Kapitel 3

Bezeichnet einen Trennprozess, bei welchem ein Probengemisch zwischen zwei nicht miteinander mischbaren Phasen im sog. chromatographischen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird.

Eine stationäre Phase ruht dabei, während die mobile Phase an ihr vorbei strömt.

• Flüssig-Fest-Chromatographie

  • Engl.: Liquid-Solid-Chromatography, LSC

  • Normale HPLC wird als LSC durchgeführt

• Flüssig-Flüssig-Chromatographie

  • Engl.: Liquid-Liquid-Chromatography, LLC

  • Sonderfall HPLC: Größenausschluss-Chromatographie ist LLC

• Gas-Fest-Chromatographie

  • Engl.: Gas-Solid-Chromatography, GSC

  • Selten wird GC als GSC durchgeführt

• Gas-Flüssig-Chromatographie

  • Engl.: Gas-Liquid-Chromatography, GLC

  • Sehr oft wird GC als GLC durchgeführt.

1. Adsorptionsgleichgewicht (feste stationäre Phase, flüssige mobile Phase)

» Adsorptionschromatographie

2. Verteilungsgleichgewicht (flüssige stationäre Phase, flüssige oder gasförmige mobile Phase)

» Verteilungschromatographie

3. Ionenaustauschgleichgewicht (Ionenaustauscher als stationäre Phase, Elektrolyt als mobile Phase)

» Ionenaustauschchromatographie.

4. Gleichgewicht zwischen einer mobilen und einer stagnierenden flüssigen Phase

» Gelpermeationschromatographie.

5. Gleichgewicht zwischen einem immobilisierten Liganden und einer flüssigen mobilen Phase

» Affinitätschromatographie.

• Beschreibt das Verhalten einzelner Moleküle während des chromatographischen Vorgangs

• Voraussetzungen für chromatographischen Prozess müssen gegeben sein

  • Eine stationäre Phase.

  • Eine mobile Phase

  • Mobile Phase ist nicht mit stationärer Phase mischbar.

  • Mobilphase führt Substanzen über Stationäre phase hinweg

  • Substanzen, die an oder in die Stationärphase gehen und auch wieder von ihr gelöst werden können.

• Das Verhalten von Booten (= Substanzen) auf einem konstant fließenden Fluss (= mobile Phase) wird als Sinnbild des Verhaltens einzelner AnalytMoleküle während des chromatographischen Prozesses genommen

  • Das Ufer stellt die stationäre Phase dar, an der die Boote unterschiedlich oft anlegen.

• Alle Analyten (= Boote) starten zur gleichen Zeit

• Fließgeschwindigkeit der Mobilphase ist konstant

• Entscheidend für die Trennung ist die unterschiedliche Verweildauer (NettoRetentionszeit, tS ) in oder an der Stationärphase

• Wechselwirkungen mit der stationären Phase sollten demnach

  • stark genug für ausreichende Verzögerung sein

    » tR > tM

  • reversibel sein, damit Analyten wieder in die mobile Phase zurücktreten

    » tR < ∞

  • selektiv sein, um verschiedene Analyten unterschiedlich zu beeinflussen und somit zu trennen » tR1 ≠ tR2 bzw. tS1 ≠ tS2.

• Zerlgeung in einzelne Böden

• Zahlreiche Adsorptions und Verteilungsschritte

• Zahl theoretischer Böden (Bodenzahl) = Maß für Güte der Trennung

• Bodenzahl-Bestimmung: Peakbreite in Bezug zur Retentionszeit

• Je breiter zwei gegebene Peaks mit ähnlicher Retentionszeit sind, desto wahrscheinlicher ist Peak-Überlappung.

• Mehr Böden = Mehr WW, kleinere höhrere Peaks

• Mehr böden brauchen mehr Zeit, wird länger zurückgehalten = besser

• Bodentheorie kann erwartete Säuleneffizienz nicht garantieren.

• In Wirklichkeit kann der Gleichgewichtszustand niemals realisiert werden.

• Die Peakverbreiterung ist zusätzlich abhängig von

» Linearer Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase.

» Diffusionskoeffizienten von Substanzen in stationärer und mobiler Phase.

» Dicke des Flüssigkeitsfilms auf der stationären Phase

» Bei flüssiger stationärer Phase, hauptsächlich GC.

» Korngröße und Korngrößenverteilung der Packung der stationären Phase

» Bei fester stationärer Phase, überwiegend HPLC.

• Wanderungsgeschwindigkeiten für Substanzen beschreiben

  » Kapazitätsfaktor k‘

  » Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz relativ zum Lösungsmittel.

  » Selektivitätsfaktor alpha

  » Wanderungsgeschwindigkeit zweier Substanzen A und B relativ zueinander

• Gaußsche Form der chromatographischen Peaks erklären und Effizienz einer Säule beschreiben

  » Bodenhöhe H (Trennstufenhöhe).

  » Bodenzahl N (Trennstufenzahl)

• Effizienz einer Säule als Bodenzahl experimentell bestimmen » Auswahl mobiler und stationärer Phase für Analyten ist optimierbar.

