Wie ist die Cas9-Struktur?
Besteht aus 2 “Flügel”
-> REC : recognition
-> NUC : nuclease
Was ist die eSpCas9?
verringerte Affinität zum “non-target” Strang
Erzeugung einer positiv geladenen Spalte, worin der non-target Strang stabilisiert wird
Tausch von AS durch Ala
Was ist die SpCas9-HF1?
Verringerte Affinität zum “target”
Wasserstoffbrücken vom Cas9-Protein zum Phosphatgerüst der DNA
Extrem geringe off-target Aktivität
Was ist die HypaCas9?
die nicht katalytische Domäne (REC) in SpCas9 überwacht die HNH-Nuklease
REC3-Bindung am RNA-DNA-Duplex re-orientiert REC2 und erlaubt HNH Orientierung zum aktiven Zentrum
Hypa-Spezifität +/- so gut wie Gas9-HF1 und eCas9
Was ist das Problem an den Varianten?
Die Bindeenergie wurde verringert
SpCas9-HF1 und eSpCas9 funktionieren nicht, wenn die sgRNA am 5`Ende nicht passt
-> 1 mismatch = Bindeenergie zu gering
Lösung: Exakte Prozessierung der sgRNA
Was ist die Sniper-Cas9?
haben verkürzte und nicht komplett passende sgRNAs
Was ist die xCas9?
Hat eine breitere PAM-Erkennung
Erkennt nicht nur NGG als PAM
Was ist die SpCas9-NG?
Mutation innerhalb der PAM Erkennung
niedrigere Aktivität, aber PAM NG
Hat die breiteste PAM-Erkennung
Probleme:
-> schneidet und mutiert die sgRNA in der T-DNA
-> veränderte Zielsequenzen
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