Buffl

4.Genetik

KS
by Kristina S.

6.Gehe auf Diabetes mellitus ein.

Diabetes Mellitus

Weltweit häufigste Stoffwechselerkrankung (~6% der Erdbevölkerung)

• Typ-II-Diabetes häufigste „Krankheit der Reichen“

• Gefördert durch Bewegungsmangel, Übergewicht, zuckerreiche Ernährung

• befürchtete Spätfolgen: Nierenversagen, Erblindung, Schlaganfall, Herzinfarkt, Neuropathien, Schmerzen…

• Neben Glucagon erhöhen Adrenalin, Cortisol und Somastatin den Blutzuckerspiegel

Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit) ist ein Überbegriff für verschiedene Erkrankungen des Stoffwechsels. Allen gemeinsam ist, dass sie zu erhöhten Blutzuckerwerten führen, weil die Patientinnen und Patienten einen Mangel am Hormon Insulin haben und/oder die Insulinwirkung vermindert ist. Medizinisch unterscheidet man verschiedene Diabetes-Formen. Die Hauptformen sind der Typ-1- und der Typ-2-Diabetes mellitus.

Typ-1-Diabetes

  • wird durch einen absoluten Mangel des Hormons Insulin verursacht, dieser Diabetestyp heißt deshalb auch insulinabhängiger Diabetes mellitus,

  • wird durch ein absolutes Versagen der Zellen in der Bauchspeicheldrüse, die das Hormon Insulin produzieren, verursacht,

  • beginnt meist im Kindes- und Jugendalter,

  • ist bisher nicht heilbar, so dass die Patientinnen und Patienten ihr ganzes Leben lang Insulin spritzen müssen.

Typ-2-Diabetes

  • entsteht zum einen durch eine verminderte Empfindlichkeit der Körperzellen für Insulin (Insulinresistenz), zum anderen führt eine jahrelange Überproduktion von Insulin zu einer "Erschöpfung" der insulinproduzierenden Zellen (die Bauchspeicheldrüse kann nicht genügend Insulin für den erhöhten Bedarf liefern),

  • beginnt meist schleichend,

  • wurde früher auch als "Altersdiabetes" bezeichnet, jedoch erkranken in den letzten Jahren auch zunehmend junge Erwachsene, sogar Jugendliche daran.

  • Neben einer erblichen Veranlagung gelten Übergewicht und Bewegungsmangel als die wichtigsten Verursacher eines Typ-2-Diabetes. Aber auch eine unausgewogene (ballaststoffarme, fett- und zuckerreiche) Ernährung und Rauchen begünstigen die Entstehung von Typ-2-Diabetes.

  • Es stehen verschiedene Therapiebausteine zur Verfügung. Am wichtigsten sind zunächst regelmäßige Bewegung, angepasste Ernährung und ein normales Körpergewicht. Dies verbessert die Empfindlichkeit der Körperzellen für Insulin und kann so den Insulinbedarf senken. Zu Beginn der Therapie wird deshalb immer versucht, mit Allgemeinmaßnahmen, wie konsequente Lebensstiländerungen, auszukommen.

  • Sind Allgemeinmaßnahmen nicht erfolgreich, stehen verschiedene Medikamente zur Verfügung, die zum Beispiel als Tabletten eingenommen werden können. Erst wenn es auch mit diesen Medikamenten nicht gelingt, die Erkrankung in den Griff zu bekommen, muss auch bei Typ-2-Diabetes Insulin gespritzt werden.

9.Was ist Insulin uns wie wird es produziert und reguliert?

Was ist Insulin?

Insulin ist ein körpereigenes Hormon. Es ist lebenswichtig und wirkt allgemein blutzuckersenkend und wachstumsfördernd für die Muskulatur. Am bekanntesten ist das Insulin als Stoff, der den Blutzuckerspiegel senkt und mit dem Diabetiker Probleme haben. Das Hormon stimuliert aber auch die Muskeln, damit sie neues Muskeleiweiß bilden – das ist die sogenannte Proteinsynthese. Insulin hemmt aber auch den Abbau von Fett, die Lipolyse, und fördert den Aufbau von Fett, die Lipogenese.

Produktion

Insulin entsteht in der Bauchspeicheldrüse (Pankreas), genauer gesagt in den Beta-Zellen, die sich in den Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse befinden. Die Betazellen produzieren zunächst eine Vorstufe, das Proinsulin. Es spaltet sich auf in ein Insulin-Molekül und ein sogenanntes C-Peptid. Beide werden im gleichen Verhältnis ausgeschüttet. Der Spiegel des C-Peptids im Blut lässt sich messen – und auf diese Weise feststellen, ob der Körper noch eigenes Insulin produziert.

In den Alpha-Zellen der Bauchspeicheldrüse bildet der Körper zudem das Hormon Glukagon. Es ist der Gegenspieler des Insulins: Während Insulin den Blutzucker senkt, fördert Glukagon die Bildung und Freisetzung der hauptsächlich in der Leber gespeicherten Zuckerreserven ins Blut und lässt den Blutzuckerspiegel ansteigen.

