anderes Zeug

1. Prädenaturierung: der DNA: ist hoch komprimiert, man müsste sonst noch mehr Durchgänge machen -> taq-Pol knnte kaputt gehen

2. Denaturierung (40 sec 92°C)

3. Annealing d. Primer (spez. Temp. 1 min): ab 18 nt hohe WS dass Primer einzigartig ist, besteht aus Basen

4. Extension d. Primer durch taq-Pol. (72°C, 1 min): dNTPs (Buasteine), von 5’ nach 3’

5. Extension (72°C, 5 min): Bildung von Doppelsträngen

• Schritt 2 -4 werden in ca 30 - 40 Zyklen wiederholt

• Template (DNA-Strang)

• DNA-Polymerase

• Primer

• dNTPs

Polymerase chain reaction

• kann keine Fehler reparieren (“stall”)

  -> mehr als 1kb ist nur mit taq-Polymerase nicht sinnvoll

• einsetzen einer Polymerase mit 3’-5’-Exonucleaseaktivität (d.h. diese kann Fehler reparieren), hat dafür aber höhere Prozessivität -> bleibt länger auf 1 DNA-Strang; Bsp: Pfu-Polymerase

• Mix aus untersch. Polymerasen verwenden

• Temperatur

• Konzentration monovalenter Kationen

• Anzahl und Lokalisation fehlgepaarter Basen

  -> am Wichtigsten: am 3’-Ende muss komplementär gepaart sein, sonst kann der Strang nicht verlängert werden

Tm = ∑ von n (A/T) x  2°C + n (G/C) x 4°C

Beim anschließenden aufschlüsseln des PCR-Produktes dauert es ca 50/100/200 Nucleotide, bis das Signal eindeutig wird (BioEdit). Daher darf der Primer nicht zu nah an das zu sequenzierende Produkt gesetzt werden.

• Idee: Vermeidung der Reaktion aller Komponenten unter Annealing-Temperatur

  -> Minimierung der Menge unspeziefischer Produkte

  -> weniger Zyklen werden benötigt (30 mit hot-start = 35 ohne hot start), taq-Pol kann nach 35-40 Zyklen kaputt gehen

• Ausführung: Trennung der Komponenten mittels Wachsbarriere; binden der DNA-Pol an einen Antikörper

• single nucleotide polymorphism

• variation eines einzelnen Basenpaars in der DNA

• geerbt/ vererbbare genetische Varianten (“erfolgreiche Punktmutation”)

• kann Einfluss auf Gen-Transkription haben: (liegt in Exon; liegt in DNA-Abschnitten an die Transkriptionsfaktoren/ Polymerasen [Enhancer/Silencer/Promotoren] binden

  -> regulatorische SNPs

  -> Zusammenhang mit Arzneimittelverträglichkeit, Prädisposition versch. Krankheiten etc. (spezifische Therapie)

• Purine (Adenin/Guanin): R

• Pyrimidine (Cytosin/Thymin): Y

Eine Sequenz, die man von vorne und hinten lesen kann.

Bsp: 5’ GGATCC 3’ (BamHI)

• Restriktionsenzyme schneiden bei einer bestimmten palindromischen Sequenz

• wenn es in der Sequenz eine Mutation (SNP) gibt, oder diese durch eine Mustation (SNP) entstanden ist, entstehen zwei Allele

• diese können durch das Restriktionsenzym nachgewiesen werden (geschnitten und ungeschnitten)

• macht man eine PCR + Gelelektrophorese, so können diese Allele und somit die Anwesenheit/Abwesenheit eines SNPs nachgewiesen werden

• Ursprünglich aus Bakterien (Schutz vor DNA von Viren)

• zerschneiden an palindromischer Sequenz

  -> eigene DNA ist geschützt durch Methylierung

• zur genaueren Untersuchung von SNPs

• Vorwissen nötig: wo ist das SNP (wo liegt es genau)

