Molekularpathologie und Immunhistochemie

• interdisziplinärer Bereich der Pathologie (Pathologen, Biologen, Bioinformatiker, MTA)

• fester Bestandteil der pathologischen Diagnostik

• untersucht genetische Veränderungen in Bezug zur Histologie (Molekularbiologische Analysen)

• “State of Art” der modernen Tumordiagnostik

• Molekulare Erregerdiagnostik (Bakterien, Pilze, HPV-Viren)

• Hämatoonkologie (Tumore des Blut- und Lymphsystems)

• Molekulare Untersuchungen von soliden Tumoren

  • Treibermutationen -> können Tumor hervorrufen, z.B. Mutationen in Onkogenen

  • Resistenzmutationen -> treten im Laufe einer Therapie auf, Tumor wird gegen das Medikament ressistent

das Krankheitsbild gleicht sich, jedoch ist das genetische Profil unterschiedlich

• kann auch innerhalb eines Tumors auftreten

  -> inhomogener Aufbau, jeder Anteil kann verschiedene Mutationen aufweisen

Onkogene Treibermutationen sind Mutationen, die für das Tumorwachstum verantwortlich sind

Prädiktive Biomarker sind auf Mutationen untersuchte Gene; Diagnose, Prognose und Therapieansprechen stehen in Zusammenhang mit spezifischen Mutationen

Targeted Therapies sind Therapien mit Wirkstoffen, die auf bestimmte Tumoreigenschaften gerichtet sind

-> es sollen nur Tumorzellen, nicht das umliegende gesunde Gewebe angegriffen werden

• Polymerase- Kettenreaktion (PCR)

• Kapillargelelektrophorese

• Sanger-Sequenzierung

• Pyro-Sequenzierung

• Next Generation Sequencing (NGS)

• bei FFPE-Gewebe (Formalin fixiertes, Paraffin eingebettetes Gewebe)

• durch Formalinfixierunh schwere Zugänglichkeit genomischer DNA

• geringe Ausgangsmengen an DNA

• Paraffinierung kann zu Schäden an DNA führen (z.B. Strangbrüche)

Vorgehen:

• Isolation von DNA aus FFPE-Schnitt

• PCR

• Sequenzierung

1. Denaturierung bei 95°C

2. Primer Annealing bei 50-60°C

3. Elongation bei 72°C

-> über eine Zyklenzahl n

-> logarythmische Amplifikation (2^n)

Zugabe von

• genomische DNA

• hitzestabile taq-Polymerase

• Oligonukleotide (Primer)

• Desoxynukleotide (dNTPs)

• Analyse der Fragmentgröße der PCR-Produkte

• Qualitätsanalyse nach PCR-Reaktion

• Erregerdiagnostik

• Klonalitätsanalysen (B-und T-Zellen)

• PCR Fragment zu Primer und DNA-Polymerase gegeben

• Zugabe von Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden (floureszensmarkiert)

• Kettenabbruch durch 2`-3`-Desoxyribose -> PCR-Fragmente unterschiedlicher Länge

• Analyse mit Gelelektrophorese ider Elektroferogramm

-> Mutationssuche in einem größeren Genbereich (bis 1000bp)

-> Detektionslimit 15-20% -> ca 1/5 des Tumors muss die Mutation tragen, damit sie mit der Sanger-Sequenz detektiert werden kann

• Detektion von Punktmutationen in kleinem Genbereich (muss bekannt sein)

• schrittweise Analyse der Gensequenz:

  • DNA-Polymerase mit Lösung aus einem dNTP (-> anschließend gewaschen, nur richtiges bindet)

  • bei richtiger Bindung Abspaltung PP -> Umwandlung in ATP durch Sulfurylase

  • Umwandlung von Luciferin mit ATP in chemolumineszentes Oxoluciferin mittels Luciferase -> Lichtblitz bei korrektem dNTP

• Rückschlüsse auf Vorliegende Basensequenz (Diagramm mit Peaks, Angaben der Basen in %)

• Mutationen ändern die prozentuale Verteilung der Basen

• Dauer: wenige Stunden

• Detektionslimit: 5% mutierte Allelfrequenz

• Hochdurchsatzverfahren (mehrere Sequenzierungen zeitgleich)

• gezielte Gene oder ganze Genome möglich

• Detektion von komplexen Mutationen in mehreren Genbereichen

• komplexe Vorbereitung, lange Sequenzierung (3-4Tage)

Vorgehen

• fragmentierte genomische DNA

• Zugabe von Adaptoren (kurze, bekannte Nukleotidsequenzen, binden an 5´und 3´-Ende

