Wie kann man Mutationen nachweisen?
Surveyor Assay / T7-Endonuklease
Mutation einer Schnittstelle
Anreicherung editierter Sequenzen
Nachweis einer Deletion
Sequenzieren
Was ist eine Surveyor Assay / T7-Endonuklease?
Untersuchung nach Mutationen
-> Kleine Indels und Fehlpaarung
Es wird DNA isoliert
Amplifiziert und Denaturiert
Bei Annealing können Heteroduplexe entstehen, wobei ein Mismatch ist
T7-Endonuklease schneidet, wenn ein Mismatch ist (Heteroduplex)
Wie kann man Mutationen in einer Schnittstelle nachweisen?
Cas9 und sgRNA werden hinzugegeben
Templates mit Mutation werden nicht geschnitten
-> Mutierte haben nicht die Richtige Schnittstelle
DNA wird Amplifiziert
Wie kann man Mutationen nachweisen, wenn es keine Restriktionsschnittstellen in der Zielsequenz gibt?
Mittels CRISPR/Cas9 (Ribonucleoprotein complex = RNP) nicht editierte Sequenzen zerschneiden
PCR um editierte Sequenzen anzureichern
Wie kann man eine Deletion nachweisen?
Mittels PCR können größere Deletionen nachgewiesen werden
Auf dem Agarosegel entstehen Banden mit weniger Bp
Wie kann man eine Mutation mittels Sequenzierung finden?
PCR-Produkt Sequenzieren lassen
Mittels Software oder per Hand mit anderen Sequenzen vergleichen
Funktioniert gut bei diploiden Pflanzen, da dort nur maximal zwei Peaks sein können
Bei höheren Ploidiestufen schwierig
Was ist das Amplicon sequenzing?
Ein Zielbereich aus dem Genome wird amplifiziert (PCR)
Sequenzen werden mittels ILUMINA-Sequenzierung aufgelöst
Bsp.:
-> 100 Pflanzen sollen sequenziert werden
-> Jede Pflanze bekommt einen Primer mit Barcode
-> Alle Sequenzen können in ein Gefäß gemischt werden
Qualitativ und quantitativ
Wie bekommt man das Genome Editing Werkzeug in die Zelle?
Welches Gewebe kann ich transformieren?
-> Ziel kompletter Organismus oder Einzelzellen?
Darf der Organismus transgen sein?
Welche Methoden der Transformation gibt es?
Über welche zwei Methoden kann CRISPR/Cas in die Ziel Zelle eingebracht werden?
Was sind die Vorteile CRISPR/Cas als Protein einzubringen?
Codon-usage muss nicht beachtet werden
keine Integration eines Transgens ins Zielgenom
Aktivität wird auf kurze Zeit fokussiert (weniger off-targets)
-> Proteine werden mit der Zeit abgebaut
TALEN oder Cas9
Cas9 + sgRNA = Ribonukleoprotein (RNP)
keine Klonierung nötig (Protein & sgRNA kaufen)
Wie kann CRISPR/Cas mittels Viruspartikel transportieren?
Cas9 und tRNA-sgRNA-tRNA in virales Genom integriert
-> wenn tRNA drinne ist, wird es auf jeden Fall prozessiert
über Agrobacterium eingebracht -> systematische Ausbreitung
Wie funktioniert die Induktion durch Meristemgewebe?
Meristemgewebe abschneiden
Agrobacterien darauf träufeln
Neues Gewebe aufsetzen
Es kommen genomeditierte Samen heraus
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