Welche Kriterien sollten PrimärAK beim Einsatz in der Immunhistochemie erfüllen?
Spezifische Reaktion auf das AG, keine Kreuzreaktivität mit ähnlichen Epitopen
Aufgaben des PrimärAK und des SekundärAK
PrimärAK bindet spezifisch an das Epitop des gesuchten Antigens
SekundärAK bindet spezifisch an PrimärAK und ist markiert, Erhöhung der Spezifität der Methode, sichtbarer NW der AG
Was müssen Sie beim Einsatz von mehreren AK beachten?
Müssen von unterschiedlichen Tieren stammen
Welche immunhistochemischen Methoden kennen Sie?
direkt, indirekt (2-/3-Schritt), Streptavidin-Biotin-, Polymer-Methode
Warum ist die Signalwirkung bei der indirekten 3-Schritt-Methode größer als bei der indirekten 2-Schritt-Methode?
Weil der Sekundär- und TertiärAK merkiert sind -> Verstärkung des Signals durch die Kombination der beiden AK
Welches Chromogen wird für die enzymatische Reaktion mit Meerrettichperoxidase benötigt, wenn es ein braunes Endprodukt ergeben soll?
Diaminobenzidin
Warum haben die Polymer- und die Streptavidin-Biotin-Methode die höchste Sensitivität?
Große Menge Enzymmoleküle auf kleinem Raum, um mehr Substrat umsetzen zu können
Welche Möglichkeit gibt es, um unspezifische Bindungen des PrimärAK zu vermeiden?
monoklonale PrimärAK
Welchen Vorteil bringt die Polymer-Methode gegenüber der Streptavidin-Methode?
Man benötigt keine Blocklösung
Warum können bei Nachweismethoden mit HRP/AP als Markersubstanzen falsch positive Ergebnisse entstehen?
Endogenes Vorkommen von HRP/AP im Gewebe, Blockpuffer notwendig
Welchen AK muss man bei der Negativkontrolle weglassen?
PrimärAK
Warum braucht man eine Negativkontrolle?
Kontrolle Testablauf, unspezifische Bindungen des SekundärAK
Warum braucht man eine Positivkontrolle?
Kontrolle von Testablauf, Bindung des PrimärAK an das AG und Spezifität des PrimärAK
Mit welchem Fixativ wird das Gewebe vor einem immunhistochemischen Nachweis behandelt?
Formalin
Welcher Nachteil entsteht bei einer Fixierung?
AG werden maskiert, können nicht mehr nachgewiesen werden
Was ist eine AG-Demaskierung? Nennen Sie mögliche Methoden
Freilegung der AG durch Hitze mit Citratpuffer oder enzymatisch
Vorteile bei Paraffinschnitten
lange Aufbewahrung möglich, Routinediagnostik, Gewebe nicht mehr infektiös
Nachteile bei Paraffinschnitten
Demaskierung der AG als zusätzlicher Schritt
Vorteile bei Kryopräparaten
Schnellschnitt -> schnelles Ergebnis
Nativpräp -> kein Demaskieren nötig
Struktur der AG bleibt erhalten
Nachteile bei Kryopräparaten
Schlecht aufzubewahren
Durch regelmäßiges Auftauen/Einfrieren geht Gewebestruktur verloren
Schnittqualität und Schnittdicke sind in der Immunhistochemie entscheidend. Warum?
Bei zu dicken Schnitten werden AG durch die Methode nicht erreicht
Warum muss die endogene Enzymaktivität außer bei der Immunfluoreszenzmethode blockiert werden?
Um unspezifische Bindungen des SekundärAk zu verhindern -> falsch positive Ergebnisse
Bei welcher Methode muss die endogene Biotinaktivität im Gewebe besonders beachtet werden?
Strept-Avidin-Biotin-Methode
Weitere Ursachen für falsch positive Ergebnisse
unspezifische Bindung des SekundärAK mit PrimärAK
Kreuzreaktionen
unzureichendes Waschen mit TBS-Puffer
endogene Enzymaktivität bei Enzymmarkierung nicht blockiert
Verwendung von polyklonalen AK
Wie können falsch positive Ergebnisse vermieden werden?
Monoklonale AK
Blocklösung
Ursachen für falsch negative Ergebnisse
Antigenverlust aufgrund schlechter Gewebeerhaltung durch mangelhafte Fixierung/Einbettung
fehlerhafte AG-Demaskierung
falsche Lagerung der AK
Was passiert, wenn die Blocklösung gegen endogene Enzyme im Gewebe vergessen wird?
unspez. Bindung, Chromogene reagieren mit endogenen Enzymen -> falsch positive Ergebnisse
Wozu sind die Waschschritte mit TBS-Puffer bei einer Immunmarkierung nötig?
um die überschüssigen AK zu entfernen (wenn vergessen/unzureichend -> falsch positive Ergebnisse)
Was passiert, wenn die AG vor einer Immunmarkierung nicht demaskiert wurden?
falsch negatives Ergebnis, da die AG für die Markierung nicht zugänglich sind
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