• Bindung an Fließzelle über die komplementären Sequenzen zu den Adaptoren

• Brücken-Amplifikation

• Dissoziation

• Einteilung in DNA-Cluster

• Floureszensmarkierte dNTPs in der chemischen Terminatorgruppe

• Floureszens-Bildaufnahme -> Detektion des Nukelotids

• Entfernung der Schutzgruppe -> Einbau des nächsten Nukleotids -> nächste Runde

-> Detektionslimit: 1% der Allel-Frequenz

-> Umfangreiche Detektion von Treiber- und Ressistenzmutationen in Tumoren

1. Initiation

2. Promotion

3. Progression

• Noxe -> Muation -> irreersibler Genschaden

Gentoxische Kanzerogene:

• Chemikalien (z.B. Benzol)

• Reaktive Sauerstoffspezies, Radikale

• Strahlung

• Viren (z.B.HPV)

-> Manifestation durch fehlende DNA-Reperatur und Apoptose

• selektive Wachstumsstimulation (präneoplastischer Zellklon entsteht)

• klonale Zellgruppe

• Tumorpromotoren (organspezifisch)

  • Östrogene (Mamma)

  • Nikotin (Bronchien)

  • TGF-alpha (Haut, Leber)

-> jahrelanger, reversibler Prozess

• Akkumulation von Mutationen

  • Onkogene

  • Tumorsupressorgene

-> Enstehung eines (benignen) Tumors

• Störung in mehreren Regelkreisen

  • maligne Transformation

• fehlende Zellzykluskontrolle und Apoptosen (Onkogene und Tumorsupressorgene)

• Proliferation und Unabhängigkeit

• Anhäufung von Mutationen

• Tumorfördernde Entzündung

• Metabolismusumstellung (Glukose -> Laktat)

• Umgehung der Immunabwehr

• Angiogenese

• Invasion und Metastasierung

Onkogene

• entstehen aus Protoonkogenen

• Regulieren Zellteilung, Zellmigration und Differenzierung

• Mutation führt zu Onkogen

  • Permanente Aktivierung des Onkogens

  • Unkontrolliertes Wachstum

Onkogenklasen

• Wachstumsfaktoren (EGF, VEGF)

• Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR, KIT, PDGFRa)

• GTP-bindende Proteine (RAS)

• Tyrosinkinasen (SRC, ABL)

• Zellzyklusregulatoren (Cyclin D)

• Transkriptionsfaktoren (MYC, FOS, JUN)

-> Prädiktive Marker für Targeted Therapies

Mutationsarten:

• stille Mutation (DNA verändert, AS-Sequenz gleich)

• Misssense-Mutation (DNA verändert -> Veränderung der codierten Aminosäure)

• Nonsense-Mutation (Stopp-Codon entsteht)

• Frameshift-Mutation (Insertion, Deletion -> Verschiebung des Leserasters)

• Fusion, Translokation (Fusionsgen, 2 Gene werden verknüpft (z.B. EML4-ALK (Lungenkrebs))

• Amplifikation (Überexpression (z.B. Her2 (Brstkrebs))

-> Entstehung von Onkogenen durch Gain of function

• Mutation (Punktmutation -> Deletion/ Insertion): Protein mit veränderter Struktur/ Funktion

• Amplifizierung: vermehrte Proteinexpression (Störung der Homöostase)

• Translokation

  • des Promotors: vermehrte Proteinexpression

  • codierender Sequenzen: Fusionsprotein mit veränderter Funktion

Tumorsupressor-Gene

• Gegenspieler der Onkogene: wachstumshemmed

  • Transkriptionsfaktoren (APC)

  • Zellzyklus-Regulatoren (p53, p16)

  • DNA-Reperatur (BRCA1/2, MMR-Proteine)

• Aufrechterhaltung genetischer Stabilität durch Apoptose

-> Loss of funktion nach Mutation in beiden Allelen (double hit)

Nichtkleinzelliges Lungen-Ca

• 2häufigste (w) bzw 3häufigste (m) Krebserkrankunge

• Patienten bei Diagnosestellung oft in fortgeschrittenem Stadium (III - 40%, IV - 35%)

• 5JÜR 5-10%

-> für Erstlininentherapie Testung des Tumors für Zielgerichtete Therapie -> Nachweis Onkogene

• EGFR

• KRAS

• PD-L1

• BRAF

EGFR- Epidermal Growth Factor Receptor

• Rezeptor-Tyrosinkinase

• Ligandenbindung induziert Dimerisierung -> Autophosphorilierung durcg Tyrosinkinase-Domäne

• Signaltransduktion (Ras-Raf-Mek-ERK1 bzw. PI3K-AKT-mTOR/NFkB) löst Proliferation aus und sichert Überleben der Zelle

