Reperaturmechanismen

• 3’-5’-Exonuklease der DNA-POL III

• Postreplikative Mismatch-Reperatur

  • erkennt Fehlpaarungen (Mismatches)

  • E. coli: Gene mutS, mutL, mutH

    • Mutation: 100-1000fach erhöhte Mutationsrate

• fehlerhafte Reperatursysteme

  • wenn Schaden nicht vor Replikation behoben wird

• Basen-Exzisions-Reperatur (BER)

  • vor der Replikation

• mutS

• mutL

• mutH

• vorliegen eines Mismatches

• Anlagerung des MutS-Proteins als Homodimer an den Mismatch

  • Homodimer: 2 identische Moleküle (Dimere)

• nacheinander Anlagerung des MutL-Proteins als Homodimer und des MutH-Proteins

• Schleifenbildung exponiert Mismatch

• Schneiden des neu gebildeten (nicht methylierten) DNA-Stranges durch MutH

• Entfernen von zusätzlichen Nukleotiden über Exonuklease I oder VII um die Schnittstelle

• Schließen der Lücke durch POL III und Ligase

• korrigiert falsch eingebaute Nukleotide nach der Replikation

• korrigiert Mismatches, Insertionen und Deletionen (Indels)

• Entfernt mismatches in Heteroduplex-Bereichen, die bei der Rekombination in Holliday-Strukturen vorkommen (homologe Rekombination)

Mutationsrate von 10^-10

• Basenselektion

• 3’-5’-Exonuklease

• Mismatch-Repair

• jeweils 3 Homologe:

  • MutS: MSH2, MSH3, MSH6

  • MutL: MLH1, MLH3, PMS2

  • kein Homolog für MutH, Dinukleasefunktion vermutlich durch MLH

• keine Homo- sondern Heterodimere

• erkennen kleine oder längere Indel-Schleifen bis zu 12-16 Nukleotide

• MLH1/PMS2 und MLH1/MLH3 lagern an

• replikative DNA-POL δ für Lückenschluss

Dickdarmkrebs (Coloncarcinom)

• Mutation in MLH1 oder MSH2

• Veränderungen der Mikrosatellitensequenzen

bei DNA-Schäden, die nicht vor der Replikation behoben wurden; durch Transläsions- oder TLS-Polymerasen

• POL III stoppt am DNA-Schaden (z.B. AP-Stelle)

• Replikationsmaschine kommt nicht über den Schaden im Matrizenstrang hinweg

• Reperaturpolymerase (Transläsionspolymerase), i.d.R. POL V, übernimmt Synthese

• ungenau: oft irgendeine Base ein

• Ursache für alle Arten von Nukleotid-Austausch-Mutationen

• nach Überwinden setzt POL III fort

• POL II

  • 3’-5’-Exonuklease

  • TLS/geschädigte Basen (translesion synthesis)

• POL IV

  • TLS/geschädigte Basen

  • SOS-Mutagenese

• POL V

  • TLS/geschädigte Basen

  • AP-Stellen

  • UV-induzierte Dimere

  • SOS-Mutagenese

• DNA-fremde Base

• DNA-Glykosylase erkennt Base, spaltet glycosidische Bindung und entfernt so Base (AP-Stelle)

• AP-Endonuclease schneidet Zucker-Phosphat-Rückgrat auf 5’-Seite der AP-Stelle

• POL β heftet Nukleotid an

• Überhängender Rest wird entfernt

• Ligase III mit XRCC verknüpft Enden

Basen-Exzisions-Reperatur

• Beseitigung kleinerer Modifikationen an DNA-Basen

  • Alkylierungen

  • Oxidative Schäden

  • Desaminierung von Adenin/Cytosin zu Hypoxanthin/Uracil

  • Schäden durch ioinisierende Strahlen

• Kennzeichen: DNA-Glykosylasen

• Viel benutzt

Die Basen-Exzisions-Reparatur (BER) ist ein viel benutzter Reparaturweg. BER ist durch die Aktivität von DNA-Glykosylasen gekennzeichnet, die bei Auftreten einer DNA-fremden Base durch Spaltung der glykosidischen Bindung die Basen entfernen.

Damit entsteht eine AP-Stelle.

Die Basen-Exzisions-Reparatur tritt nicht nur bei Auftreten von fremden Basen in Funktion, sondern auch bei Basen, die durch Alkylierung oder Oxidation geschädigt wurden.

