetem Lipid

• Lipid-Zusammensetzung

• Beads und deren Material, Menge, Größe

• Zeit und Anzahl der Umdrehungen bei Zentrifugation

enhanced permeation and retention

• Verwendung von PEG-Ketten —> Immunantwort unterbunden —> längere Zirkulationszeit

• in Tumorgewebe entwickelt sich die Vaskulatur im starken Maße neu, durch entsprechende Faktoren, Epithel der Blutgefäße ist dort nicht so dick, Liposom kommt hier durch (in normaler Vaskulatur nicht)

• Akkumulation der Partikel in Gewebe mit Gefäßen erhöhter Permeabilität und verminderter Lymphdrainage = Tumor

Getriggerte Freisetzung

• Externe Trigger

  • magnetische Felder, Licht (Wärme), lokale Hyperthermie (Mikrwowellen, IR, magnetische Wechselfelder)

• Interne Trigger

  • “Endosomal escape” —> Liposom wird über Endozytose aufgenommen —> Endosom —> Lysosom; über pH-Absenkung wird Endosom um Lysosom

  • Liposomen fusionieren direkt mit der Zellmembran und öffnen sich dabei

  • Lip. geben in der Umgebung der Zelle den Inhalt frei, WS geht über Membran in die Zelle

  • Vorteil: Tumor-Position muss nicht exakt benannt und angezielt werden

  • Problem: Lip, welche zum internen triggern präpariert wurden, werden aber bevorzugt vom Immunsystem erkannt

• für Fusion wird eine negative Krümmung benötigt

• Lip. aus CHEMS - (cholesteryl hemisuccinate) und DOPE ergänzen sich

  • CHEMS bei neutralem pH neg. Kopfgruppe

  • DOPE: 2 Ölsäure mit cis-DB

• bei pH Absenkung ändert sich die Anordnung

  • CHEMS: ungeladen, Änderung Molekülform, kompensiert nicht mehr die negative Krümmung —> hexagonale Struktur, negative Krümmung bildet sich & es kann zur Fusion kommen

Passive loading:

• Einschluss der WS bei oder nach Bildung der Liposomen, so dass Konzentration innen = außen gleich

• hinterher den freien WS abtrennen

• geringe EE

• mit hydrophoben & ampiphilen WS: während Filmmethode WS hinzugeben, wenn Lipide noch in org. LM sind; Trocknen und dann bilden sich bereits Bilayer Schichten; wasser o. puffer dazugeben; dann extrusion, high pressure homogenisation

• mit DAC: drug solution + highly concentrated lipid dispersion + glass beads

Active Loading (Remote loading):

• Doxorubicin

• Herstellung von Lip. in Citrat pH 4, Umpufferung zu pH 7,4, Zugabe von Dox bei 65°C

• Dox bei pH 7,4 überwiegend protoniert, aber kleiner Anteil liegt deprotoniert vor & ist damit neutral geladen

• neutral geladenes Dox geht durch die Membran in das Innere, im Lip bei pH 4 wird wieder protoniert & kann deswegen nicht mehr Lip verlassen

• da außerhalb ein GG herrscht, wird wieder Dox deprotoniert & das neutrale geht wieder über die MEmbran in das Lip

• EE = 97%; über die Pufferkapazität des Citratpuffers limitiert

• geht nur bei WS der pkA um die 6, Ladung muss ja verändert werden

• durch Umkehrung des pH-Gradienten kann das Dox wieder rauskommen

• Ammoniumsulfat im Liposom eingeschlossen, außen entfernt, dann Zugabe von Dox

• nach Deprot. geht neutrales Dox über die Membran in das Lip

• Dox wird im Lip wieder protoniert & Ammonium-Ion wird deprot. (Ammoniak entsteht, ist ungeladen & geht durch die Membran nach draußen)

• das prot. Dox im Lip schlägt sich mit dem neg. Sulfat nieder —> Dox-Sulfat = Kristall, fällt aus —> große EE & langsame Abgabe aus Lip, weil es sich dann erst wieder auflösen muss

Membranzerstörung, Zugabe von Ammoniak

• nicht über Endozytose, da PEGylierte Form

• Doxi stabil in “nicht-Krebs-Geweben”

Was ist in Tumoren anders?