  » Optimale Säulenlänge und Säuleneffizienz ist ermittelbar. » Säuleneffizienz ist experimentell kontrollierbar

  » Wichtig für Methodenvalidierungen und deren laufende Überprüfung in der pharmazeutischen Industrie.

• Peakverbereiterung

  • Substanzbande hat am Säulenanfang bestimmte Breite

  • Bande wird entlang der Trennstrecke breiter durch

    » Diffusionseffekte

    » Behinderungen der Gleichgewichtseinstellung.

    » Unterschiedliche Wege der Analyten

  • Je länger die Verweildauer im System (also je größer die Retentionszeit), desto stärker können sich Diffusionseffekte, langsame Gleichgewichtseinstellungen und Wegunterschiede der Substanzen auswirken.

  • Peaks werden breiter und flacher, je länger sie im chromatographischen System verbleiben.

  
  

• Dynamische Theorie:

  Beschreibt Zusammenhang zwischen Trennleistung und dynamischen Eigenschaften des Chromatogramms

• Trennstufenhöhe H

  » Wird in Bezug gesetzt zu Diffusionseffekten und zur Fließgeschwindigkeit u der mobilen Phase

  » Niedrige Trennstufenhöhe bedeutet gute Trennleistung.

• Ursachen der Peakverbreiterung nach van Deemter

  » Streu-Diffusion (Eddy-Diffusion)

  » Längs-Diffusion (Longitudinal-Diffusion, axiale Diffusion). » Störung der Gleichgewichtseinstellung

• Unterschiedliche Korngrößen in Säule

  » Wege der Analyten sind verschieden.

  » Bei großen Partikeln ist der Weg kurz, bei kleinen Partikeln ist es ein längerer Weg, da diese dichter gepackt sind.

• Ungleichmäßige Packung der Säule

  » Kanäle zwischen den Partikeln verursachen ein Strömungsprofil

  » Strömungsgeschwindigkeit ist mittig höher als an Rändern.

  » Hohlräume verlängern auch die Wege.

• Porengröße

  » Große Poren haben schlecht durchströmte Bereiche

  » Analyten in diesen Bereichen können nur durch Diffusion wieder in den Fluss der Mobilphase zurückkehren.

• Analyten diffundieren mit und gegen die Fließrichtung der mobilen Phase

• Diffusion in Fließrichtung

  » Verkürzte Retentionszeit.

• Diffusion gegen Fließrichtung

  » Verlängerte Retentionszeit.

• Führt zu unterschiedlichen Retentionszeiten von gleichen Analytmolekülen.

• Bei großer Flussrate

  » Diffusion gegen Fließrichtung geht gegen null

  » Gut für schmale Peaks

• Chromatographie: Gleichgewichtseinstellung zwischen Stationär- und Mobilphase » Einstellung mit endlicher Geschwindigkeit.

• Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit

  • Gute Trennung

  » Niedrige Flussrate

  » Gleichgewichtseinstellung ist vollständig.

  • Schlechte Trennung

    » Zu hohe Flussrate

    » Weitertransport des Analyten vor Erreichen des Gleichgewichts.

  » Keine Gleichgewichtseinstellung möglich.

• A-Term: Streu-Diffusion

  » Strömungsunabhängig. H = A

• B-Term: Längs-Diffusion

  » Nur bei langsamer Strömung relevant.

• C-Term: Störung der Gleichgewichtseinstellung » Nur bei schneller Strömung relevant, abhängig von Schichtdicke bzw. Partikelgröße. H ~ C· u

• A-, B- und C-Term ergeben H.

• Bei uopt liegt Hmin und die Trennleistung des Systems ist optimal.

• Strömungsunabhängige Diffusion minimieren

  » Kleinere Stationärphasen-Partikel (= kleinere Korngrößen) einsetzen » Größere spezifische Oberfläche.

  » Größere Kontaktfläche.

  » Mehr Böden bzw. Gleichgewichtseinstellungen möglich.

  » Geringere Säulendurchmesser verwenden.

  » Stationärphasen-Material sollte eine enge Korngrößen-Verteilung und eine kleine Porengrößen-Verteilung besitzen

  » Ausnahme: Bei GPC ist eine unterschiedliche Porengröße nötig.

  » Große Poren in den Partikeln sollten vermieden werden

  » Ausnahme: Bei GPC ist dies erwünscht!

  » Das Stationärphasen-Material sollte homogen in der Säule gepackt sein

  » Säulen werden daher maschinell gefüllt.

• Strömungsabhängige Diffusion minimieren

  » Optimale Flussrate mit minimaler Trennstufenhöhe experimentell ermitteln.

• Einfluss Korngrößenoberfläche

  » Unregelmäßigere und porösere Kornoberfläche verursacht breitere Peaks.

  » Schlechtere Trennung.

• Einfluss Korngröße

  » Schmalere Peaks bei kleinerer Größe

  » Bessere Trennleistung.

• Kleine kugelförmige Packungsmaterialien mit geringer Porösität werden bevorzugt.

