4.Genetik

Chromosom

langer Strang aus der Erbinformation Desoxyribonukleinsäure (DNA)

*extrem komprimiert

*menschlichen Körperzelle: 46 Chromosomen im Zellkern —> unterschiedlich bei anderen spezien

*Zwei Chromosomen bilden jeweils ein Chromosomenpaar

*Auf einem Chromosom sind die Gene festgelegt

*Gen: Abschnitt auf der DNA, der den Bauplan für ein Protein darstellt

*Innerhalb eines Chromosomenpaares sind die gleichen Gene festgelegt, doch zwischen unterschiedlichen Paaren unterscheiden sie sich

*Gesamtheit aller Chromosomen: Chromosomensatz

*DNA ist um eine Gruppe des Proteins Histon gewickelt

*Komplex aus DNA und Proteinen: Chromatin

*DNA bei Eukaryoten: Chromatinfäden

*während der Zellteilung: Chromatinfäden komprimiert (typische X-Form der Chromosomen) —> Mitose und Meiose einfacher stattfinden, ohne dass sich die Spindelfäden mit den Chromatinfäden verwirren

*Prokaryoten enthalten im Gegensatz zu den doppelsträngigen Chromosomen der Eukaryoten das sogenannte Bakterienchromosom und Plasmide

*Bakterienchromosom besteht aus größeren und die Plasmide aus kleineren DNA-Molekülen

Vom Gen zum Protein

4 Basen kodieren für 20 AA —> Triplett-Kodierung erforderlich 4³=64 Kombinationen mit redundanten Projektionen —> entarteter Code

Mensch: 20.000 proteinkodierende Gene (~1.000 Gene pro Chromosom). Das Alter der Chromosomen kann anhand der Telomerlänge beurteilt werden (Lebensuhr der Chromosomen?)

Prokaryoten:

kein Zellkern, Gensequenzen in 1 großen Ring verteilt (DNA, 4x10 6 bp), Plasmide = extrachromosomale Kleinring-DNA (1-10 Kopien eines Plasmids pro Bakterium), bis zu 5 verschiedene Plasmidklassen, E.coli ~4500 Gene

Eukaryoten:

Zellkern, auf n Chromosomenpaaren verteilte Gensequenzen (DNA), viele nichtkodierende Sequenzen (Introns), Spleißen von hnRNA nach der Transkription, um Introns zu entfernen und mRNA zu erzeugen

Gentransfer in Bakterien:

• Transformation —> Aufnahme nackter Spender-DNA durch Empfängerbakterien

• Transduktion —> DNA-Transfer über Bakteriophagen (Bakterien-angreifendes Virus)

• Konjugation —> Plasmidtransfer über Pilus (zytoplasmatische Brücke), erfordert das Vorhandensein von F-Plasmid; Austausch des F-Plasmids (obligatorisch) plus Teile des Chromosoms und teilweise anderer Plasmide

Molekulare Schere - Ligase + Restriktionsenzyme

Molekularbiologisches Verfahren, um einen DNA-Strang an einer vorgegebenen Stelle zu durchschneiden und dort gezielt zu verändern. An der Schnittstelle können einzelne DNA-Bausteine eingefügt, entfernt oder modifiziert werden. Das Verfahren funktioniert grundsätzlich bei allen Organismen.

Biotechnologische Aufhebung der Artengrenzen (Klonierung)

In höheren Organismen (Säugetieren) zu viele nicht kodierende Introns, die durch Restriktionsendonucleasen in zu viele unsinnige DNA-Abschnitte geschnitten werden

—> Verwendung von mRNA stattdessen (keine Introns mehr nach dem Spleißen vorhanden)

—> Verwendung von reverser Transkription (reverse Transkriptase von Retroviren) in cDNA

—> mit cDNA-Klonierung möglich

Diabetes Mellitus

Weltweit häufigste Stoffwechselerkrankung (~6% der Erdbevölkerung)