• angehobener, verstärkter Stoffwechsel —> verstärkte Glycolyse —> Glutaminolyse (beim Schritt von Glutamin zum Glutamat wird Ammoniak frei

• Ammoniak kann die Zelle verlassen, geht über die Membran

• dieser Ammoniak soll den Prozess des remote Loading umkehren, er geht also passiv rein in das Lip & macht das remote loading rückgängig —> deprotoniertes Dox wird freigesetzt und verlässt das Liposom

Scatter-Plot (2D-Diagramm) —> FSC (Vorwärtsstreulicht) gegen SSC (Seitwärtsstreulicht), Fluoreszenz 1 gegen F2

0,2-150 µm

Anwendung/Assays:

• Streulicht

  • Größe & Granularität (Komplexität interner Strukturen) der Zelle

• FSC (forward scatter): Lichtbeugung an Zelloberfläche —> Größe

• SSC (side scatter): Lichtbeugung an Innenmrembranen —> Granularität

• Vibrator beteiligt —> unterteilt Flüssigkeitsstrom in kleine Tröpfchen; Elektrostatischer Sortiermechanismus mit einer Elektrode; Elektrode belädt fluoreszenzmarkierte Zellen neg., unmarkierte pos.

• Elektrisches Feld sortiert Zelltropfen nach Ladung

• 200 - 20000 Zellen pro Durchlauf; Zellen passieren einzeln einen Laserstrahl (FLusszelle)

• Dabei entsteht Streulicht/Fluoreszenz, was vom DEtektor ausgewertet wird —> Streulichtmenge korreliert mit Zellgröße & Komplexität

• Fluoreszenz

  • Immunophänotypisierung: fluoreszenzmarkierte AK weisen Antigene auf Zelloberfläche nach

  • fluoreszierende Proteine z.B. GFP-Expressions-Analyse: GFP kontrolliert als Reportergen Expression, Plasmid codiert für Enzym & GFP, FACS sortiert Zellen: Fluoreszenz zeigt erfolgreiche Expression

  • Apoptose/Nekrose - ASsays: Annexin V, TUNEL

Multi-Angle Light Scattering

the overall intensity carries information about the molar mass, while the angular dependence within the horizontal plane carries information about the size of the macromolecule.

Ein polarisierter Lichtstrahl besitzt ein elektrisches Feld, welches immer senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahles liegt. Wenn also ein polarisierter Lichtstrahl mit genau einer Wellenlänge auf ein Makromolekül trifft, erzeugt das oszillierende elektrische Feld des Lichtes einnen oszillierenden Dipol im Makromolekül durch die in Schwingung gebrachten Elektronen der äußeren Elektronenhülle. Die Schwingung des Dipols im Makromolekül führt zu einer Lichtabgabe. Dabei werden durch die vergleichbar geringe Energie des eingestrahlten Photons nur Elektronen angeregt und nicht Atome. Die Lichtabgabe hängt maßgeblich von der Größe des erzeugten Dipols ab und damit von der Polarisierbarkeit des Makromoleküls. Bei Erhöhen der Konzentrationen des Makromoleküls beobachtet man eine einfache Abhängigkeit der Konzentration zur Intensität des Streulichtes.

Isotrope MM (direction independent) sind sehr viel kleiner als die Wellenlänge des Lichtstrahles welches zur Messung genutzt wird. Bei ihnen streut das gemessene Streulicht unabhängig vom Streuwinkel gleich und führt dazu, dass der Streumassenradius des Teilchens bei MALS unbestimmt bleibt. Die Moleküle folgen der Rayleighschen Streuformel, das einfallende Licht ist dabei kohärent zum Streulicht und der Streuprozess elastisch.

Bei anisotropen MM streugt das Licht nicht gleichmäßig zu den verschiedenen Detektionsebenen —> mehrere Streuzentren, macht sich bemerkbar durch eine Verschiebung der Phasen der Lichtwelle am Detektor. Durch diese Phasenverschiebung entstehen unterschiedliche Wellenberge und täler der einzelnen Makromolekülteile. Konstruktives addieren oder destruktives subrahieren ist messbar, so streuen große MM mehr Licht nach vorne als nach hinten, in Relation zur Richtung des Anregungslichtes. Genauer bestimmt man den Trägheitsradius, ist der massegewichtete mittlere Abstand der Massenpunkte eines Moleküls vom masseschwerpunkt.

Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung

Durch Anschließen Charakterisierungstool, erhält man Infos über Molmasse, Polydispersität, Größe, Form oder Dichte der Partikel

Nanogrößenbereich

Trennung der Partikel in einer Probe durch flüssigen parabolischen Strom und einem Querstrom, welcher durch einen Kanal fließt. Der Trennungskanal besitzt 3 Ein-/Auslässe, auf der Bodenplatte befindet sich eine Membran. Zudem wird der Kanal durch einen Deckel verschlossen. Die Trennung in diesem Kanal erfolgt nach einem initialen Fokussierungsschritt. Hier wird die zu untersuchende Probe durch einen Einlass eingebracht. Gleichzeitig werden 2 gegenläufige Flüssigkeitsströme so eingestellt, dass diese in einem Bereich, der Fokusebene aufeinandertreffen —> sorgt dafür, das die zu untersuchende Probe in einer art “Anfangszone” konzentriert wird, sodass die Partikel sich nicht von der Trennung im Kanal verteilen.

Anschließend erfolgt die Trennung im parabolischen Strom, während der Querstrom eine Kraft erzeugt, welche die Probenpartikel an die Membran drückt. Der parabolische Strom transportiert die Partikel gleichzeitig in Richtung outlet. Die erzeugte Kraft sorgt dafür, dass die Partikel direkt oberhalb der Membran höher konzentriert sind als im restlichen Kanal.

Kleinere Partikel haben nach Stokes-Einstein einen höheren Diffusionskoeffizienten, sodass deren Diffusion als Gegenkraft zum Querstrom dafür sorgt, dass sich die kleineren Partikel weiter von der Membran entfernen und hin zur Kanalmitte diffundieren. Somit vergrößert sich deren Abstand zur stationären Phase, was wiederum dazu führt, dass die kleineren Partikel schneller durch den parabolischen Fluss in richtung outlet transportiert werden bzw. eine geringere Retention aufweisen und damit schneller eluieren als die großen. Sobald die Partikel eine Größe von 1 µm überschreiten, dreht sich das Elutionsverhalten um. Denn auf Grund sterischer Ursachen erhöht sich der Abstand zwischen großen Partikeln und der Membran im Vgl zu kleinen Partikeln. Somit werden die großen Partikel schneller durch den Elutionsfluss transportiert und eluieren in diesem Fall vor den kleinen Partikeln.

Die Retentionszeit ts ist abhängig von dem Diffusionskoeffizient D, der Kanaldicke w, der Querströmungsgeschwindigkeit Fc und der Detektorflussrate Fout.

Der hydrodynamische Radius der zu untersuchenden Teilchen kann durch die Stokes-Einstein-Gleichung berechnet werden.

1) Mikroskopische Methode

o Manuell: Okularmikrometer und Stoppuhr

o Automatisch: Videokamera und softwarebasierte Auswertung

2) LDA

ist ein berührungsloses optisches Messverfahren zur punktuellen Bestimmung von Geschwindigkeitskomponenten in Fluidströmungen (Flüssigkeiten oder Gase). Hierbei wird ein Laserstrahl mit Hilfe eines Strahlteilers in zwei Strahlen aufgeteilt. Am Messpunkt kreuzen sich diese Strahlen wieder und es entsteht im Kreuzungsbereich ein Interferenzstreifenmuster. Ein Partikel, das sich zusammen mit dem Fluid durch das Streifenmuster bewegt, generiert in einem Photodetektor ein Streulichtsignal, dessen Frequenz proportional der Geschwindigkeitskomponente senkrecht zu den Interferenzstreifen ist. Dabei handelt es sich um Schwebung zwischen dem unterschiedlich dopplerverschobenen Streulicht beider Laserstrahlen. Durch Kombination von drei Laser-Doppler-Systemen mit unterschiedlichen Laserwellenlängen können so punktuell alle drei Strömungsgeschwindigkeitskomponenten erfasst werden.

An antibody is coupled to a PEGylated gold nanoparticle through EDC/NHS chemistry. A reactive ester is created from a carboxyl group. Primary amines present in an introduced antibody react and covalently bind to the ester, without addition of a spacer [20].