Fragenkatalog (26-42)

1.1. durch Proteinverdau

• Zugabe von 0,1 mg/ml Proteinase K —> denatueriert Proteine

• Zugabe von 0,5 % SDS (Sodiumlaurylsulfat) —> denatueriet Proteine und Memrbranen)

1.2 durch Asunutzen der untersch. Löslichkeit

• Einsetzen von organ Lösungsmitteln Phenol, Chlorophorm: verwendet um Proteine von Nukleinsöuren zu trennen: —> Proteinfällung durch Phenolextraktion

1.3 Verwendung von Säulen (bei den meisten Kits)

• Proteine sind weniger hydrophil (=Wasserlöslich) und gehen daher eher in die organische Phase, während Nukleinsöuren (Phosphatgruppen) in der wässerigen Lösung bleiben.

• Phenol ist mit Tris-HCl/EDTA auf pH 7,5-8,0 eingestellt

• Nach der Phenolextraktion wird der wässrigen Phase noch 1 Volumen Chloroform zugegeben, um Reste von Phenol aus der wässrigen Phase zu entfernen

• Durch die Inaktivierung von DNAsen (Schutz vor Nukleasen)

  
  

• Mechanisches Aufbrechen (mörsern)

• chemisch: z.B. durch SDS, Lysozym oder NACL

• 
  

• DNA ist hydrophiler als Proteine.

• DNA weißt mehr polare und ionische Gruppen auf (Basen, Phosphat und Zucker ist Polar)

  
  

• Das Quantifizieren von DNA bedeutet die Bestimmung der Konzentration der DNA in einer Probe.

• Dabei wird die Menge an DNA in der Probe gemessen, um sicherzustellen, dass ausreichend DNA für ein bestimmtes Experiment oder eine bestimmte Anwendung vorhanden ist.

• a) UV/Vis-Spektroskopie

  (Mengenbestimmung bei 260 nm; Reinheit 260nm ) 280nm

• b) Agarosegelelektrophorese (Vergleich mit bekannten Standardmengen „Mass-Ladder“) ist nicht wirklich zur Quantifizierung, eher zur Abschätzung der Qualität der isolierten Nukleinsäuren

• Dalton = d = atomare Masseneinheit oder Molekülgewichtseinheit

• 1Dalton=1,66x10-27 kg=1,66x10-24 g (= ungefähre Masse eines Wasserstoffatoms)

• keine SI-Einheit

• Angloamerikanisches Maßsystem

• 
  

• 1 Nukleotid = ca. 335 d

• 1 Basenpaar bp = ca. 650 d Molekülgewicht

• Molmasse = Teilchenmasse * Avogradozahl 1 Mol Nukleotide (= 6 x 1023 Moleküle = Avogradozahl) entsprechend = 335 g 1 Mol Basenpaare = 650 g 21

• ist eine Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe. Die Methode beruht auf der Tatsache, dass DNA- Moleküle in einem elektrischen Feld aufgrund ihrer negativen Ladung durch das Gel wandern. Das Gel besteht aus Agarose, einem porösen Polysaccharid, das in heißem Puffer gelöst und in einer Gelkammer auf ein horizontal oder vertikal angeordnetes Gitter aufgetragen wird.

• Zunächst wird die DNA mit einem Restriktionsenzym geschnitten, um Fragmente unterschiedlicher Größe zu erzeugen. Anschließend wird die DNA-Probe in die Gelkammer geladen und einem elektrischen Feld ausgesetzt. Die kleineren Fragmente wandern durch das Gel schneller als größere Fragmente, da sie sich leichter durch die Poren des Gels bewegen können. Die DNA-Fragmente werden durch Fluoreszenzfarbstoffe oder Silbernitrat sichtbar gemacht.