• Typ-II-Diabetes häufigste „Krankheit der Reichen“

• Gefördert durch Bewegungsmangel, Übergewicht, zuckerreiche Ernährung

• befürchtete Spätfolgen: Nierenversagen, Erblindung, Schlaganfall, Herzinfarkt, Neuropathien, Schmerzen…

• Neben Glucagon erhöhen Adrenalin, Cortisol und Somastatin den Blutzuckerspiegel

Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit) ist ein Überbegriff für verschiedene Erkrankungen des Stoffwechsels. Allen gemeinsam ist, dass sie zu erhöhten Blutzuckerwerten führen, weil die Patientinnen und Patienten einen Mangel am Hormon Insulin haben und/oder die Insulinwirkung vermindert ist. Medizinisch unterscheidet man verschiedene Diabetes-Formen. Die Hauptformen sind der Typ-1- und der Typ-2-Diabetes mellitus.

Typ-1-Diabetes

• wird durch einen absoluten Mangel des Hormons Insulin verursacht, dieser Diabetestyp heißt deshalb auch insulinabhängiger Diabetes mellitus,

• wird durch ein absolutes Versagen der Zellen in der Bauchspeicheldrüse, die das Hormon Insulin produzieren, verursacht,

• beginnt meist im Kindes- und Jugendalter,

• ist bisher nicht heilbar, so dass die Patientinnen und Patienten ihr ganzes Leben lang Insulin spritzen müssen.

Typ-2-Diabetes

• entsteht zum einen durch eine verminderte Empfindlichkeit der Körperzellen für Insulin (Insulinresistenz), zum anderen führt eine jahrelange Überproduktion von Insulin zu einer "Erschöpfung" der insulinproduzierenden Zellen (die Bauchspeicheldrüse kann nicht genügend Insulin für den erhöhten Bedarf liefern),

• beginnt meist schleichend,

• wurde früher auch als "Altersdiabetes" bezeichnet, jedoch erkranken in den letzten Jahren auch zunehmend junge Erwachsene, sogar Jugendliche daran.

• Neben einer erblichen Veranlagung gelten Übergewicht und Bewegungsmangel als die wichtigsten Verursacher eines Typ-2-Diabetes. Aber auch eine unausgewogene (ballaststoffarme, fett- und zuckerreiche) Ernährung und Rauchen begünstigen die Entstehung von Typ-2-Diabetes.

• Es stehen verschiedene Therapiebausteine zur Verfügung. Am wichtigsten sind zunächst regelmäßige Bewegung, angepasste Ernährung und ein normales Körpergewicht. Dies verbessert die Empfindlichkeit der Körperzellen für Insulin und kann so den Insulinbedarf senken. Zu Beginn der Therapie wird deshalb immer versucht, mit Allgemeinmaßnahmen, wie konsequente Lebensstiländerungen, auszukommen.

• Sind Allgemeinmaßnahmen nicht erfolgreich, stehen verschiedene Medikamente zur Verfügung, die zum Beispiel als Tabletten eingenommen werden können. Erst wenn es auch mit diesen Medikamenten nicht gelingt, die Erkrankung in den Griff zu bekommen, muss auch bei Typ-2-Diabetes Insulin gespritzt werden.

Was ist Insulin?

Insulin ist ein körpereigenes Hormon. Es ist lebenswichtig und wirkt allgemein blutzuckersenkend und wachstumsfördernd für die Muskulatur. Am bekanntesten ist das Insulin als Stoff, der den Blutzuckerspiegel senkt und mit dem Diabetiker Probleme haben. Das Hormon stimuliert aber auch die Muskeln, damit sie neues Muskeleiweiß bilden – das ist die sogenannte Proteinsynthese. Insulin hemmt aber auch den Abbau von Fett, die Lipolyse, und fördert den Aufbau von Fett, die Lipogenese.