• Wie PCR, aber mit ddNTPs statt dNTPs (ddNTPs können nicht verlängert werden; werden farblich markiert)

1. Primer reicht bis zum SNP und durch PCR wird um 1 ddNTP verlängert

2. Primer wird aufgereinigt & wichtiger Teil mittels UV-Licht abgetrennt

3. Auswertung der Ergebnisse -> Wissen welche Base beim SNP ausgetauscht wurde

Allelfrequenz von A =

• Anzahl der Allele = doppelte Anzahl an Individuen

• short intersperced nuclear element

• Elemente repetitiver DNA (200 - 400bp)

• sind transponierbar (können bei untersch. Individuen an untersch. Stellen auf dem Chromosom liegen)

• copy & paste Mechanismus: zuerst DNA in RNA , dann RNA wieder in DNA + einfügen

  -> bestehen meist aus tRNA (Zwischenstufe)

  -> benötigen externe reverse Transkriptase (häufig von LINEs kodiert)

• oft entartete Gene für kleine RNAs (7SL-RNA/tRNA)

• interne Promotorregion wird mitkopiert

1. 7SL-RNAs (besitzen RNA-Pol3-Promotor)

2. Primaten-Spezifisch !!

3. 10% des humanen Genoms (HSA > 1Mio Kopien)

4. 300bp lang

• die versch. SINE-Klassen sind in quasi allen eukaryotischen Genomen vertreten

• über lange evolutionäre Zeitspannen aktiv

• interne Promotorregion wird mitkopiert

1. long intersperced nuclear element

2. Elemente repetitiver DNA (~7000bp)

3. sind transponierbar (copy- & paste-Mechanismus)

4. haben reverse Transkriptase

5. ca 20% des menschl. Genoms

• SVAs

  -> sehr jung, springen viel

  -> E & F nur beim Menschen (A-D auch bei anderen Menschenaffen)

  
  

1. Retroposons (Alu-SINEs)

2. LTRs

• nicht rekombinierend

• maternal vererbt

• schnelle Evolution (ca. 10x schneller als Kerngenom)

  -> D-Loop (einzige Region auf der kein Gen liegt) evolviert am schnellsten

• multicopy

• durch Endosymbiose aufgenommen (Endosymbiontentheorie)

• oxidative Phosphorylierung

• zeitversetzt von 2 untersch. Replikationsursprüngen aus repliziert

• Ratenheterogenität

• verschiedene Regionen im Genom evolvieren unterschiedlich schnell

  -> z.B. Chyt-Gene im mtGenom evolvieren i.d.R. mit niedrigerer Rate als ND-Gene

  -> Substitutionsrate der hypervariablen Region ist noch stärker erhöht (besonders Hyp2)

• kein so effektives Reparatursystem (gibt es: base excision repair BER, missmatch repair MMR; gibt es nicht: nucleotide excision repair NER)

• wahrscheinlcih weniger stark gepackt -> anfälliger für Mutagene

• langsamere Replikation -> lange Einzelstrangphase -> anfälliger für Mutationen

• mehr Sauerstoffradikale (wegen oxidativer Phosphorylierung) -> Mutagene

• Rekombination d. linear organisierten nuclearen Genoms während Meiose (soll Variation erhöhen)

• notwendig, da die Bestandteile der PCR die Sequenzierung stören

  -> schmier

• überschüssige Primer (mit Exonuclease1 [Exo1])

• dNTPs/ ddNTPs (mit Shrimp alkaline phosphatase [SAP])

• Salze

• unspezifische PCR-Produkte

• Säulenaufreinigung

• Gelextraktion

• Ethanol-Fällung

• enzymatische Aufreinigung

• dNTPs (Desoxynucleotid)

• ddNTPs (Didesoxynucleotid; hat am 3’-Ende ein H statt ein OH)

