Mibi pr Sero 1

Wie wird verdünnt?

·       Serum:  1:50 (50µl Serum, 2,45 ml PBS/phys. NaCl)

·       Kontrollseren: 1:10 (bereits 1:5 vorverdünnt)

·       50 µl + 0,45 ml PBS

Kontrollen

Positivkontrolle

·       Kontrolle Testablauf, bekannter Titer, Kontrolle der Ag-Agglutinationseigenschaft, bearbeiten wie Probe

Ag-Kontrolle

·       50 µl Ag+ 50 mikrol PBS

·       Kontrolle auf Spontanagglutination

·       Reaktionsbild(RB): Sedimentation

Fehlerquellen

·       Grobe Fehler im Versuchsansatz ( Verdünnungs-/Pippettierfehler, Plasma statt Serum, falsche Inkubationsbedingungen)

·       Antigenlösung nicht gemischt/Dichte falsch

·       Spontanagglutination

·       Änderung (Verlust der Ag-Agglutinationseigenschaft)

Wie wird ausgewertet?

Pos: Agglutination

Neg: Sedimentation

·       Titer: maximale Sedimentverdünnung mit Agglutination

·       Titerangabe= TiterENDverdünnung

Referenzbereich  àNeg: < 1:200 ; Pos: > 1:200

·       Mit Widal werden IgM+ IgG-AK bestimmt, nicht IgA

·       Nur Akutdiagnostik mittels Titerdynamik (4-facher Titeranstieg (10-14d) möglich

·       Chronische/postinfektiöse Immunpathologische Immunreaktionen zeigen eine spezifische IgA-Persistenz àist mit Widal nicht detektierbar àIgA/IgG mit Immunoblot

·       Kreuzreaktionen beachten (Brucellen, andere Enterobakteriaceae, Stenotrophomonas, Vibrio cholerae)

Antikörper

Gegen Yersinia, Enterocolitica [0:3, 0:9], Yersinia pseudotuberculosis [T:1]

Antigen

Passende Yersinien-Bakteriensuspension

Nachweisreaktion

Agglutination

Durchführung

Prinzip

·       Serum 1:50 in PBS verdünnen

àVermeiden des Prozonenphänomens, diagnostischer Bereich

·       Verdünnungsreihe in Mikrotiterplatte 1:50- 1:1600 in 50 µl PBS

·       Inkubations 37°C/ 16-20h/ feuchte Kammer

àAg-AK-Komplexbildung d.h. Yersinia-AK binden an passendes Ag

·       Agglutination bildet sich wenn keine spezifischen AK vorhanden sind sedimentiert das Ag-Komplex

Wie wird verdünnt?

·       Serum: 1:100 in Imidazolpuffer (10 µl Serum, 990 µl Imidazol)

·       0,05% H2O2 aus 30% H2O2:

·       1:600 + 3,3 µl 30% H2O2 + 1996,67 µl (ca 1996,7 µl A.D.)

·       Während Verdünnung Handschuhe tragen, danach nicht mehr)

1.       2ml A.D in Epi

2.       -3,3 µl A.D.

3.       + 3,3 µl 30% H2O2

Kontrollen

·       Kontrolle Testablauf, bekannter Zielwert, bearbeiten wie Probe

Fehlerquellen

·       Grobe Fehler im Versuchsansatz ( Verdünnungs-/Pippettierfehler, Plasma statt Serum, falsche Inkubationsbedingungen)

·       DNA-haltiges Substrat nicht vollständig gelöst

·       Ag nicht auf Rüttler gelöst

·       Statt Imidazolpuffer andere Verdünnungslösung verwendet

·       Falsch positive Ergebnisse bei lipämischen Seren (Lipoproteine hemmen Enzymaktivität)

Wie wird ausgewertet?