Produktion

Insulin entsteht in der Bauchspeicheldrüse (Pankreas), genauer gesagt in den Beta-Zellen, die sich in den Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse befinden. Die Betazellen produzieren zunächst eine Vorstufe, das Proinsulin. Es spaltet sich auf in ein Insulin-Molekül und ein sogenanntes C-Peptid. Beide werden im gleichen Verhältnis ausgeschüttet. Der Spiegel des C-Peptids im Blut lässt sich messen – und auf diese Weise feststellen, ob der Körper noch eigenes Insulin produziert.

In den Alpha-Zellen der Bauchspeicheldrüse bildet der Körper zudem das Hormon Glukagon. Es ist der Gegenspieler des Insulins: Während Insulin den Blutzucker senkt, fördert Glukagon die Bildung und Freisetzung der hauptsächlich in der Leber gespeicherten Zuckerreserven ins Blut und lässt den Blutzuckerspiegel ansteigen.

Genauer chem. Prozess:

1) das Präproinsulin-Molekül, bestehend aus:

• einer Signalsequenz (leader peptide, im Bild L) mit 24 Aminosäuren,

• an die sich die 30 Aminosäuren der B-Kette schließen,

• danach kommt das C-Peptid (connecting peptide, im Bild C) mit 30 Aminosäuren,

• gefolgt von der A-Kette mit 21 Aminosäuren.

2) Faltung

Durch Bildung von drei Disulfidbrücken (zwei zwischen dem A- und B-Peptid, eine innerhalb des A-Peptids) wird das bisher gestreckte Molekül gefaltet.

3) das gefaltete Präproinsulin-Molekül.

4) Abspaltung von Signalpeptid und C-Peptid:

• Beim Durchtritt durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) entsteht durch Abspaltung der Signalsequenz das Proinsulin mit 84 Aminosäuren. Das Signalpeptid verbleibt in den Zisternen des ER.

• Das Proinsulin verlässt das ER, wird in den Golgi-Apparat aufgenommen und gespeichert.

• Bei Bedarf wird die C-Kette durch spezifische Peptidasen abgespalten. Damit hat das Insulin seine endgültige Struktur erreicht.

5) das Insulin-Molekül:

Es besteht nun aus zwei Peptidketten, der A-Kette mit 21 und der B-Kette mit 30 Aminosäuren, welche durch zwei Schwefelbrücken (Disulfidbrücken) zusammengehalten werden (A7-B7 und A20-B19). Eine dritte Disulfidbrücke verbindet die Cysteinreste der Positionen 6 und 11 der A-Kette.

Regulation

Schweineinsulin, aus den β-Zellen des Schweins gewonnenes Insulin. S. unterscheidet sich in seiner chemischen Struktur durch eine Aminosäure vom menschlichen Insulin. Nach der Extraktion wird das S. aufbereitet und gereinigt, sodass aus einem Kilo Schweinepankreas zwischen 100 und 200 mg reines Insulin gewonnen werden.Die Wirkcharakteristika entsprechen im Wesentlichen denen des Humaninsulins, jedoch ist die Gefahr einer allergischen Reaktion bzw. die Bildung von Insulinantikörpern höher. S. werden deshalb heute nicht mehr bei Diabetes-Neueinstellungen verwendet.

Gentechnisch hergestelltes Insulin

Problem:

Der Jahresbedarf eines Diabetikers erfordert Bauchspeicheldrüsenextrakte von 50 Schweinen

—> bis zu 11 Tonnen (!) Bauchspeicheldrüsengewebe von Schlachtschweinen pro Tag

—> Seit 2005 kein Insulin tierischen Ursprungs mehr in Deutschland vertrieben!

Herstellung:

ß-Zellen aus Ratten-Pankreas-Tumor

--> Isolierung von Präpro-Insulin-mRNA

--> cDNA mit reverser Transkriptase

--> Schneiden mit Restriktionsendonuclease, Einfügen von Sticky Ends in bakterielles Plasmid mit Resistenzgen gegen Penicillin und Tetracyclin

Clever: Die Kopplung des Insulin-Gens an ein Antibiotika-Gen war notwendig, sonst wäre das Insulin in den Bakterien verblieben. Auf diese Weise wurde es mit Penicillinase in das äußere Medium sezerniert!

