Serum 1:5

20µl Probe + 20µl Reiterspirochäten-Abs-Medium + 60µl Rheumafaktor-Abs-Medium

Pos. und neg. Ko

Kontrolle Testablauf, bekannter Titer, Kontrolle der Waschvorgänge

pos. Ko quantitativ, ne. Ko. qualitativ

bearbeiten wie Probe

Leerwerte

Abs.medien bzw. PBS statt Probe auftragen, dann weiter wie Probe

Abs.medien bzw. PBS werden auf unspez. Reaktion mit FITC getestet (RB: kein Leuchten von T. pallidum)

grobe Fehler im Versuchsansatz (Verdünnungs-/Pipettierfehler, Plasma statt Serum, falsche Inkubationsbedingungen, Reagenziencharge nicht beachtet…)

Beschickung des OT beschädigt

Nachweisreagenz nicht im Dunkeln inkubiert

OT ausgetrocknet

Waschvorgänge nicht korrekt eingehalten (nicht PBS pH 7,2 verwendet -> Leuchtkraft des FITC wird im sauren Milieu gehemmt)

falsches Eindeckmedium verwendet

Mit dem Fluoreszenz-Mikroskop

pos.: T. pallidum leuchtet apfelgrün

neg.: T. pallidum zeigt kein oder nur geringes leuchten

Titer: Fluoreszenzleuchtkraft der einzelnen Verdünnungen miteinander vergleichen. Stärksten Leuchtkraftabfall beachten (Titergrenze). Titer ist maximale Serumverdünnung, die noch positiv bewertet wird

Titerangabe: Serumverdünnung

Referenzbereich:

neg.: < 1:10

grenzwertig 1:10 - 1:20

pos.: ≥1:40

Diagnostik einer akuten, behandlungsbedürftigen INfektion

Krankheitsverlaufskontrolle bzw. Therapieerfolg erfolgt mit Anti-Cardiolipin-Test (RPR)

Meldepflichtig (Meldung einer ansteckenden Geschlechtskrankheit)

IgM-AK gegen T. pallidum

T. pallidum auf OT

indirekter Fluoreszenztest

Serum 1:5 in Reiterspirochäten- und Rheumafaktor-Abs-Medium verdünnen

Inkubation 30min/37°C

Zentrifugation 3000rpm/5min

Verdünnungsreihe anlegen: 1:10 - 1:1280 in 50µl PBS

OT beschicken mit je 25µl Serumverdünnung

Inkubation 60min/37°C/feuchte Kammer

Waschen 2x 5min in PBS

+25µl Konjugat

Inkubation 30min/37°C/feuchte Kammer/lichtgeschützt

Waschen 2x 5min in PBS

Einbetten

Fluoreszenzmikroskopisch beurteilen

Abs-Medium enthält T. phagedenis (Reiterstamm), kreuzreagierende AK werden durch Absorption an T. phagedenis entfernt. Spez. AK gegen T. pallidum werden nicht gebunden. Die Testspezifität wird dadurch erhöht.

Vorbehandlung mit RF-Abs-Medium (anti-human-IgG) bewirkt die Entfernung der IgG-AK und der daran gebundenen IgM-RF.

2.Inkubation: AG-AK-Komplexbildung, d.h. Syphilis-AK binden an T. pallidum auf dem OT. Keine AK-Bindung wenn Probe negativ

1.Waschen: nicht gebundene Serumbestandteile werden entfernt

3.Inkubation: Konjugat = anti-human-IgM/FITC bindet an den Syphilis-IgM-AK der AG-AK-Komplexe und markiert diese mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC. Keine Merkierung wenn Probe negativ.

2.Waschen: nicht gebundenes Konjugat wird entfernt

Beurteilung: Bestrahlung mit UV-Lich (kurzwellig, energiereich). FITC nimmt die Energie auf und gibt sie als Licht einer anderen Wellenlänge wieder ab (langwellig, energiearm) -> apfelgrünes leuchten der AG