Genauer chem. Prozess:

1) das Präproinsulin-Molekül, bestehend aus:

  • einer Signalsequenz (leader peptide, im Bild L) mit 24 Aminosäuren,

  • an die sich die 30 Aminosäuren der B-Kette schließen,

  • danach kommt das C-Peptid (connecting peptide, im Bild C) mit 30 Aminosäuren,

  • gefolgt von der A-Kette mit 21 Aminosäuren.

2) Faltung

Durch Bildung von drei Disulfidbrücken (zwei zwischen dem A- und B-Peptid, eine innerhalb des A-Peptids) wird das bisher gestreckte Molekül gefaltet.

3) das gefaltete Präproinsulin-Molekül.

4) Abspaltung von Signalpeptid und C-Peptid:

  • Beim Durchtritt durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) entsteht durch Abspaltung der Signalsequenz das Proinsulin mit 84 Aminosäuren. Das Signalpeptid verbleibt in den Zisternen des ER.

  • Das Proinsulin verlässt das ER, wird in den Golgi-Apparat aufgenommen und gespeichert.

  • Bei Bedarf wird die C-Kette durch spezifische Peptidasen abgespalten. Damit hat das Insulin seine endgültige Struktur erreicht.

5) das Insulin-Molekül:

Es besteht nun aus zwei Peptidketten, der A-Kette mit 21 und der B-Kette mit 30 Aminosäuren, welche durch zwei Schwefelbrücken (Disulfidbrücken) zusammengehalten werden (A7-B7 und A20-B19). Eine dritte Disulfidbrücke verbindet die Cysteinreste der Positionen 6 und 11 der A-Kette.

Regulation

11.Welches Problem besteht bei der Produktion von tierischen Insulin? Wie kann unabhängig davon Insulin hergestellt werden? Wie läuft der Prozess ab?

Gentechnisch hergestelltes Insulin

Problem:

Der Jahresbedarf eines Diabetikers erfordert Bauchspeicheldrüsenextrakte von 50 Schweinen

—> bis zu 11 Tonnen (!) Bauchspeicheldrüsengewebe von Schlachtschweinen pro Tag

—> Seit 2005 kein Insulin tierischen Ursprungs mehr in Deutschland vertrieben!

Herstellung:

ß-Zellen aus Ratten-Pankreas-Tumor

--> Isolierung von Präpro-Insulin-mRNA

--> cDNA mit reverser Transkriptase

--> Schneiden mit Restriktionsendonuclease, Einfügen von Sticky Ends in bakterielles Plasmid mit Resistenzgen gegen Penicillin und Tetracyclin

Clever: Die Kopplung des Insulin-Gens an ein Antibiotika-Gen war notwendig, sonst wäre das Insulin in den Bakterien verblieben. Auf diese Weise wurde es mit Penicillinase in das äußere Medium sezerniert!

Die beiden Gene für die A- und die B- Kette des Insulins werden getrennt produziert.

Das jeweilige Gen (zusätzlich mit einem Startcodon für Methionin ausgestattet) wird hinter das lac Z-Gen der E. coli exprimiert.

Dieses lac Z-Gen ist das Gen für das Enzym Galactosidase.

Dieses Gen steht unter der Kontrolle eines durch Laktose zu aktivierenden Promotors.

Die Ligation [Verbindung durch Ligasen] von Vektor und Strukturgen [Insulingen] führt zu einem Fusionsprodukt mit einem durchgängigen Leseraster vom Startcodon des lac Z-Gens bis zum Stopcodon der Gene von A- bzw. B-Kette.

Durch zusätzlichen Einbau eines Resistenzgens gegen ein Antibiotikum kann später eine gezielte Selektion erfolgen.

Auf den Nährboden wird ein Antibiotika gegeben, so dass nur die Bakterien überleben, die das Resistenzgen (und somit auch das Insulingen) haben.

Dazu ist das Verfahren der sogenannten Replika-Plattierung nötig.

Durch Zugabe von CaCl2 wird die Membran des Bakteriums für das rekombinante Plasmid permeabel gemacht.

Nach dieser Transformation (Aufnahme der freien DNA) von E. coli können die beiden Ketten des Insulins synthetisiert werden, sobald auch Laktose zugegeben wird um den inaktiven Promotor zu aktivieren.

Wenn die Wirtsorganismen die Ketten in genügender Menge herstellen werden sie nach und nach in immer größeren Fermentern vermehrt, die teilweise bis über 2000 Kubikmeter groß sind. Dort gedeihen sie unter optimalen Bedingungen auf einem speziellen Nährboden.

Um das Insulin zu erhalten werden die Bakterien abgetötet und aufgebrochen. Die Peptidketten der Proteine hinter Methionin werden mit Hilfe von Bromzyan abgespalten und die Ketten werden isoliert.