Die beiden Gene für die A- und die B- Kette des Insulins werden getrennt produziert.

Das jeweilige Gen (zusätzlich mit einem Startcodon für Methionin ausgestattet) wird hinter das lac Z-Gen der E. coli exprimiert.

Dieses lac Z-Gen ist das Gen für das Enzym Galactosidase.

Dieses Gen steht unter der Kontrolle eines durch Laktose zu aktivierenden Promotors.

Die Ligation [Verbindung durch Ligasen] von Vektor und Strukturgen [Insulingen] führt zu einem Fusionsprodukt mit einem durchgängigen Leseraster vom Startcodon des lac Z-Gens bis zum Stopcodon der Gene von A- bzw. B-Kette.

Durch zusätzlichen Einbau eines Resistenzgens gegen ein Antibiotikum kann später eine gezielte Selektion erfolgen.

Auf den Nährboden wird ein Antibiotika gegeben, so dass nur die Bakterien überleben, die das Resistenzgen (und somit auch das Insulingen) haben.

Dazu ist das Verfahren der sogenannten Replika-Plattierung nötig.

Durch Zugabe von CaCl2 wird die Membran des Bakteriums für das rekombinante Plasmid permeabel gemacht.

Nach dieser Transformation (Aufnahme der freien DNA) von E. coli können die beiden Ketten des Insulins synthetisiert werden, sobald auch Laktose zugegeben wird um den inaktiven Promotor zu aktivieren.

Wenn die Wirtsorganismen die Ketten in genügender Menge herstellen werden sie nach und nach in immer größeren Fermentern vermehrt, die teilweise bis über 2000 Kubikmeter groß sind. Dort gedeihen sie unter optimalen Bedingungen auf einem speziellen Nährboden.

Um das Insulin zu erhalten werden die Bakterien abgetötet und aufgebrochen. Die Peptidketten der Proteine hinter Methionin werden mit Hilfe von Bromzyan abgespalten und die Ketten werden isoliert.

Die Ausbildung der Disulfidbrücken zwischen den beiden Ketten wird durch Oxidation in einer Lösung erreicht.

In-Vitro-Fertilisation (künstliche Befruchtung)

15% der Bevölkerung leiden an unfruchtbarer Kinderlosigkeit!

Sehr häufig liegt das Problem auf der männlichen Seite (Azoospermie, Mikrospermie, Spermienfunktionsstörung), im höheren Alter aber auch auf der weiblichen Seite (Prämenopause, Ovarialfunktionsstörung)

Verfahren:

• Hormonstimulation der Frau, um eine multiple Follikelreifung zu induzieren

• Nach 10 – 14 Tagen bei einer Größe von ~20 mm HCG (humanes Choriongonadotropin) Auslöseinjektion zur vollständigen Reifung

• Nach 36 h ultraschallgesteuerte Follikelpunktion

• Follikel in Petrischale mit Sperma inkubiert

• 70-80 % der Eizellen werden befruchtet

• Zellteilung bis zum 4-Zell-Stadium im Inkubator (2 Tage)

• 3. Tag 8-Zell-Stadium, Auswahl der besten drei Embryonen und Katheterimplantation in die Gebärmutter

• Schwangerschaftstest 12 Tage später, Aufrechterhaltung einer normalen Schwangerschaft

Probleme bei der Hormonbehandlung:

Reizüberflutungssyndrom, Thrombose, Schlaganfall, Vernarbung der Eierstöcke mit langfristiger Unfruchtbarkeit, Anästhesierisiko

ICSI, Kryokonservierung

Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI):

Direkte Injektion eines einzelnen Spermiums in eine Eizelle unter dem Mikroskop unter Verwendung von Mikromanipulatoren

Indikation:

zuvor erfolglose IVF, Spermienstörung mit fehlender Penetrationsfähigkeit —> Zwangsbefruchtung (Misserfolg fast ausgeschlossen!)