• Nach Abschluss der Elektrophorese werden die Banden der DNA-Fragmente im Gel unter UV-Licht visualisiert und durch Vergleich mit einer DNA-Standardleiter charakterisiert, die aus Fragmenten bekannter Größe besteht. Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine wichtige Methode in der Molekularbiologie und wird häufig zur Analyse von PCR-Produkten, zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten und zur Trennung von Plasmiden oder Genom-DNA verwendet.

• Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe

• DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten

• Gel besteht aus Agarose und wird in einer Gelkammer aufgetragen

• DNA-Probe wird in das Gel geladen und einem elektrischen Feld ausgesetzt

• Kleineren DNA-Fragmente wandern durch das Gel schneller als größere

• DNA-Fragmente werden durch Fluoreszenzfarbstoffe oder Silbernitrat sichtbar gemacht

• Banden der DNA-Fragmente im Gel werden unter UV-Licht visualisiert

• Vergleich mit einer DNA-Standardleiter zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten

• Häufige Anwendung in der Molekularbiologie zur Analyse von PCR-Produkten, zur Trennung von Plasmiden oder Genom-DNA

• Je höher die Konzentration des Agarosegels ist, desto kleiner sind die Poren.

  
  

• In einer Agarose-Gelelektrophorese wandert die DNA von der negativ geladenen Kathode (Minuspol) zur positiv geladenen Anode (Pluspol). Das liegt daran, dass DNA negativ geladen ist, aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen in ihrer Struktur.

• In der Regel ist die Anode bei der Agarosegelelektrophorese positiv geladen. Die DNA-Fragmente sind negativ geladen und werden zur positiv geladenen Anode im elektrischen Feld gezogen.

1. Größenausschluss: Kleine DNA-Fragmente bewegen sich schneller durch das Gel als größere, da sie weniger Widerstand erfahren und weniger von den Poren des Gels blockiert werden.

2. Ladung: Da DNA negativ geladen ist, werden die DNA-Fragmente durch das elektrische Feld zum positiven Pol (Anode) gezogen.

• Im UV-Licht durch Zugabe von Fluoreszensfarbstoffe, wie z.B. Ethidiumbromid

  
  

• Mit Ethidiumbromid als Floureszenzfarbstoff

  • Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der sich an die DNA bindet und unter UV-Licht sichtbar wird. Das Gel wird in einer Lösung aus Ethidiumbromid eingeweicht, um die DNA-Fragmente zu färben. Die DNA-Banden erscheinen als orange fluoreszierende Bänder.

• Damit die Polymerase einen Punkt zum Ansetzen hat. So wird nur ein spezifischer Abschnitt synthetisiert. Für jeden sträng wird ein spezifischer Primer benötigt

• Der forward-Primer bindet an die 5'-Ende einer DNA-Strang-Region, während der reverse-Primer an die 3'-Ende einer gegenüberliegenden DNA-Strang-Region bindet. Diese beiden Primer bilden somit die Startpunkte für die DNA-Synthese und definieren die exakte Position der zu vervielfältigenden DNA-Sequenz.

• erhöht die Stabilität der PCR-Produkte.

• Die Verbindungen zwischen G und C sind stärker als diejenigen zwischen A und T, was zu einer höheren Schmelztemperatur der PCR-Produkte führt und somit die Spezifität und Effizienz der PCR verbessert.

• Ein Primer mit einer zu geringen Schmelztemperatur kann unspezifisch binden und somit zur Amplifikation unerwünschter DNA-Sequenzen führen.

• Es ist wichtig, dass die Schmelztemperatur des Primers höher als die der Ziel-DNA-Sequenz ist, um eine effektive Amplifikation zu gewährleisten.