-> Mutation in 17% der Fälle bei NSCLC (nichtkleinzelliges Lungen-CA)

• 45% Primärmutation (Deletion/Insertion)

• 40% L858R, L861Q (Primärmutation)

• 60% Ressistenzmutationen (T790M, Insertionen)

-> Folge:

• Destabilisierung der inaktiven Rezeptor-Form

• konstitutive Aktivierung ohne Ligand EGF

• Permanentes Zellwachstum (MAPK-Signalweg)

• physiologisch: ligandenabhängige Aktivierung von Tyrosinkinasen

• bei Mutation: permanente (ligandenunabhängige) Aktivierung

  -> TKI (z.B. Erlotinib, Gefitinib, Afatinib) blockieren ATP-Bindungsstelle -> ATP kann nicht binden -> Stopp der Signalkaskade

• Ressistenzmutation (50% T790M) -> TKI kann nicht mehr binden -> permanente Aktivierung

• Zweitlinien-TKI (Osimertinib) -> erneute Blockade der ATP-Bindungsstelle nach Ressistenzmutation möglich

-> Untersuchung von Ressistenzmutationen mit Liquid-Biopsy-Analyse

Nachweis von Resistenzmutationen

• Liquid Biopsy für EGFR T790M

  • Untersuchung freier zirkulierender Nukleinsäuren (cfDNA, enthalten auch Tumor-DNA) im Blutplasma

  • Rezidivuntersuchungen:

    1. Isolation von cfDNA aus Blutplasma

    2. Amplifizierung der ctDNA (dafür muss die gesuchte Sequenz bekannt sein) und anschließende Analyse des PCR-Produktes

    -> Analyse via Blutuntersuchung (keine Rebiopsie nötig)

• Real-Time-PCR

  • DNA-sequenzspezifische Floreszensgruppe wird mit Quencher (Schutzgruppe, die Floureszensfarbstoff abschirmt) versehen

  • Sonde bindet an Sequenz (Mutation)

  • Quencher spaltet sich ab -> Floureszenssonde geht in Lösung und wird detektierbar

ALK - und ROS1-Translokationen (2%)

• ALK: Rezeptor-Tyrosinkinase

  • intrachromosomale Umlagerung (innerhalb des selben Chromosoms)

• ROS1: struktuell mit ALK verwandt

  • interchromosomale Mutation (innerhalb verschiedener Chromosome)

-> Fusionsgene vermitteln starke Wachstumssignale

-> Therapie mit ALK-TKI: Crizotinib, Alectinib

Nachweis: Chromogene In Situ Hybridisierung

• Verwendung von Gensonden mit unterschiedlichen Floreszensmarkern

• Gensonden binden an Gene, die (potentiell) miteinander Fusionieren

• Floureszenssignal gibt Rückschluss auf Mutation

  • gemischtes Signal (alle Signale von einem Gen) -> Wildtyp

  • Splitsignal -> Fusion (Mutation)

NTRK-Translokation

• Rezeptor-Tyrosinkinas (Neurone)

• reguliert Differenzierung und Überleben der Neurone

• Fusionsgen mit NTRK-Rezeptortyrosin-Kinasedomäne (Daueraktivierung)

• Inhibitoren:

  • Larotrectinib

  • Entrectinib (auch ROS1 und ALK)

KRAS

• bei EGF-Überexpression (Behandlung mit EGFR-Antikörpern Cetuximab, Panitumumab)

• KRAS-Mutation führt zur permanenten Aktivierung (EGFR-Ras-Raf-Mek-ERK1)

• Anti-EGFR nur bei Wildtyp-RAS

-> RAS-Status ist ein prädiktiver Marker für ein negatives Ansprechen der Anti-EGFR-Therapie

BRAF

• Codiert für Serin/Theronin-Kinase

• 60% der Melanome (V600E 80-90%)

• 3% NSCLC

• BRAF-Inhibitoren:

  • Vemurafinib (oft Resistenzmutationen 6-9 Monate nach Therapiebeginn)

  • Dabrafinib

PD-L1

• Immun-Checkpoint

• PD-1: Programmed Cell Death Protein

• PD-L1: Programmed Cell Deat Ligand

• Funktion (physiologisch): Regulation des Immunsystems, Inhibierung von Autoimmun-Reaktionen

  • durch Effektor-T-Lymphozyten

  • Hemmung PI3K/RAS-> Hemmung der Apoptose

• bei Exprimierung auf Tumorzellen: Abwehr des Immunsystems durch Tarnung der Tumorzelle mit PD-L1