Kryo-Konservierung:

Spermatozoen, Eizellen und Embryonen können durch Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff (-196 °C) dauerhaft konserviert werden und sind nach dem Wiederauftauen voll funktionsfähig!

Verflüssigung von Stickstoff: adiabatische Ausdehnung der Luft Adiabatischer Prozess —> keine Änderung der Wärmeenergie

Biotechnologie der IVF & Embryonentransfer

Hybride

Chimäre

Chimären sind Organismen, die aus Zellen unterschiedlicher genetischer Herkunft aus ursprünglich getrennten Embryonen oder embryonalem Material bestehen

Fusions-Chimären: Fusion zweier unterschiedlicher Embryonen im selben Entwicklungsstadium, nachdem ihre Zona pellucida entfernt wurde. Artenmischung möglich!

Injektions-Chimären: Entnahme von Stammzellen eines Embryos und Injektion in die Blastozyste eines anderen Embryos Chimären sind transgen! große Anzahl gemischter Gene!

Alle Transgene sind Chimären!!!

Chimären können bis zu sieben Eltern haben (2 genetische Elternpaare, 1 Leihmutter, 1 soziale Mutter)

Goals of creating human-animal chimeras

*Production of patient-specific, pluripotent stem cells for therapy purposes (e.g. Alzheimer’s Disease, Parkinson’s Disease)

*Using human-animal-chimeras as ‘organ spare-part resource’

*Transfer of human disease genes into animals to study mechanisms of disease pathology (knock-out, knock-in)

*Transfer of human genes in animals under tissue-specific promotors to produce human proteins of value (transgenic animals, e.g. production of clotting factors in goats)

Protokolle zur Herstellung von Mensch-Tier-Chimären

Gezielter Gentransfer (transgene Tiere)

Techniken:

- Gene Guns —> DNA-adsorbierende Projektilkugeln

- Retrovirus-vermittelte Transgenese (nur kleine DNA)

- Vorkern-Injektion

- DNA-modulierter Stammzelltransfer (Herstellung transgener Stammzellen)

Transgene Tiere und Gene-Pharming

(1) Ein menschliches Gen, das für die Produktion eines gewünschten Proteins verantwortlich ist, wird in einem Labor isoliert.

(2) Ein Tier erhält eine Hormonbehandlung, um eine große Anzahl von Embryonen zu produzieren, und die Embryonen werden aus dem Eileiter entnommen.

(3) Das menschliche Gen wird mittels Mikroinjektion in die befruchtete Eizelle eingebracht. DNA des Vorkerns wird in den befruchteten Embryo injiziert.

(4) Der transgene Embryo wird in einen Ersatzwirt eingebracht, der das transgene Tier zur Welt bringt.

(5) Der Nachwuchs wird auf das neue Gen getestet

Genschalter und Knock-out-Mäuse

Gen-Knockout:

*Erstellen Sie einen Vektor, der ein Antibiotikaresistenzgen im KO-Genbereich enthält

* Embryonale Stammzellen (ES) mit Vektor transfizieren

*In einigen ES tritt homologe Rekombination (HR) auf, in einigen Nicht-HR und in anderen überhaupt keine Rekombination

*Auswahl der Rekombination (HR und Nicht-HR) durch Testen der Antibiotikaresistenz (AR) --> Antibiotikabelastung

*Auswahl für homologe Rekombination: Nicht-HR-Zellen haben immer noch nicht mutiertes Gen X; zusätzlich den negativen Selektionsmarker eingefügt haben  sensitiv gegenüber Testsubstanz (z. B. Gangciclovir)  selektieren überlebende HR-Zellen

KO-Mausmodelle:

genetische Modelle zur Funktionsprüfung isolierter Gene. Nach dem Knockout wird der resultierende Phänotyp untersucht.