Pos: blaue Färbung im Well

Neg: rote Färbung im Well

·       Abgelesen wird die letzte Verdünnung mit positivem Reaktionsbild: blaue Färbung

·       Tabelle zur Auswertung verwenden

Ergebnis+ Interpretation

RB: Erw. pos > 200 IU/ml; Kinder pos >300 IU/ml

·       In Kombination mit Anti-Streptokokken-O-Test bewertet

àASL-Titer steigt innerhalb einer Woche nach Infektion an. ASDB-Titer steigt später an, ist länger nachweisbar

Gruppe C+G-Streptokokken können ähnliche Folgeerkrankungen hervorrufen und führen ebenso zu erhöhten ASL & ASDB-Werten

Antikörper

Anti-Streptokokken-DNase

Antigen

Streptokokken-DNase B

Nachweisreaktion

Neutralisationsreaktion

Durchführung

Prinzip

·       ADN-Substrat in 3,5 ml A.D. lösen, 10 min stehen lassen, gut mischen; muss vollständig aufgelöst sein

·       Serumvorverdünnung 1:100 im Imidazolpuffer

·       75µl in alle Wells des Streifens pipettieren

·       1 min leicht schütteln, auf Rüttler

àAg befindet sich in Röhrchenboden; wird gelöst

·       Inkubation: 15 min/37°C/Streifen abkleben

·       bei Vorhandensein von Anti-Strep.-DNase in Probe àBildung Ag-AK-Komplex

       àAg wird neutralisiert

·       keine speziellen AK in Probe

àkeine Neutralisation

·       75 µl ADN-Substrat pro Well

àADN-Substrat enthält blau gefärbte DNA

·       Inkubation: 30 min/ 37°C/Streifen abkleben

ànicht-neutralisierte Ag kann die DNA hydrolysieren=Rotfärbung = neg Reaktionsbild

àNeutralisierte Ag kann DNA nicht hydrolysieren= Blaufärbung bleibt erhalten= pos Reaktionsbild

·       30 µl 0,05%iges H2O/Well

·       Inkubation: 2h /37°C/Streifen zukleben

Wie wird verdünnt?

·       Serum 1:5

=20 µl Probe

+20 µl Reiterspirochäten-Abs-Medium

+ 60 µl Rheumafaktor-Abs-medium

Kontrollen

Pos.+ Neg. Ko

·       Kontrolle Testablauf, bekannter Titer, Kontrolle der Waschvorgänge

Pos: quantitativ

Neg: qualitativ

àbearbeiten wie Probe

Leerwerte

·       AbsmediEN bzw. PBS statt Probe auftragen àweiter wie Probe behandeln

·       Absmedien/PBS werden auf unspezifische Peaktion mit FITC getestet

·       RB: kein Leuchten v. T. pallidum

Fehlerquellen

·       Grobe Fehler im Versuchsansatz ( Verdünnungs-/Pippettierfehler, Plasma statt Serum, falsche Inkubationsbedingungen)

·       Beschickung des OT beschädigt

·       Nachweisreagenz nicht im Dunkeln inkubiert

·       OT ausgetrocknet

·       Waschschritte nicht korrekt eingehalten (nicht PBS pH 7,2) verwendet àLeuchtkraft des FITC wird im sauren Milieu gehemmt

·       Falsches Eindeckungsmedium verwendet (auf Glycerinbasis, pH Wert beachten)

Wie wird ausgewertet?

·       Mit Fluoreszenzmikroskop

Pos.: T. pallidum leuchtet apfelgrün

Neg: T. pallidum zeigt kein /geringes Leuchten

·       Titer: Fluoreszenzleuchtkraft der einzelnen Verdünnungen miteinander vergleichen, stärksten Leuchtkraftabfall beachten (Titergrenze). Titer ist die maximale Serumverdünnung die noch positiv bewertet wird

·       Titerangabe: Serumverdünnung

Referenzbereich: neg < 1:10; grenzwertig <1:10- 1:20; pos >1:40

·       Diagnostik einer Akuten behandlungsbedürftigen Infektion

·       Krankheitsverlaufskontrolle/Therapieerfolg mit Anti-Cardio-lipintest (RPR)

·       Meldepflichtig (Meldung einer ansteckenden Geschlechtskrankheit)

