Lipidkindergarten

• polarer "Kopf"

  • starkes Dipolmoment

  • oft auch pH-abhängige Nettoladung

  • Wassermoleküle können sich als Solvathülle um den Kopf legen

• völlig unpolare Kohlenwasserstoffketten (typischerweise 2 pro Lipidmolekül)

  • mit Wasser eine lokale "Eisbergbildung"

    • entropisch höchst ungünstig

• Lipide werden sich, wann immer möglich, so anordnen, dass der Kopf, nicht jedoch die Kohlenwasserstoffketten, mit Wasser in Berührung stehen

• amphiphil

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• DiMyristoyl-Glycero-Phospho-Cholin

• zwei gesättigte C14-Ketten (R=CH3(CH2)12CO --> Dimyristoyl)

• Rest X =Trimethylammoniumgruppe (N+(CH3)3 –> Cholin)

• weißes, kristallines Pulver

• stark apolare Charakter

• z.B. Chloroform

  • ist giftig, unter Abzug arbeiten

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Critical micelle concentration

• Tropfen DMPC/DPPC-Lösung auf Deckglas und lasst das Lösungsmittel verdunsten lassen

  • gekühlten (5°C) Tropfen (~0,2 ml) Aqua bidest. auf die Probe geben

  • Probe mit einem Objektträger abdecken

  • Lipidkristall nach Abdampfen des Chloroforms im Mikroskop anschauen

• Erhitzen mit Föhn

  • Bildung von Ausstülpungen bei Tm = 23 °C

    • Blähen sich zu Kugeln auf

  • Ausweg aus der Einschränkung der Löslichkeit im polaren Medium, welcher sich aus der Hydrophobizität der Kohlenwasserstoffketten

  • als Bilayer sind die hydrophoben Ketten aneinandergelagert. Dadurch können sich die Wassermoleküle freier bewegen, die Entropie nimmt zu und gleichzeitig kann die Solvatisierungsenergie der Köpfe freigesetzt werden.

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DPPC trägt dieselbe Kopfgruppe (PC) wie DMPC, hat aber zwei Palmitoylketten (DP). Die sind um je 2 CH2 Gruppen länger als die Myristinsäure. Deshalb liegt die Phasenumwandlung (fest-fluid) auch deutlich höher (Tm ~ 44°C).

• spontane Schwingungen (Undulationen) der Vesikelmembran.

  • Dieses Phänomen wird durch die Brown'sche Molekularbewegung hervorgerufen und in der englischsprachigen Literatur als "Flickering" bezeichnet.

• Mit Hilfe eines geeigneten physikalischen Modells lässt sich alleine durch die Aufzeichnung der Undulationen, gefolgt von Bilderkennung und Fourieranalyse die Biegesteifigkeit KC der Membran bestimmen.

  • KC hängt vom verwendeten Lipid und bei Lipidmischungen von deren Mischungsverhältnis ab

• KC für DMPC beträgt ~20kBT, gibt man aber 2% eines kurzkettigen bipolaren Lipids ("BoLa"-Lipid aus der Membran von Archaebakterien) zu, so sinkt KC auf ~kBT und die Undulationen werden wesentlich stärker. Diese Absenkung von KC kann auch durch den Einbau von Membranproteinen oder z.B. Cholesterin erreicht werden.

Kompartimentierung und selektiver Transport

• Minimum der Krümmungsenergie EK = KC/2 – (1/R1 + 1/R2) dA in Abhängigkeit von Volumen V und Oberfläche A des Vesikels

  • R1, R2: Hauptkrümmungsradien des Vesikels

• Wenn Ihr nun ein Vesikel mit dem Föhn aufheizt, so wird sich seine Oberfläche bei konstantem Volumen ausdehnen und der Vesikel verschiedene Formen annehmen, die durch das Minimum seiner Krümmungsenergie bestimmt sind.

• insofern von Bedeutung, als das Lipid als Matrix anderer funktioneller Gruppen, wie etwa Proteine in biologischen Membranen dienen kann

  • Lipide in der Nähe von membranständigen Proteinen können aufgrund der Wechselwirkung mit dem Protein einen kristallinen Zustand annehmen

• Im Allgemeinen sollten jedoch die Komponenten lateral mobil sein, weswegen solche Systeme besser als zweidimensionale Schmelzen oder Legierungen beschrieben werden.

• Lipidphasen in der Substrat-Wasser-Grenzflächemit können mit oberflächenempfindlichen Messmethoden aus der Festkörperphysik sehr genau untersucht werden

  • Lipide bilden unter bestimmten Bedingungen spontan Ausscheidungen an dieser Grenzfläche

• Ablauf

  • erzeugung hoch hydrophiler Oberfläche der Deckgläser mit Hilfe des Plasma Cleaners.