• Typische stationäre Phasen sind Siliciumoxide (Kieselgur, Kieselgel, auch in modifizierter Form), Mg-silicat, Mg-oxid, Al-oxid oder Cellulose.

► Normalphase (NP, klassisch) » Polare stationäre Phase

» Kieselgel, Al2O3.

» Unpolare mobile Phase

» Kohlenwasserstoffe wie Hexan und Pentan, Dioxan, Ethylacetat.

► Umkehrphase, Reversed Phase (RP)

» Unpolare stationäre Phase

» Modifiziertes Kieselgel.

» Polare mobile Phase

» Wasser, wässrige Puffer, Methanol, Acetonitril.

• Lösemittel für mobile Phasen haben unterschiedliche Polaritäten und damit verschiedene Elutionskräfte.

• Vergleich polarer Analyt mit Referenz-Phase

  » Normalphase: Kieselgel.

  » Umkehrphase: C18-Alkylrest.

• Elutrope Reihe: Anordnung der Lösemittel nach auf- oder absteigender Elutionskraft in Abhängigkeit der stationären Phase.

• Aufnahme in stationärer Phase

  • Verteilungs-Gleichgewicht zwischen einer stationären Flüssig-Phase (in der Grafik als blaue Streifen dargestellt) und einer mobilen Flüssig- oder Gas-Phase.

  • Unterschiedliche Verteilung von Stoffen in zwei Flüssigkeiten oder in einem Gas und einer Flüssigkeit » Prinzip der Trennung

  • Eine Flüssigkeit ist stationäre Phase (z.B. der Wassermantel auf Cellulosefasern), andere Flüssigkeit ist mobile Phase (z.B. Butanol)

• 
  

• Poröse Gele mit definierten Porengrößen (z.B. 30 Å bis 30.000 Å) als stationäre Phase

  » Moleküle größer als die größten Poren des Gels werden mit mobiler Phase ohne Verzögerung durch Säule transportiert

  » Moleküle über einer gewissen Größe wandern also gleich schnell und werden nicht mehr getrennt.

  » Nennt man Ausschlussgrenze.

  » Kleine Moleküle diffundieren in die Poren stetig rein und raus und legen dadurch größere Wegstrecken zurück.

  » Je kleiner ein Stoff (= Molekülgröße) ist, umso langsamer wird er durch die stationäre Phase wandern

  » Prinzip der Trennung („Molekül-Sieb“).

  » Nennt man Gelfiltration, Gelpermeationschromatographie (GPC) und engl. Size Exclusion Chromatography (SEC).

• Ionenaustausch-Gleichgewicht zwischen einem stationären Ionenaustauscher und Elektrolyten in der mobilen Phase.

• Stationäre Phase

  » Harz mit gebundenen Gruppen, die eine positive oder negative Ladung tragen.

  » Entgegengesetzt geladene Teilchen (Ionen aus der mobilen Phase und Analyten) werden reversibel elektrostatisch gebunden und wieder „gelöst“, also ausgetauscht.

  » Je stärker ein Ion an Ladungsträger der stationären Phase gebunden ist, umso schwieriger wird es sich austauschen lassen, um so länger wird es demnach zurückgehalten

  » Prinzip der Trennung.

  » Kationenaustauscherharz, tauscht z.B. H3O+ gegen Kationen.

  » Anionenaustauscherharz, tauscht z.B. OH- gegen Anionen. 09.01.2023 Instrumentelle Analytik – Biobac 3 88 Trennprinzipien Ionenaustausch – Verdrängungs-Wettbewerb

• Stationäre Phasen

  » Kationen- und Anionenaustauscherharze

  » Haben verschiedene Endgruppen: -SO3 - , -COO- , -NH3 + , N(CH3 )3 + , ….

• Mobile Phasen

  » Sind meist Pufferlösungen

  » Hydrogencarbonat-, Hydrogenphosphat-, Acetat-Puffer,

• Anwendungen

  » Ionenchromatographie (IC), z.B. Anionen in Mineralwasser.

  » Entfernung von Schwermetallen aus Trinkwasser.

  » Herstellung von deionisiertem Wasser

  
  

• Verteilungs-Gleichgewicht zwischen einer stationären Schicht immobilisierter Liganden und spezifischer Bindungspartner in mobiler Flüssigphase.

• Stationäre Phase enthält Liganden, an denen nur ganz bestimmte Moleküle mit geeigneten Strukturen nicht-kovalent anbinden können (Schlüssel-Schloss Prinzip)

» Nur diese Moleküle mit passendem Rezeptor werden

gebunden und somit verzögert

» Prinzip der Trennung.

» Elution mit kompetitierenden Liganden, durch

Änderung der Pufferzusammensetzung oder des pHWerts der mobilen Phase.

• Trennung nutzt spezifische Eigenschaften eines Moleküls anstatt kleiner physikalischer Unterschiede zwischen verschiedenen Molekülen

» Dies ist eine hochspezifische Trennung!

1. PC = Papierchromatographie

2. DC = Dünnschichtchromatographie

3. SC = Niedersäulenchromatographie

4. HPLC = Hochdrucksäulenchromatographie

5. GC = Gaschromatographie