KO-Tiere dienen als Tiermodelle zum besseren Verständnis menschlicher Erbkrankheiten (z. B. Mukoviszidose, Duchenne-Muskeldystrophie, myotone Mäuse, Ziegen etc.)

Eine Knockout-Maus machen: Schritt für Schritt

Schritt 1: Generieren eines Targeting-Vektors

*Identifizieren Sie die zu löschende Genregion

*Identifizieren Sie die an die Zielgenregion angrenzende Region (d. h. vor und nach dem Gen)

*Erstellen Sie einen Targeting-Vektor, der homologe Nukleinsäuren enthält Säuresequenzen zu den homologen Regionen vor und nach dem Gen und das zu löschende Gen mit einem Markergen (z. B. Neomycin-Resistenz).

*Unmittelbar nach der homologen Region DNA2 ein negatives Selektionsmarkergen einschließen

• Das Thymidinkinase (TK)-Gen von Herpes simplex ist ein beliebter negativer Selektionsmarker.

• Normalerweise können Mauszellen in Gegenwart des antiviralen Medikaments Gangciclovir wachsen.

• Das TK-Gen wird als „Zellselbstmordgen“ betrachtet, da Zellen, die TK exprimieren, Gangciclovir in ein tödliches Zelltoxin umwandeln

• Kommt es zu einer zufälligen Insertion des Zielvektors in das Genom, werden sowohl das NeoR- als auch das TK-Gen in das Genom inseriert und die Zellen sterben in Gegenwart von Gangciclovir ab

• Wenn eine homologe Insertion des Zielvektors in das Genom auftritt, werden nur das NeoR-Gen und die das NeoR-Gen flankierenden homologen Gene insertiert und die Zellen überleben in Gegenwart von Gangciclovir

Schritt 2: Einfügen der Zielsequenz und Auswählen von Zellen mit der Einfügung

• Verwenden Sie embryonale Stammzellen, um den Zielvektor einzubauen, da nur diese in eine Blastozyste injiziert werden können, um einen sich entwickelnden Embryo mit dem Knockout zu erzeugen

Schritt 3: Identifizieren von ES-Zellen mit dem richtigen ausgeknockten Gen

• Zellen zuerst in Gegenwart von Neomycin wachsen lassen

• Zweitens, überlebende Zellen in Anwesenheit von Gangciclovir wachsen lassen

• Schließlich wählen Sie überlebende Zellen für den Blastozysteneinbau aus

Schritt 4: Injizieren von heterozygoten Knockout-ES-Zellen in einen sich entwickelnden Embryo und Übertragen des Embryos in eine Maus

• Nach der Injektion in die Blastozyste werden heterozygote ES-Zellen Teil des sich entwickelnden Embryos

• Aufgrund der Zellvermischung ist der Nachwuchs eine Chimäre

• Die Auswahl von ES-Zellen für die Gendeletion aus einem Spenderstamm mit schwarzem Fell und die Injektion in Blastozysten eines Mausstamms mit weißem Fell erzeugt ein geflecktes Fellmuster

Schritt 5: Paarung von chimären Mäusen, um homozygote Knockout-Mäuse zu erhalten

Schritt 5: Paarung von chimären Mäusen, um homozygote Knockout-Mäuse zu erhalten (alternatives Schema)

Schritt 6: Phänotypische Charakterisierung homozygoter Knockout-Mäuse

Der Klon – exakte Kopie = gleiches Individuum ?

Nur ein weiblicher Klon ist ein ECHTER (100%) Klon!

