7A

• Erbkrankheiten können auf Mutationen von Mitochondrien-DNA beruhen

• >60% in heteroplasmatischen Zellen zur Krankheit

• ZFN oder TALEN können Mitochondrien-Importsignal haben

• keine Reparatur der DNA in Mitochondrien, DSB triggert Abbau oder große Deletionen

• Spezifischer DSB -> Mitochondrien spezifisch entfernt

  
  

• mtZFNs

  -> können in Mitochondrien schneiden

  -> Zwei FokI-Nukleasen über Spacer an einer ZFN

• mitoTALENs

  -> Haben Mitochondriales Lokalisation Signal (MLS)

  -> Zwei-Monomere mit getrennten FokI

• mitoTEV-TALENS

  -> haben MLS

  -> Brauchen nur ein TALEN-Protein

  -> Haben I-TevI Nuklease

  -> Kurze TAL -> höhere Fehlpaarung

• Bakterielles Toxin DddA

  -> Ist eine dsDNA-Deaminase

• DddA ist geteilt in zwei Hälften

  -> C- und N-terminal

• Hälfen fusionieren an der Zielsequenz

• DdCBE kann gezielt Mitochondriengenome editieren

  -> Fusion aus DddA und TALE

• Vorteile

  -> Keine RNA benötigt

  -> exakte Positionierung (keine PAM)

• Bakterien werden resistent gegen Phagen durch vorhandenen Prophagen

  -> Prophage = Eingebaute Phagen DNA im Genome

• Verschiedene Gene in Prophagen inhibieren das CRISPR I-F System

• Proteine heißen Acr

• Können Bindung von CRISPR an Zielsequenz verhindern oder die Nuklease Aktivität inhibieren

• Sie binden in Cas9 an der DNA-bindenden Region

• AcrVA5 ist ein Enzym

• AcrVA5 acetyliert Cas12a in der PAM-interagierenden Domäne

• Der acetylierte K635-Rest verhindert die PAM-Erkennung

• Niedermolekulare Verbindungen zur Hemmung der Cas9-Aktivität

• Zell-permeabel, <500kDa

• Cas9 und dCas9-AD sind hemmbar

• hemmt die Bindung des Cas9-sgRNA-Komplexes an der DNA

• 
  

• anti-CRISPR = Proteine

• CRISPR-Inhibitoren = Chemische Verbindungen

• Kill-switch für Genome Editing Aktivität

• verringert off-target Aktivität

• gewebespezifische Aktivität

(Kontrolle des anti-CRISPR durch miRNA)

Ein Kill Switch ist ein genetischer Schaltkreis, der zur selektiven Eliminierung eines GVO verwendet wird. Der GVO soll in seinem definierten Bereich bleiben. Verlässt er den definierten Bereich, wird ein genetischer Schalter ausgelöst, der zum Tod des Mikroorganismus führt.

• Klasse 1 (90%) und Klasse 2 (10%)

• Gemeinsamkeiten 4 Funktionen

  -> Adaptation (Anpassung an Umwelt)

  -> Expression

  -> Interferenz (Konkurrenz)

  -> Signaltransduktion (Übertragung)

• Unterschiede:

  -> Verschiedene Anzahl an Proteinen

  -> Funktionen sind in Klasse I auf verschiedene Moleküle verteilt

-> Klasse 1 = Multi-subunit effector complexes

-> Klasse 2 = Single-protein effector modules

• Transposons die mittels CRISPR-Cas in das Genome eingebaut werden

  
  

• Es wird ein TniQ-Cascade-Komplex gebildet

• Dieser sucht die Zelle nach passenden DNA-Zielstellen ab

• Komplex bildet eine R-Schleife und rekrutiert TnsC

• Transposon wird am Ende von TnsA und TnsB gebunden und bildet paired-end-complex

• Transposon wird in einem bestimmten Abstand eingebaut

• Cas𝚽

• crRNA zielt auf andere Phagen oder Wirts-DNA

• keine Proteine zum Erwerb neuer crRNA

• 70-80kDa (halb so groß wie SpCas9)

• keine tracrRNA

• PAM = TTN

• Spacer = 14-20 nt

• schneidet mit 8-12 nt Überhang

• Nuklease RuvC = CACG Überhang