-> Konsequenz: Immuntherapie

• Monoklonaler Antikörper Avelumab (ab für anitbody) gegen PD-L1

• Nivulumab gegen PD-1

• Durchführung tagesaktueller Immunhistochemie

  • Routineimmunhistochemie (bei offener Fragestellung nach Routine-HE-Färbung)

    • Bearbeitung mit Bericht innerhalb von ca 24

    • 350-450 Objektträger pro Tag

    • vollautomatische Verarbeitung für höchstmögliche Standartisierung (Ventana Benchmark Ultra)

• Validierung neier Routineantikörper (derzeit etwa 170AK)

• regelmäßige jährliche Teilnahme an allen Ringversuchen der QuiP (Qualitätssicherunsinitiative der Pathologie, externe Qualitätskontrolle)

• Durchführen von Forschungsprojekten

  
  

Immunhistochemische Nachweisverfahren

• direkte Methoden

  (Antikörper mit Nachweisreagenz (z.B. Peroxidase) bindet an Antigen)

• indirekte Methode

  • Antikörper 1 bindet an Antigen -> Antikörper 2 mit Nachweisreagenz bindet an Antikörper 1

  • mit Polymerketten-Erkennungs-System (AK2/ Nachweisreagenz an Polymerkette gebunden, dann Bindung an AK1/AG)

• Chromogne (Farbstoffe)

  • DAB (Diaminobenzidine)

    • Oxidation mit Merrettichperoxidase

    • Bildung unlösliches Präzipitat in wässr./organischen Lösungsmitteln

    • unlöslicher brauner Niederschlag im Lichtmikroskop

    • dann Gegenfärbung mit Hämalaun (blau)

  • Ultraview-RED

    • versch. enzymmarkierte Sekundärantikörper

    • lokalisieren gebundenen Primärantikörper

    • Sichtbarmachen mit Naphtol und Fast Red -> Roter Niederschlag -> Nachweis im Lichtmikroskop

Mammaglobin

• zytoplasmatischer Antikörper

• Sekretglobulin

• Expression in normalem und neoplastischen Mamma-Gewebe

• Anwendung bei Metastasendiagnostik nach ursprünglichen Mamma-Ca (nicht in Primärdiagnostik Mamma-Ca)

Her2

• transmembranäres Glykoprotein gegen Onkoprotein c-erbB-2

• Überexpression bei Mamma-und Magen-CA (15% der Karzinome) -> Marker zur Verwendung eines oder mehrerer zielgerichteter Medikamente

• Angabe der Stärke der Reaktivität in Abhängigkeit der Prozentzahl positiver Tumorzellen

Auswertung (nach Ausmaß der Membranreaktion)

• ICH (immunhstochemie) 0 oder 1 -Y negativ

• ICH 2 -> zweifelhaft -> in situ Hybridisierung oder erneute Testung

• ICH 3+ -> positiv -> Anti-Her2-Therapie

PD-L1

• membranärer Antikörper

• Programmed Cell Death Ligand 1

• Oberflächenprotein

• Beteiligt an der Hemmung der Immunantwort

• zielgerichtete Therapie mit monoklonalen AK gegen Immun-Checkpoints (Immun-Checkpoint-Inhibitoren)

Auswertung

• mindestens 100 Tumorzellen, Inhomogenität des Tumors beachten

• schwächste membranäre (auch partielle) Reaktion wird als positiv gewertet)

• Verschiedene Scoring-Systeme

  • TPS (tumor proportion score, Anteil positiver Tumorzellen am Gesamttumor)

  • CPS (combined proportion score, Bewertung Immunzellen und alle vitalen Tumorzellen)

  • ICS (Immuncell-Score, alleinige Bewerbung von Immunzellen)

NTRK

• membranärer Antikörper

• neurotrope Tyrosin-Kinase

• Familie von Fusionsproteinen (NTRK 1, 2, 3)

• Immunhistochemischer Nachweis; PanTRK (AK) als Screening, bei Reaktivität Nachweis auf RNA-Ebene

• Tumoragnostisches Arzneimittel: NRTK-Inhibitoren (z.B. Larotrectinib)

-> NTRK-Gen fusioniert mit verschiedenen Genen als Fusionspartner -> Auslösung von Fusionskrebs, z.B. (incl. Fusionshäufigkeit (%)

• sekretorisches Mamma-analoges Speicheldrüsen CA (MASC) (93-100%)

• sekretorisches MammaCA (92%)

• infantiles congenitales Fibrosarkom (86-91%)

• pädiatrisches high grade gliom (40%)

• mesoblastisches Nephrom (67-75%)

• gastrointestinale Stromatumore (GIST) (5-25%)