1 Elternmodell:

weiblicher Organismus ist somatische Zellspenderin, Eizellspenderin und Leihmutter zugleich —> Nachkomme ist zu 100% ein Elternteil

2 Eltern-Modell:

weiblicher/männlicher Organismus ist Spenderin somatischer Zellen, anderer weiblicher Organismus ist gespendete Eizelle und Leihmutter —> Nachkommen haben Kern-DNA der Spenderin somatischer Zellen, aber mitochondriale DNA der Eizellenspenderin

—> Dolly war kein echter Klon ( 2-Eltern)

„Wir fanden heraus, dass die Injektion von H3K9me3-Demethylase-Kdm4d-mRNA und die Behandlung mit Histon-Deacetylase, dem Inhibitor Trichostatin A, im Einzelzellstadium nach SCNT die Blastozystenentwicklung und die Trächtigkeitsrate von transplantierten SCNT-Embryonen bei Ersatzaffen stark verbesserte.“

Embryonale Stammzellen (ES) <—> Adulte Stammzellen (AS)

• ES kann sich nahezu unbegrenzt selbst replizieren und selbst klonen

• ES sind pluripotent

• ES altert nicht (hohe Telomerase-Aktivität)

• ES kann eingefroren und lange gelagert werden

• In Anwesenheit von Wachstumsfaktoren kann ES sich in alle Gewebe differenzieren (Haut, Nerven, Muskel, Leber…)

• Vordifferenzierte ES können in erkranktes Gewebe injiziert werden und das Gewebe regenerieren (z. B. Bauchspeicheldrüse bei Diabetes?)

• AS (Gewebestammzellen): geringere Entwicklungs- und Regenerationsfähigkeit als ES

• Replikationskapazität und Lebenserwartung begrenzt

• Ethisch unbedenklich, leicht zu entnehmen (Knochenmarkpunktion)

• AS kann nur ohne Abstoßungsrisiko zum Spender zurück transplantiert werden!

• AS enthalten noch potentielle genetische Defekte des Spenders

Stammzellressourcen und Stammzelltherapie

Embryonische Stammzellen:

• Überzählige Embryonen aus IVF

• Abgetriebene Föten (fetale SC)

• Therapeutisches Klonen (Zellkerntransfer in entkernte Eizelle)

Adulte Stammzellen:

• Knochenmarkpunktion, Haut, Nabelschnur, Menstruationsblut, Leber, Bauchspeicheldrüse

• Hippokampus (Gehirnareal, nur experimentell)

• Nabelschnurstammzellen sind KEINE embryonalen Stammzellen!

Rechtsfragen:

In Deutschland ist jegliches Klonen menschlicher Embryonen und die Herstellung (nicht die Verwendung von importierten!) ES verboten. In Großbritannien und Südkorea ist therapeutisches Klonen erlaubt. In den USA legalisiert, aber nicht staatlich gefördert!

Induzierte pluripotente Stammzellentechnologie (IPS)

Embryonale Stammzellen – die „pluripotent“ sind, weil sie sich zu jedem Zelltyp entwickeln können – sind vielversprechend für die regenerative Medizin, in der beschädigte Organe und Gewebe ersetzt oder repariert werden können. Viele in der Wissenschaftsgemeinschaft betrachten die Verwendung von Stammzellen als Schlüssel für die zukünftige Behandlung und Ausrottung einer Reihe von Krankheiten wie Diabetes, Erblindung und Parkinson-Krankheit.

Aber die Verwendung embryonaler Stammzellen ist seit langem umstritten – das ist einer der Gründe, warum Yamanakas Entdeckung eines alternativen Weges zur Gewinnung menschlicher Stammzellen ohne die Verwendung von Embryonen so wichtig ist …“

Herausforderungen bei der Umprogrammierung von Zellen auf Pluripotenz

1. Geringer Wirkungsgrad: Im Allgemeinen war die Umstellung auf iPS-Zellen unglaublich gering. Beispielsweise betrug die Rate, mit der somatische Zellen in Yamanakas ursprünglicher Mausstudie in iPS-Zellen umprogrammiert wurden, 0,01–0,1 %.

2. Genomische Insertion: Die genomische Integration des Transkriptionsfaktors schränkt den Nutzen des Transkriptionsfaktoransatzes ein, da das Risiko besteht, dass Mutationen in das Genom der Zielzelle eingefügt werden.

