Was braucht man alles, um einen PCR durchzuführen ?
Man braucht:
• Nukleotide
• Taq-Polymerase ( die aus Bakterien gewonnen wird, sie ist hitzebeständiger wie die DNA-Polymerase)
• 2 Primer, als Startsignal für die Polymerase, für 2 Einzelstränge
• Thermocycler (Heiz-/ Kühlgerät) der seine Temperatur rasch verändern kann
Welche Schritte hat ein PCR-Reaktionszyklus ?
• ist eine extrem empfindliche Methode, sie vervielfältigt die DNA so, dass sie nachweisbar wird
• besteht aus 3 Temperaturschritten:
1. Schritt:
2. Schritt:
3. Schritt:
• Die DNA wird auf 95°C erhitzt
• Die DNA-Einzelstränge werden auf 40°C - 60°C abekühlt
• Temperatur wird auf 75°C erhöht
➪ Die DNA-Doppelstränge teilen sich in Einzelstränge
➪ Die H-Brücken werden “künstlich” geteilt
➪ Die Primer lagern sich an die Einzelstränge
➪ Die Taq-Polymerase synthetisiert, von den Primern ausgehend, den neuen Einzelstrang
Wie funktioniert die Gelelektrophorese ?
• Das Gel darin, wirkt wie ein Sieb, durch dessen Poren kleine DNA-Fragmente schneller als große Fragmente wandern
➪ gleich große Fragmente sammeln sich dabei zu Banden an
→ sind erst einmal unsichtbar, mithilfe vom Farbstoff: Ethidiumbromid, fluoreszieren (=leuchten) die Banden
☞︎︎︎ Ethidiumbromid schiebt sich zwischen den Basenpaaren der DNA-Doppelhelix und fluoresziert (bzw. leuchtet) unter UV-Strahlungen dann orange
⚠︎Hinweis:
Teile der DNA ist negativ geladen, die negativen Anteile ziehen sich zum positiven Teil der Gelelektrophorose und somit trennt das Gel im Apparat die DNA
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