• - 30 sek. bei 94 °C Denaturierung 

  - 30 sek. bei 52° C Anlagerung der Primer

  - 1 min/kb bei 72°C Arbeiten der Polymerase

  
  

  Dies 35 mal Wiederholen

  7 Minuten bei 72°C um alle unveränderten Abschnitte fertig zu stellen

Um einen 14 Basen langen Primer bei der Position 171 abzuleiten, müssen wir die Sequenz ab dieser Position 14 Basen lang lesen:

ATCGTTCAGCTGTT

Da wir ein 180 bp langes DNA-Stück erhalten möchten, müssen wir den zweiten Primer so wählen, dass er 180 Basen weiter unten beginnt als der erste Primer. Das bedeutet, dass wir 165 Basen weiter unten beginnen müssen als bei der Position 171. Also müssen wir die Sequenz ab der Position 336 (171 + 165) lesen und einen 15 Basen langen Primer ableiten:

5' ATTTCTGATCGGGTT 3' (15 Basen)

Die Sequenz der beiden Primer lautet demnach:

Primer 1: 5' ATCGTTCAGCTGTT 3' (14 Basen) Primer 2: 5' ATTTCTGATCGGGTT 3' (15 Basen)

• spezifische Primer = für eine bestimmte Frequenz

  • Sind komplementär zur Zielregion

  • Können verwendet werden, um ein bestimmtes Gen aus einer Vielzahl von Organismen zu amplifizieren

• degenerierte Primer =

  • Primer, die fpr unbekannte Gene hergestellt werden

  • es geht um die Amplifikation einer unbekannten Sequenz (z.B. Suche nach Gen für Saccharosetransporter in Eiche)

  • basierend auf Sequenzkonservierung bei verschiedenen anderen Arten (z.B. Saccharosetransporter in Erbse, Fichte, Kaffee bekannt)

  • Können mehrere ähnliche Sequenzen amplifizieren

• Rückübersetzung von Aminosäure in eine Nukleotidsequenz. Darauf achten, dass bestimmte aminosäuren nicht drinnen sind, welche für mehrere Triplett codiert werden können.  (Bsp. Typtophan nehmen) —> es sollten für den Primer Sequenzen genutzt werden, die möglichst wenig Triplett-Möglichkeiten aufweisen. z.B. Tryptophan

• durch die Degeneration des genetischen Codes kommt es zu Ungenauigkeiten

• die Aminosäuresequenz sollte kein Arg, Leu oder Ser enthalten, da diese 6 Trippletts

• Man nutzt Inosin —> Inosin paart mit A, G, T

• a) Puffer —> stabilisiert, stellt bestimmten pH-Wert ein.

  b) dNTP-Mix (200 μM) (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

  c) MgCl2 (0,5-5 mM) —> beeinflusst PCR und Bondung der Nukleinsäuren

  d) spez. Oligonukleotid-Primer Primer 1 und Primer 2 (je 10-100 pmol) —> als Startpunkte für die Polymerase dienen.

  e) DNA (Template) (1 ng bei Plasmid DNA, 1 μg bei gDNA)

  • Matrizen-Vorlage, die man vervielfältigen möchte.

  f) Enzym: thermostabile DNA-Polymerase, z.B. Taq (aus Thermus aquaticus, 1 Unit), Aktivität ca. 1000 Nukleotide pro min (1 kbmin) —> Eine hitzestabile DNA-Polymerase, die den Einbau von dNTPs in die wachsende DNA-Kette katalysiert.

• DNA isolieren anschließend mithilfe einer PCR sequenzieren anschließend Zellen Klonieren

• Chat GPT:

  • Gewinnung von DNA: Extraktion der DNA aus dem Hautstück des Dodos, die inzwischen vermutlich stark degradiert ist.

  • Design von PCR-Primern: Design spezifischer PCR-Primer, die auf der Basis von vorhandenem genetischen Material des Dodos entworfen werden können. Diese Primern sollten so gewählt werden, dass sie sich an konservierten Stellen des Dodo-Genoms binden und so eine spezifische Amplifikation ermöglichen.