3. Tumorigenität: Abhängig von den verwendeten Methoden kann die Reprogrammierung adulter Zellen zur Gewinnung von iPSCs erhebliche Risiken bergen, die ihre Anwendung beim Menschen einschränken könnten. Die Inaktivierung oder Deletion des Tumorsuppressors p53, der ein Schlüsselregulator von Krebs ist, erhöht die Reprogrammierungseffizienz signifikant. Es scheint also einen Kompromiss zwischen Reprogrammierungseffizienz und Tumorbildung zu geben.

4. Unvollständige Neuprogrammierung: Auch die Neuprogrammierung steht vor der Herausforderung der Vollständigkeit. Dies ist besonders herausfordernd, da der genomweite epigenetisch Code auf den des Zielzelltyps umformatiert werden muss, um eine Zelle vollständig neu zu programmieren.

Human Genome Organization (HGP) wird gegründet, eine Weltorganisation mit Mitgliedern aus 30 Ländern.

Das Ziel: die Komplett-Entschlüsselung des Human-Genoms.

Der öffentliche HGP-Ansatz

Rezept:

Genomische DNA wird in Stücke von ~150 kb geschnitten und in BAC-Vektoren eingefügt, in E.coli transformiert, repliziert und gelagert. BAC-Inserts werden isoliert und jeder Klon kartiert. Jeder BAC wird zufällig in kleinere Stücke fragmentiert, in ein Plasmid kloniert und jedes Stück auf beiden Strängen sequenziert

Der hierarchische Over-Whole-Genome-Shotgun-Ansatz wurde aus folgenden Gründen gewählt:

• Sequenzinformationen sind lokal

--> Das Problem der Fehlmontage über große Entfernungen wird eliminiert und das Risiko einer Fehlmontage über kurze Distanzen reduziert

• Beim Ansatz des gesamten Genoms würde die Sequenz aus zwei verschiedenen Kopien des menschlichen Genoms stammen, und ein genauer Zusammenbau könnte durch Sequenzvariationen zwischen den Kopien aufgrund von SNPs (1 pro 1.300 bp) und struktureller Heterozygotie im großen Maßstab erschwert werden. Bei der hierarchischen Shotgun-Methode wird jeder Klon mit großem Insert von einem einzelnen Haplotyp abgeleitet

Störung bei Reinfektion :

• Die Transkription des gesamten Spacers innerhalb des Operons findet statt, und TracrRNA wird unabhängig transkribiert.

• TracrRNA bindet an prä-crRNA, und mit Hilfe von RNaseIII bildet die Spaltung individuelle und reife crRNA.

• Die Bildung von gRNA erfolgt, sobald tracrRNA an crRNA bindet.

• gRNA bindet Cas9 und leitet es zur nachfolgenden genetischen Insertion des Bakteriophagen um, was zur Zerstörung von Fremdmaterial führt.

tracrRNA: transaktivierende CRISPR-RNA fungiert als Homing-Gerät zur Steuerung der Cas9-Bindung

gRNA: guide RNA leitet und aktiviert die Insertion/Deletion von Cas9 und wird somit für die Aktivierung und Zielspezifität verwendet

CRIPSR/CAS9-Nukleasesystem

• Cas9 und sgRNA (single guide RNA) erkennen eine 20 nt lange Zielsequenz, die sich stromaufwärts des invarianten 3 bp großen NGG PAM befindet („Protospacer benachbartes Motiv“, rote Buchstaben).

• Der Doppelstrang liegt 3 bp stromaufwärts der NGG-PAM-Sequenz (rote Pfeile).

• An sgRNA gebundenes Cas9 durchsucht DNA nach Sequenzen, die zu den ersten 20 nt der sgRNA komplementär sind.

• Wenn sich eine Zielsequenz stromaufwärts der PAM-Stelle befindet, schneidet jede der RuvC- und HNH-Nukleasedomänen von Cas9 einen Strang der Ziel-DNA (rote Pfeile).