Proteine sollen nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Welche Art von Trägermaterie ist in einer Gelelektrophprese für die meisten Proteine geeignet und welches Detergenz wird am häufigsten eingesetzt?
• Polyacrylamid-Gel
• SDS
Wie ist der molekulare Mechanismus der Proteinbestimmung nach Bradford? In welchem pH-Bereich läuft die Proteinbestimmung ab?
• Farbstoff Coomassie brilliant blue lagert sich an Proteine/Peptide (je blauer der Komplex, desto mehr Proteingehalt)
• In saurer Lösung
Skizzieren sie die Absorptionsspektren von NAD+ und NADH in einem Diagramm (molare Absorption vs. Wellenlänge) und benennen sie die Absorptionsmaxima.
Formulieren sie das Lambert-Beer'sche Gesetz. Erläutern sie die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen
Wie ist der molekulare Mechanismus der Proteinbestmmung mit der „Biuretmethode“? Erläutern sie die Vorgänge und die notwendigen Detergenzien.
Warum wird für die Herstellung eines Polyacylamidgels Ammoniumpersulfat eingesetzt?
Dient als Polymerisationsstarter
Sie benötigen 500 µl einer 10%-igen Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung. Wie viel APS wägen sie ein?
50 µ
Nennen sie zwei Färbungen für Proteine, die häufig in Polyacrylamidgelen eingesetzt werden
• Standard-Färbung: Coomassie Brilliant Blue
• Silberfärbung: Fluoreszenzfarbstoff
Proteine sollen nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Zu welcher Elektrode wandern die Proteinmoleküle nach Behandlung mit SDS (Natriumdodecylsulfat)? Welches Reagenz wird in der Regel zur Reduktion von Disulfidbrücken hinzugegeben?
• Anode (Pluspol)
• Harnstoff, b-Mercaptoethanol
Was ist das Besondere an der gelelektrophoretischen Auftrennung von Proteinen (bezogen auf isoelektrischen Punkt), wieso hören sie ab einem bestimmten Punkt auf zu wandern?
• Proteine/Aminosäuren sind Zwitterionen
• Die Proteine wandern bis zu ihrem isoelektrischen Punkt. Es hört dort auf zu wandern, da es dort keine Nettoladung mehr trägt
Nenne zwei Methoden, um Proteine aufzutrennen
• Ionenaustauschchromatographie (IEX)
• Isoelektrische Fokussierung (IEF)
• Gelfiltration (Ausschlusschromatographie)
• Affinitätschromatographie
• Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
Nennen sie zwei chromatografische Trennverfahren zur Aufreinigung von Proteinen und beschreiben sie kurz, nach welchen Eigenschaften sie die Proteine trennen.
• Ionenaustauscher: Trennung anhand von Ladung
• Gelfiltration: Trennung anhand von Größe & Form
Welches sind die beiden essenziellen Schritte, über die Proteine auf einem Westernblot (Immunblot) in der Regel spezifisch sichtbar gemacht werden?
1) SDS-Page
2) Übertragung der Proteine vom Gel auf eine Membran
3) Detektion eines einzelnen Proteins mittels antikörpergekoppelter Farb-/Lichtreaktion
Antikörper1 binden an das Protein
Antikörper2 (+ Enzym oder Farbstoff oder radioaktiv) bindet an Antikörper1
Welche Effekte auf Proteine hat das bei Polyacrylamid-Gelelektrophorese eingesetzte SDS?
Durch Anlagerung von SDS bekommen Proteine negative Ladung und wandern im elektrischen Feld zur Anode (Pluspol)
Welche Moleküle werden in folgenden Verfahren jeweils nachgewiesen?
• Northern-Blot: RNA
• Western-Blot: Proteine
• Southern-Blot: DNA
Wofür sind Acrylamid und Bis-Acrylamid
Für Querverknüpfung in der SDS-Gelelektrophorese
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