Antikörper

·       IgM-AK gegen T. pallidum

Antigen

·       T. pallidum auf OT

Nachweisreaktion

·       Indirekter Fluoreszenztest

Durchführung

Prinzip

·       Serum 1:5 in Reiterspirochäten + Rheumafaktorabs-medium verdünnen

Abs-Medium: enthält T. phagedenis (Reiterstamm),

kreuzreagierende AK werden durch Absorption an T. phagedenis entfernt

·       Zentrifugation: 3000 rpm/5m

·       Spezifische AK gegen T. pallidum werden nicht gebunden, Testspezifität wird dadurch erhöht

·       Vorbehandlung mit RF-Absmedium (Anti-Human-IgG) bewirkt die Entfernung der IgG-AK und der daran gebundenen IgM-RF(IgM-RF= Auto-AK die gegen Fc-Teil von IgG gerichtet sind . Antihuman IgM würde daran binden = falsch pos. Ergebnisse)

·       Verdünnungsreihe anlegen

·       1:10-1:280 in 50 µl PBS

·        

·       OT beschicken mit je 25 µl Serumverdünnung

·        

·       Inkubation: 60 min/37°C/Feuchte kammer

àAg-AK-Komplexbildung, d.h. Syphilis-AK bindet an T. pallidum auf dem OT, keine AK-Bildung wenn Probe negativ

·       Waschen 2x 5 min in PBS

ànicht gebundene Serumbestandteile werden entfernt

·       25 µl Konjugatlösung FITC

àKonjugat=AntiHuman-IgM/FITC bindet an den Syphilis- IgM-AK der Ag-Ak-Komplexe und markiert diese mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC

·       Keine Markierung wenn Probe negativ

·       Inkubation 30 min/ 37°C/feuchte Kammer/lichtgeschützt

·       Waschen 2x 5 min in PBS

·       Nicht gebundenes Konjugat wird entfernt

·       Einbetten

·        

·       Fluoreszenzmikroskopiebeurteilung

·       Bestrahlung mit UV-Licht(kurzwellig, energiereich) FITC nimmt Energie auf und gibt sie als Licht einer anderen Wellenlänge wieder ab (langwellig, energiearm) àapfelgrünes Leuchten der Ag

Wie wird verdünnt?

·       Serum 1:5 (bereits 1:4 vorverdünnt) àEndverdünnung 1:20

·       20 µl Serum + 80 µl Serumdiluent

Kontrollen

Positivkontrolle

·       Kontrolle Testablauf; bekannter Titer; bearbeiten wie Probe

Serumkontrolle(SK)

·       25 µl Serumverdünnung (1:20); 75 µl nichtsensibilisierte Erys

àKontrolle auf unspezifische Agglutination

àRB: Sedimentation

Partikelkontrolle

1.       25 µl Probenverdünnungspuffer + 75 µl nichtsensibilisierte Erys

2. 25 µl Probenverdünnungspuffer + 75 µl sensibilisierte Erys

àKontrolle Spontanagglutination

àRB: Sedimentation

Fehlerquellen(5)

·       Grobe Fehler im Versuchsansatz [3] ( Verdünnungs-/Pippettierfehler, Plasma statt Serum, falsche Inkubationsbedingungen)

·       Dichte der Erysuspension falsch (nicht aufgeschüttelt)

·       Platte erschüttert

·       Spontanagglutination àPuffer+Erys

·       Unspezifische Agglutination (AK+ Erys ohne AG)

Wie wird ausgewertet?

·       Pos: Hämagglutination gleichmäßig über den ganzen Boden des Wells verteilt

·       Neg: Sedimentation

·       Titer: maximale Serumendverdünnung mit Hämagglutination

·       Titerangabe: SerumENDverdünnung

Antikörper

Gegen T. pallidum (Syphilis)

Antigen

T. pallidum auf Vogelerys

Nachweisreaktion

Passive Hämagglutination

Durchführung

Prinzip

·       Serum 1:20 in Probeverdünnungspuffer verdünnen

àvermeiden des Prozonenphänomens

·       Verdünnungsreihe Mikrotiterplatte

1:20-1:2560 in 25 µl Probenverdünnungspuffer

+ 75 µl Ag àEndverdünnung 1:80-1:10240

·       Inkubation: RT mind. 45min Erschütterungsfrei

àAg-Ak-Komplexbildung, d.h. Syphillis-AK bindet an T. pallidum Vogelerys. Es bildet sich eine Agglutination wenn keine speziellen AK vorhanden sind, sedimentiert das Ag/Vogelerys= Knopfbildung

Wie wird verdünnt?