  • Durchführung der PCR: Führen Sie die PCR durch, indem Sie die DNA-Vorlage in einer Reaktionsmischung mit den PCR-Primern, DNA-Polymerase und den vier dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) kombinieren. Die PCR wird durch einen Zyklus von Temperaturänderungen durchgeführt, um die DNA zu denaturieren, die Primer annealen zu lassen und die DNA zu synthetisieren.

  • Analyse der PCR-Produkte: Die Amplifikation von DNA-Fragmenten wird auf einem Agarose-Gel visualisiert und durch Größenbestimmung und Sequenzierung der Fragmente bestätigt.

1. Methodisch:

• Einbau von Funktionselementen (DNA-Abschnitte)

• Fusion von 2 DNA-Fragmenten

• Entfernen eines DNA-Abschnittes

• Einbau eines DNA-Abschnittes

• Amplifizierung von DNA-Abschnitten

2. Anwesenheit bestimmter Gene bzw. Expressionsniveau

• Degenerierte Primer zur Suche nach Genen, die für die selbe Genfamilie kodieren

• Vervielfältigung RNA (RT-PCR): Genexpression, RNA-Nachweis

3. Medizin,Pflanzen-,Lebensmittel-Umweltanalytik

• Zusammenhang Funktion/Erscheinung und DNA-Sequenz

• Krankheitsbild und DNA-Sequenz

• Überprüfung von Material auf Anwesenheit transgener Pflanzen

• Überprüfung von Material auf Gegenwart infektiöser Keime

• Restrictions-Fragment-Längen-Polymorphismus

• z.B. Blut vom Tatort umd Verdächtigen.

  
  

• 1. DNA wird isoliert

• 2. Proben-DNA wird mit verschiedenen

  Restriktionsenzymen verdaut

• 3. Auftrennung der Fragmente mit Gelelektrophorese

• 4. Transfer der Fragmente auf Membran

• 5. Hybridisierung mit geeigneter Sonde

• 6. Veränderungen im Bandenmuster zeigen Mutationen

• Vorteil:

  • komplexe DNA-Gemische (Blutproben) können direkt ohne Aufreinigung analysiert werden

• Nachteile:

  • nur relativ große Mutationen (Deletionen, Insertionen) werden nachgewiesen.

  • Punktmutationen nur wenn Restriktionsenzym-Schnittstelle geschaffen oder zerstört wird

• Diagnostik

  • - Sichelzellenanämie:

    Fragment mit 13 kbp bei 70% aller Kranken, nur bei 3% Gesunder zu finden - Mukoviszidose: 75 % aller Kranken zeigen gleiches Muster

• Forensik:

  • Mutterschafts- und Vaterschaftstest (DNA-Fingerprint Nachweis von Mutterschaft – für Einbürgerung in England) DNA-Fingerprints aus Spuren am Tatort

  Heute eher PCR

• Southern Blot ist eine Technik zur Detektion spezifischer Nukleotidsequenzen in DNA-Proben.

• Die DNA-Proben werden zuerst mit Restriktionsenzymen geschnitten und dann durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.

• Anschließend wird das Gel in eine Alkalilösung gegeben, die die DNA denaturiert und somit Einzelstränge bildet.

• Die DNA wird auf eine Nitrocellulosemembran oder eine Positivladungsmembran (PVDF) übertragen, die die DNA bindet und immobilisiert.

• Die Membran wird dann mit einer spezifischen Sonde hybridisiert, die mit einer Markierung (z.B. Radioisotop oder Fluoreszenzfarbstoff) versehen ist.

• Die Sonde bindet nur an Komplementärsequenzen auf der Membran, die die spezifische DNA-Sequenz enthalten.

• Durch Waschen der Membran werden ungebundene Sonden entfernt, während die gebundenen Sonden an der Membran verbleiben.

• Die Markierung der gebundenen Sonde ermöglicht die Detektion der spezifischen DNA-Sequenz.

• Southern Blot wird oft zur Identifizierung von Genen oder zur Bestimmung von Genkopienzahlvariationen verwendet.