5B

• Beide katalytischen Domänen sind mutiert, sodass sie nicht schneiden

• Aspartat an Position 10 in Alanin

• Histidin an Position 840 in Alanin

• dCas9 kann trotzdem an Zielsequenz binden

• Fusion mit:

  -> Basen-Editoren

  -> Aktivatoren, Repressoren

  -> Epigenom-Modifikation

  -> Chromosom painting

• Ein einzelner Aktivator macht nicht viel

• Mehrere Aktivatoren sind stärker als die Summe der Einzelaktivitäten

• Bsp:

  -> A1 = 10; A2 = 20, A3 = 30

  -> Zusammen eigentlich 60 aber durch die synergistischen Effekte 70

• dCas9-Aktivator

• SAM = Synergetistic activation mediator

• Aktivator wird nicht nur am Protein, sondern auch an der gRNA gebunden

• Einbringung von Loops in die gRNA

  -> Aktivierungsdomän können an die Loops binden

• Repression in prokaryotischen Zellen über sterische Blockade

• Repression in eukaryotischen Zellen mit Effektordomäne KRAB, welche weitere Proteine heranzieht, damit die DNA methyliert wird oder Histone kommen

Idee: Eine direkte Veränderung des Chromatin-Zustands könnte effizienter Genexpression aktivieren oder reprimieren, als die indirekte Aktivität über Aktivierungs-/Repressordomänen

• Acetylierung durch p300 -> Aktivierung der umliegenden Promotoren

• Demethylierung durch LSD1 -> Promotoren weniger zugänglich

• Idee: direkte Veränderung der DNA-Basen

• Vorteil: keine zufälligen Änderungen durch NHEJ oder HDR

• Bsp:

  -> Cytidin-Deaminase: Katalysieren Cytidin in Uridin

  -> Funktionieren nicht an dsDNA

  -> Cas9 entwindet DNA!!

• In einem Abstand von der PAM -15 +/-2

Problem 1

• Cytosin kann auch spontan desaminieren

  -> Deswegen gibt es Reparatursysteme

Mismatch-repair entfernt Uracil aus DNA

-> Uracil-DNA-Glycosylase (UDG)

Lösung: Uracil-DNA-Glykosylase-Inhibitor (UGI)

-> Nur lokal wirksam als Fusionsprotein an dCas9

Problem 2

• Der Template-Strang hat immer noch Guanin

  -> Läuft Replikation rüber, nur 50% editiert (1 Strang)

Lösung: Verwendung einer nCas9

-> Strang der nicht editiert wird, wird geschnitten

-> Wenn ein Strang genickt ist, heißt es für die Zelle, dass dort etwas nicht stimmt und repariert werden muss

• ABE7 kann T/A -> C/G

• Adenosin wird dabei deaminiert zu Inosine

• Inosine kann mit Cytidine paaren

• Inosin wird durch DNA-Glykosylase repariert

• höhere Effizienz

  -> Längere Linker, zwei UGI hintereinander

• wenige “indels”

  -> Längere Linker, zwei UGI hintereinander

• alternative Baseneditoren

  -> Enzym AID verschiebt das Editierungsfenster

  -> Normal bei -15 +/-2 und durch AID bei -18 +/-2

• verändertes PAM-Spezifität

  -> Cas9-Varianten mit anderer PAM-Spezifität

• kleineres Editierungsfenster

  -> mutierte Cytidin-Deaminase

• höhere Spezifität

  -> Kombination mehrere Varianten

• weniger off-targets

  -> mutierte Cytidin-Deaminase

• aktivierbar

• Expressionsoptimierung

  -> NLS: Kernlokalisation

  -> Codon usage anpassen

  -> Deaminase optimieren

• Breiteres Editierungsfenster und Aktiver

  -> TadA-Deaminsase evolviert

  -> kein nick nötig

• Fusion aus C-Editor + A-Editor + nCas9

• gleichzeitige Editierung von C und A in Zielregion

  
  

• Cas9 schneidet an einer Stelle DSB

• An anderer Stelle wird ein C zu U, welches entfernt wird

• Dadurch kommt es zu einem Nick und der gesamte Teil kann entfernt werden