• Eukaryoten

  • über N-Methylpurin-DNA-Glykosylase (MPG)

    • MPG erkennt methylierte Base

    • hydrolytische Spaltung

    • AP-Stelle entsteht

    • BER repariert AP-Stelle

• Bakterien

  • exprimieren entsprechende Glykosylasen

O6-Alkylguanin-Transferase, direkte Reperatur von O6-Methylguanin

• in allen Organismen

• Übernimmt Alkylgruppe auf eigenen Cysteinrest

• kann als Transkriptionsfaktor agieren

• schützt vor toxischen und cancerogenen Substanzen

• DNA methyliert

• AGT übernimmt Alkylgruppe auf eigenen Cysteinrest

• methyltragendes AGT wirkt als Transkriptionsfaktor auf Regulon für AGT und andere Proteine

• Adaptive Antwort

• Abbau durch Ubiquitin-vermittelte Proteolyse

• 8-OxodGTP-Phosphatase

  • zerstört freies oxidiertes dGTP durch Abspalten P-Rest

  • Prokaryoten MutT

  • Eukaryoten MTH

• MutY-Protein (Prokaryoten) / MYH-DNA-Glykosylase (Eukaryoten)

  • schneiden falsches Adenin heraus

• 8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase

  • entfernen oxidiertes GTP, wenn es mit Cytosin im DS vorliegt

  • Prokaryoten: MutM

  • Eukaryoten: OGG

• Photo-Reaktivierung

• Nukleotid-Exzisions-Reperatur (NER)

• Rekombinative Reperatur

• Enzym Photolyase bindet an Pyrimidindimere

  • nutzt sichtbares Licht zur Wiederherstellung korrekter Nukleotide

    • 2 Chromophore sammeln Lichtenergie und spaltet Cyclobutanringe

  • Nur bei Bakterien, Hefen, Pflanzen, Insekten, Fische, Amphibien, Vögel

Nucleotid-Exzisions-Reparatur

• bei höheren Säugern…

  • … bei Schäden durch bulky adducts durch polycyclische Kohlenwasserstoffe

  • … bei Schäden durch UV-Licht

Nukleotid-Exzisions-Reperatur

Erkennung

• 2 UvrA-Proteine und 1 UvrB-Protein bilden Komplex unter ATP

  • (uv-repair)

• Komplex bindet spezifisch an DNA-Schaden: Erkennung

• UvrA durch UvrC (Endonuklease) ersetzt

Entfernung

• UvrBC-Komplex schneidet 5’ und 3’ vom Schaden

• UvrD-Helikase Exzision des ES

Reperatur

• DNA-POL I synthetisiert neuen Strang

• DNA-Ligase verschließt Strang

Mutation-frequency-declining-Protein

= TRCF (transcription repair coupling factor)

• Reperatur von DNA-Schäden im transkribierten Strang aktiver Gene

  • RNA-POL stoppt am Schaden

  • Mfd verdrängt RNA-POL

  • ermöglicht Bindung von UvrA (Start NER)

• Verhindert fehlerhafte Transkription

Nucleotid-Exzisions-Reperatur

• globale Genomreperatur (GGR)

  • wirkt im ganzen Genom

• transkriptionsgekoppelte Reperatur (TCR)

  • wirkt gezielt an Schäden, die die RNA-POL blockieren

• Xeroderma pigmentosum (XP)

  • empfindlich gegenüber Sonnenstrahlen (UV)

  • XPA bis XPG des NER

  • XP variant (XPV): nur wenig sensitiver, NER in Ordnung, aber aktive DNA-POL η fehlt

• Cockayne-Syndrom

  • CSA/CSB (Teil des TCR-NER)

  • schnelles Altern

Nucleotid-Exzisions-Reperatur

• Globale Genomreperatur

  • XPC-HR23B-Komplex, XPA erkennen Schaden

  • TFIIH (Transkriptionsfaktor 2 H, Helikase) entwindet Bereich

  • RPA (replication protein A) bindet ES

  • XPA bindet an Schaden

  • XPF und XPG schneiden weiteren Bereich

  • Faktor RFC positioniert Ringklemme der POL

  • replikative DNA-POL δ/ε synthetisieren

  • DNA-Ligase I schließt

• Transkriptions-gekoppelte Reparatur

  • CSA, CSB entfernen RNA-POL II (verhindern Ablesen)

  • TFIIH entwindet …

• mehr Proteine beteiligt

• größere DNA-Lücke gebildet

• mehr Replikationsproteine (Pol δ/ε, RPA, PCNA, RFC)

  • Bei Prokaryoten nur DNA-POL I

DNA-POL η

• korrekte Reparatur

• gibt Modifikationen, die POL η nicht überwinden kann, dann POL ζ

• Fehlt bei XPV!

DNA-POL ζ

• fehlerhafte Reperatur

• besser falsche Base als keine!

• Überwindung von UV-Schäden (zusätzlich zu Photo-Reaktivierung und NER)

  • DNA-Replikationsgabel kommt über verzerrte Bereiche nicht hinweg

  • lange ES Bereiche entstehen

  • Anregung von Rekombination zwischen homologen Molekülen

  • führt häufig zu unbeschädigten Genomen

durch Ligasen

• abhängig von Zellzustand (Zellphase)

1. homologe Rekombination

   • während und nach der S-Phase und in G2-Phase

   • Schwesterchromatide als identische Kopie steht zur Verfügung

2. Nicht-homologe-End-zuEnd-Verknüpfung

   • vorwiegend in der G-Phase und zu Beginn der S-Phase

   • mit DNA-Verlust, da nur Enden verknüpft werden

• Anreicherung von Cohesin (Zusammenhalt) an Stellen des Strangbruches bei Schwesterchromatiden

