Was sind Parameter für die Virus Aufreinigung?
Auswahl des Pflanzenmaterials
-> Holzige Pflanzen problematisch
Behandlung des Pflanzenmaterials und Extraktionsbedingungen
-> Viruspartikel können kaputt gehen
Abtrennung von Fremdbestandteilen
-> Nukleasen/Protease
Weitere Reinigungs- und Anreicherungsschritte
Lagerung von Virusproben
-> Potyviren können N- und C-Terminus verlieren -> Direkt benutzen
Kriterien für Reinheit, Infektiosität und Ausbeute
-> Elektronenmikroskopie usw.
Welche weiteren Punkte sollte man bei der Aufreinigung von Viren beachten?
1. Optimale Wachstumsbedingungen: Licht-, Nährstoff- und Wasserversorgung
2. Zeitpunkt der Virusreinigung nach der Inokulation - der Virustiter sollte so hoch wie möglich sein
3. Virusverteilung (Entfernung von Gewebeteilen vor der Aufreinigung): Einige Viren befinden sich
ausschließlich in den Blattadern
4. Ausschluss von latenten Infektionen im Vermehrungsmaterial:
Wichtig für die Antikörperproduktion (z. B.: Deep Sequencing zum Nachweis)
Welche weiteren Schritte müssen beachtet werden?
1. Die Viruspartikel müssen stabil bleiben, sie dürfen nicht zerbrechen
2. Viruspartikel sollten nicht aggregieren
3. Die Zellwände müssen "geöffnet" werden
- Mörser und Stößel
- Homogenisatoren
- Enzyme (Cellulasen, Pektinasen)
- Detergenzien
4. Neutralisierung des Vakuoleninhalts
- pH-Wert und Puffersystem
- Ionen und Ionenstärke
5. Inhibierung von Oxidasen, RNasen bzw. DNasen
- Schutzstoffe und Additive
Abtrennung von Viren von anderen Zellbestandteilen
6. Entfernung von Zellbestandteilen, Schleim, Enzymen und Proteinen
- Zellwände können Partikel adsorbieren
- Zellmembranen können an Viren haften (kleben)
- Protein/Nukleinsäure-Komplexe des Wirts müssen entfernt werden
- Im Homogenat können abbauende Enzyme wie Nukleasen, Proteasen und Lipasen aktiv werden
Wieso können Viruspartikel durch Zentrifugation von anderen Bestandteilen getrennt werden?
Die Sedimentationsrate ist von der Größe/Form/Dichte der Teilchen abhängig
Große und dichte Partikel sind am schnellsten
Was ist die Zonen- und Isopyknische Zentrifugation?
Zonen-Zentrifugation
Isopyknische Tentrifugation
Gradient
Flach
Steil
Mediendichte
Weniger Dicht, als das am wenigsten Dichte Partikel
Dichter als das dichteste Teilchen
Sedimentation
Niedrige g-Zahl, kurze Zeit, Partikel ordnen sich in Zonen
Hohe g-Zahl, lange Zeit, Partikel bleiben am Punkt ihrer Dichte
Wichtig!
Trennung von Teilchen mit ähnlichen Sedimentationsraten, aber unterschiedlicher Größe/Masse
Trennung von Teilchen mit ähnlicher Größe/Masse, aber unterschiedlicher Dichte
Was hat es mit der Reinheit und Homogenität von Viren aufsich?
Was ist Plus-Strang RNA?
Eine RNA, die direkt von Ribosomen translatiert werden kann
Was ist Minus-Strang RNA?
RNA muss zunächst kopiert werden
Der dabei enstehende (+)-Strang wird dann für die Translation genutzt
Viren können auch dsDNA oder ssDNA besitzen. Was ist das Besondere an den Strängen des ssDNA?
Zur Unterscheidung der beiden möglichen Stränge nach der Replikation von ssDNA-Viren wird vom viralen und komplementären Strang gesprochen
Der virale Strang ist dann der, welcher in der Hülle des Virus verpackt ist
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