    • Zeigt nun den Unterschied von gereinigten und nicht gereinigten Deckgläsern. Wie? —> Wassertropfen

  • Herstellung freier Vesikel, die nicht am Deckglas festgeklebt sind:

    • Lipidlösung (DMPC/DPPC) nehmen und vorsichtig das Lösungsmittel im N2 Strom verdampfen

    • Restlösungsmittel der Probe ca. 30 min im Vacuum entfernen

    • 0,5 ml bis 1 ml H2O hinzugeben und bei 42°C lagern —> multilamellaren Vesikel

      • Lipid bildet in dieser inhomogenen Vesikelphase einen 2-dimensionalen Flüssigkristall.

    • Oberhalb von Tm sind die lateralen Positionen der Moleküle nur schwach korreliert, die laterale Diffusion ist schnell. Unterhalb von Tm befindet sich das Lipid in einer 2-dimensionalkristallinen Ordnung, häufig sind weitere Fest-Fest-Umwandlungen möglich.

  • gebt auf die vorgereinigten Objektträger einen Tropfen der Vesikelsuspension

  • hydrophile Glasoberfläche vollständig mit der Suspension benetzt

  • Suspension beginnt an einem zufällig entstehenden Keim, den Rand zu kontrahieren

    • Tropfen kriecht nun auf Glasplatte umher

      • "selfexcluded random walk"

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• monomolekularen Lipidfilm

• nicht gerade die Standardmethode

• wird als Langmuir-Blodgett (LB) Schichten bezeichnet

• großes Aufsehen

  • ultradünne organische Schichten auf Festkörperoberflächen

  • potentielle Anwendungsgebiete (Optik, Biosensorik, etc.) sind äußerst vielseitig

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• Reines Wasser hat, wie Ihr wisst die Tendenz, seine freie Oberfläche zu minimieren

  • Energie potentieller Wasserstoffbrückenbindungen an der Grenzfläche zum apolaren Medium (in diesem Fall Luft) können nicht freigesetzt werden

  • Unter Normalbedingungen beträgt sie etwa 73 mN/m

• Zieht man eine Lamelle mit dem Umfang l aus dem Wasser heraus, so benötigt man dazu die Kraft: F = l* σ

• Aufbau

  • 2 ml einer 10 mM Lösung von Myristinsäure in Ethanol an

  • flache Schale mit Wasser

  • Wägeschiffchen, die Kante mit der Myristinsäurelösung bestreichenSchiffchen sofort auf die Wasseroberfläche setzen

• Erklärt, was Ihr seht, und überlegt Euch, mit welchen Experimenten Ihr Eure Annahme stützen könnt.

• „Wilhelmi-Filmwaage“

  • Stück Filterpapier ins Wasser tauchen und mit einer Waage die Kraft messen, mit der es ins Wasser gezogen wird

• Am besten geht dies mit der vorhandenen Waage, wenn Ihr ein etwa 4 cm breites Stück Filterpapier und als Trog ein cell culture dish mit dem Durchmesser = 15 cm nehmt. Gebt dann in 10 µl großen Schritten die 1 mM DMPC-Lösung auf die Wasseroberfläche, indem Ihr den Lipidtropfen vorsichtig auf die Wasseroberfläche setzt und messt jedes Mal die entstandene Kraft.

• abhängig von der Menge an gespreitetem Lipid verändert sich die Oberflächenspannung

  • Lipid baut einen lateralen Druck an der Grenzfläche auf.

  • π Lipidfilm = σ H2O - σ H2O mit Lipidfilm

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Unter der Annahme, dass die Anzahl der Moleküle auf der Oberfläche zu dem Zeitpunkt verwendet wird, bei dem die Oberfläche vollständig mit Lipidmolekülen benetzt ist, lässt sich der Flächenbedarf eines einzelnen DPPC-Moleküls berechnen. Für DPPC ändert sich der Lateraldruck ab ungefähr 44 µl nicht mehr, d. h., dass wir annehmen können, dass die Oberfläche hier vollständig mit Lipidmolekülen

benetzt ist. Daraus folgt, dass der Flächenbedarf pro Molekül bei ca. 55,722 Å2 liegt.

Anhand der in diesem Versuch gesammelten Daten kann die kritische Mizellen-Konzentration für DPPC nicht ermittelt werden. Die Lipide befinden sich hier nur auf der Oberfläche und nicht in der Subphase. Um die CMC bestimmen zu können, müsste eine Verdünnungsreihe für unterschiedliche LipidKonzentrationen in Wasser erstellt werden. Die ermittelten Oberflächenspannungen müssten gegen die logarithmischen Konzentrationen der oberflächenaktiven Substanz aufgetragen werden, um daraus schlussendlich die CMC ermitteln zu können