• Zurechtschneiden der Enden: Überhänge

• Strangaustausch zwischen 3’-Überhang und homologen, intakten Abschnitt

• DNA-Synthese in Holliday-Struktur

• DNA-Ligation, Branch Migration, Auflösung der Holliday-Struktur

non-homologous end-joining

(Nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung)

• Proteinanlagerung an Bruch

• DNA-Proteinkinase phosphoryliert und aktiviert

• Zurechtschneiden der Enden mit Endo- / Exonukleasen

• Reperatur-Ligase IV verknüpft Enden

1. BER (Basen-Exzisions-Reperatur)

2. Photoreaktivierung, NER (Nukleotid-Exzisions-Reperatur)

3. homologe Rekombination, nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung

4. Mismatch-Reperatur

• Auslösen spezifischen genetischen Programms

  • Prokaryoten: SOS-Antwort

  • Eukaryoten: Checkpoint-Kontrolle

• Immer noch nicht: Einleitung Apoptose

• Immer noch nicht: Fixierung der Mutation

• bei Prokaryoten bei schweren Schäden

• POL ist bei Replikation blockiert, lange ES-Bereiche an Replikationsgabel

• ES aktiviert Hauptenzym RecA

• viele Gene aktiviert, Zellteilung gehemmt (Zeit für Reperatur)

  • RecA spaltet Repressor LexA

• Vermehrte Bildung der Konponente des NER-Apparates

• Fehleranfällig: gegenüber Pyrimidindimere kann zufällig eingebaut werden: erhöhte Mutationsfrequenz

• bei Eukaryoten

• Anhalten des Zellzyklus (Zeit zur Reperatur)

  • Schäden nicht an Tochterzellen weitergeben, notfalls Apoptose

  • Reparatur, ansonsten: Hemmung Replikation, Mitose, Gen-Altivität

• Vergleich mit Nachrichtentechnik:

  • Sensoren (Schadenswahrnehmung)

    • RFC-ähnlicher Komplex

    • PCNA-ähnlicher-Komplex

    • Kinasen

  • Transduktoren/Mediatoren (Signalweitergabe)

    • Kinasen Chk1 und Chk1

  • Effektoren (Signalempfang und Umsetzung)

    • Anhalten Zellzyklus

    • Transkriptionsfaktoren

    • Unterbechen Replikation

• Anhalten Zellzyklus und DNA-Reperatur

• Apoptose

• Menge nimmt zu nach DNA-Schäden

  • Phosphorylierung verhindert Abbau

  • Wirkt als Transkriptionsfaktor

  • In Checkpointkontrolle aktiviert

Ataxie-Teleangiektasie / Louis-Bar-Syndrom

• Mutation im ATM-Gen (Sensor)

• Störung …

  • im Immunsystem

  • Koordinierung Muskelbewegung

  • Neuromuskuläre Funktion

• Kein Stopp des Zellzyklus bei Schäden

• viele Chromosomenveränderungen, hohe Strahlenempfindlichkeit

• Freisetzung von Cytochrom C über Mitochondrien als Signal

• Caspasen (Proteasen) aktiviert

• Caspasen bauen Zellstruktur und Chromatin ab

• Phagozytose über Makrophage

• Basen-Exzisions-Reparatur (BER)

  • DNA-fremde Basen (Hypoxanthin, Uracil), Alkylierungen, oxidative Schäden, Schäden durch ionisierende Strahlungen

• Nukleotid-Exzisions-Reparatur

  • bulky adducts / UV-Schäden (Thymindimere)

• nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung

  • DS-Bruch außerhalb der S-Phase

• Postreplikative Mismatch-Reparatur

  • Mismatches oder Indels nach Replikation

• Photoreaktivierung

  • UV-Schäden: Thymindimere

• homologe Rekombination

  • DS-Bruch in S-Phase

• Verdrehung der DNA

• DNA-POL III Korrekturlesefunktion

  • 5’-3’-Polymeraseaktivität

  • 3’-5’-Exonukleaseaktivität: entfernt falsche Nukleotide

• postreplikative Mismatch-Reparatur

• MTHF: 5,10-Methylen-tetrahydrofolat

• FAD: Flavinadenin-dinucleotid

• Basen-Exzisions-Reparatur

  • 8-Oxoguanine (oxidative Schäden)

  • Uracil-AP-Stellen (fremde Basen)

• Nukleotid-Exzisions-Reparatur

  • Pyrimidindimere (UV-Schäden)

  • bulky adducts

• Photoreaktivierung

  • Pyrimidindimere (UV-Schäden)

• nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung

  • Doppelstrangbruch außerhalb der S-Phase

  • Zwischenstrang-Crosslinks

• Homologe Rekombination

  • Doppelstrangbruch in der S-Phase

  • Zwischenstrang-Crosslinks

• Postreplikative Mismatch-Reparatur

  • Fehlpaarungen

  • Indels