1:100

·       Serum 10 µl, Probendiluent 990 µl

Kontrollen

Pos. + neg. Kontrolle(gebrauchsfertig)

·       Bearbeiten wie Probe, Kontrolle Testablauf mit Hilfe der Testkriterien

Standardserum (gebrauchsfertig)

·       Bearbeiten wie Probe, aber Doppelwertbestimmung

Fehlerquellen(5)

·       Grobe Fehler im Versuchsansatz [3] ( Verdünnungs-/Pippettierfehler, Plasma statt Serum, falsche Inkubationsbedingungen)

·       Beschickung am Röhrchenboden beschädigt

·       Chromogensubstrat nicht in Dunkeln gelagert und inkubiert (bei Gelbfärbung kann Vorverwendung die Extinktion bei 405 nm gegen A.D. gemessen werdenà0,25 Reagenz verwerfen)

·       Streifen ausgetrocknet

·       Waschvorgänge nicht beachtet

Wie wird ausgewertet?

·       Photometrische Auswertung: 405 nm

·       Testkriterien beachten

--

1. O.D. 405 nm Mittelwert des Standardserums ermitteln (O.D. Abweichen der Einzelwerte vom Mittel innerhalb +/- 20%)

2. Extinktion Substratleerwert <0,25

3. Nach Auswertung muss Standard innerhalb des chargenspezifischen Gültigkeitsbereichs liegen

4. nach Auswertung müssen Kontrollen pos/neg erscheinen

·       Mutterschaftsvorsorge, Überprüfung Immunität

·       Referenzbereich

àkeine Immunität <10 IU/ml

àImmunität >15 IU/ml

àImmunität fraglich 10-15 IU/ml

·       Diagnostik einer frischen oder kürzlichen Infektion durch Nachweis der AVIDITÄT möglich

Antikörper

Rötelnvirus IgG-AK

Antigen

Rötelnvirus, am Röhrchenboden

Nachweisreaktion

Indirekter Enzymimmunoessay

Durchführung

Prinzip

·       Probe 1:100 mit Probendiluent verdünnen

àa 100 µl in beschickte Röhrchen

àLeerwert auf A1

·       Inkubation: 1h/37°C/Streifen zukleben

àRöhrchen sind mit Rötelnvirus beschickt

·       Nach Zugabe der Probe binden eventuell vorhandene spezifische Rötelnvirus AK an die Ag

·       Keine Komplexbildung wenn Probe negativ

·       Waschen: 4x 0,3ml

+ 100 µl Enzymtracer= antiHuman IgG/AP

àLeerwert auf A1

ànichtgebundene Serumbestandteile werden entfernt

·       Inkubation: 30 min/37°C/Streifen abkleben

àAntihuman-IgG bindet an gebundene Rötelnvirus-IgG-AK und markiert diese mit AP

·       Keine Enzymaktivierung, wenn Probe negativ

·       Waschen: 4x 0,3ml

+ 100 µl Substrat (p-Nitrophenylphosphat)

ànicht gebundene Antihuman-AK werden entfernt

·       Inkubation: 30 min/37°C/Streifen abkleben/lichtgeschützt

+100 µl Stoppreagenz

àIndikatorreaktion: AP hydrolysiert das Substrat, dabei entsteht Phosphat+ gelbes p-Nitrophenol

àNatronlauge erhöht pH-Wert. Dadurch wird AP inaktiviert und somit die Indikatorreaktion gestoppt

·       Photometrische Messung, 405 nm

àIntensität der gelben Farbe wird gemessen, diese verhält sich proportional zu AK-Menge in Serum