• mutierte taq-Polymerase (damit sie die gleiche Affinität für dNTPs wie für ddNTPs hat)

• Primer

• DNA-Strang (Template)

• Mittel um die Nucleotidabfolge eines DNA-Strangs zu bestimmen

• 4 versch. Ansätze (jeweils 1 mit ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)

• Auftrennung aller 4 Ansätze auf einem Gelelektrophoresegel

  -> Bestimmung der Basenabfolge von unten nach oben

• baseline-noise

• dye-blobs

• überlappende Signale (schwächeres Produkt wird übersehen)

• heterozygote Positionsbelegung (->SNPs finden möglich)

• Verlust der Auflösung mit zuehmender Laufzeit/ Fragmentlänge

• Abrupter Verlust an Sequenzierqualität, wegen Sekundärstrukturen

  
  

  
  

• synonym: VNTR (variable number zandem repeats)

• Abschnitte der DNA im Genom, die aus tandemartigen Wiederholungen einer kurzen DNA-Sequenz (12-100nt) bestehen

  -> Anzahl der Wiederholungen im Vergleich mit anderen Satelliten-DNAs sehr gering (~5-50)

• Wiederholungen sind hochvariabel (Entstehung von unterschiedl. Allelen durch crossing-over und untersch. Anzahl an Wiederholungen)

• jeder Mensch hat sehr spezielle Zusammensetzung d. Allele

  -> nützlich für Fingerprinting

• synonym: STR (short tandem repeat)

• Serie sich wiederholender Nucleotidsequenzen

• bestehen aus 2-6 Nucleotiden (kann 10-100 mal wiederholt werden)

• häufigste Form repetitiver DNA

• Anzahl an Wiederholungen unterscheidet sich von Individuum zu Individuum

• genetischer Fingerabdruck, Muster von variablen DNA-Abschnitten (für jeden Menschen einzigartig)

• STRs

• Auflistung der Wiederholungsanzahlen in den STR-Genorten eines Individuums

• z.B. Klärung von Verwandtschaftsverhältnissen

  -> keine Aussage über sonstige Merkmale, außer das Geschlecht der Person möglich

• bei einem Genbaum werden die Verwandtschaftsverhältnisse basierend auf 1-weigen Genen rekonstruiert. Bei einem Stammbaum wird das “Große Ganze” betrachtet und auf dieser Basis die Rekonstruktion erstellt

• Analyse von DNA-Fragmenten

• Identifikation gesuchter Sequenz in der DNA

• zunächst PCR & Gelelektrophorese, dann Vorbereitung der Gels auf Southern Blot

  -> Blotting Übertragung von DNA-Muster auf Nylon-/ Nitrozellulosemembran

• Sondierung durch eine zur gesuchten DNA komplementäre DNA-Sonde (farblich/radioaktiv markiert)

• Entfernung der Überschüssigen Sonden

• Nachweismethode -> unterschiedl. je nach Sonde

1. DNA

2. RNA

3. Proteine

1. Gel mit HCl behandeln (0,25 M)

   -> DNA muss in kleine Stücke zerteilt werden, um eine bessere Übertragung auf die Nylon-/ Nitrozellulosemembran zu gewährleisten

   -> depuriniert DNA (N-glycosidische Bindungen gehen kaputt)

2. NaOH

   -> denaturiert DNA (macht einzelsträngig); damit Sonde später binden kann

3. TRIS 8pH

   -> neutralisiert das Gel

• evolutive Neuheit

• neues (=abgeleitetes, apomorphes, autapomorphes) Merkmal

Merkmalsübereinstimmung zweier Schwestertaxa, die auf eine evolutive Neuheit in der nur ihnen gemeinen Stammlinie zurückgeht

• Übereinstimmung von Taxa in einem ursprünglichen (=plesiomorphen), also bereits früher entstandenen Merkmal

• nicht für die Rekonstruktion von Verwandtschaftsverhältnissen nutzbar