Die Ausbildung der Disulfidbrücken zwischen den beiden Ketten wird durch Oxidation in einer Lösung erreicht.

24.Wie erstellt man eine Knock-out Maus?

Eine Knockout-Maus machen: Schritt für Schritt

Schritt 1: Generieren eines Targeting-Vektors

*Identifizieren Sie die zu löschende Genregion

*Identifizieren Sie die an die Zielgenregion angrenzende Region (d. h. vor und nach dem Gen)

*Erstellen Sie einen Targeting-Vektor, der homologe Nukleinsäuren enthält Säuresequenzen zu den homologen Regionen vor und nach dem Gen und das zu löschende Gen mit einem Markergen (z. B. Neomycin-Resistenz).

*Unmittelbar nach der homologen Region DNA2 ein negatives Selektionsmarkergen einschließen

• Das Thymidinkinase (TK)-Gen von Herpes simplex ist ein beliebter negativer Selektionsmarker.

• Normalerweise können Mauszellen in Gegenwart des antiviralen Medikaments Gangciclovir wachsen.

• Das TK-Gen wird als „Zellselbstmordgen“ betrachtet, da Zellen, die TK exprimieren, Gangciclovir in ein tödliches Zelltoxin umwandeln

• Kommt es zu einer zufälligen Insertion des Zielvektors in das Genom, werden sowohl das NeoR- als auch das TK-Gen in das Genom inseriert und die Zellen sterben in Gegenwart von Gangciclovir ab

• Wenn eine homologe Insertion des Zielvektors in das Genom auftritt, werden nur das NeoR-Gen und die das NeoR-Gen flankierenden homologen Gene insertiert und die Zellen überleben in Gegenwart von Gangciclovir

Schritt 2: Einfügen der Zielsequenz und Auswählen von Zellen mit der Einfügung

• Verwenden Sie embryonale Stammzellen, um den Zielvektor einzubauen, da nur diese in eine Blastozyste injiziert werden können, um einen sich entwickelnden Embryo mit dem Knockout zu erzeugen

Schritt 3: Identifizieren von ES-Zellen mit dem richtigen ausgeknockten Gen

• Zellen zuerst in Gegenwart von Neomycin wachsen lassen

• Zweitens, überlebende Zellen in Anwesenheit von Gangciclovir wachsen lassen

• Schließlich wählen Sie überlebende Zellen für den Blastozysteneinbau aus

Schritt 4: Injizieren von heterozygoten Knockout-ES-Zellen in einen sich entwickelnden Embryo und Übertragen des Embryos in eine Maus

• Nach der Injektion in die Blastozyste werden heterozygote ES-Zellen Teil des sich entwickelnden Embryos

• Aufgrund der Zellvermischung ist der Nachwuchs eine Chimäre

• Die Auswahl von ES-Zellen für die Gendeletion aus einem Spenderstamm mit schwarzem Fell und die Injektion in Blastozysten eines Mausstamms mit weißem Fell erzeugt ein geflecktes Fellmuster

Schritt 5: Paarung von chimären Mäusen, um homozygote Knockout-Mäuse zu erhalten

Schritt 5: Paarung von chimären Mäusen, um homozygote Knockout-Mäuse zu erhalten (alternatives Schema)

Schritt 6: Phänotypische Charakterisierung homozygoter Knockout-Mäuse

33.Wie funktioniert die Induzierte pluripotente Stammzellentechnologie (IPS) und was sind iPS-Zellen genau? Welche Nachteile und Vorteile ergeben sich hiermit.

Induzierte pluripotente Stammzellentechnologie (IPS)

Embryonale Stammzellen – die „pluripotent“ sind, weil sie sich zu jedem Zelltyp entwickeln können – sind vielversprechend für die regenerative Medizin, in der beschädigte Organe und Gewebe ersetzt oder repariert werden können. Viele in der Wissenschaftsgemeinschaft betrachten die Verwendung von Stammzellen als Schlüssel für die zukünftige Behandlung und Ausrottung einer Reihe von Krankheiten wie Diabetes, Erblindung und Parkinson-Krankheit.

Aber die Verwendung embryonaler Stammzellen ist seit langem umstritten – das ist einer der Gründe, warum Yamanakas Entdeckung eines alternativen Weges zur Gewinnung menschlicher Stammzellen ohne die Verwendung von Embryonen so wichtig ist …“

Herausforderungen bei der Umprogrammierung von Zellen auf Pluripotenz

1. Geringer Wirkungsgrad: Im Allgemeinen war die Umstellung auf iPS-Zellen unglaublich gering. Beispielsweise betrug die Rate, mit der somatische Zellen in Yamanakas ursprünglicher Mausstudie in iPS-Zellen umprogrammiert wurden, 0,01–0,1 %.

2. Genomische Insertion: Die genomische Integration des Transkriptionsfaktors schränkt den Nutzen des Transkriptionsfaktoransatzes ein, da das Risiko besteht, dass Mutationen in das Genom der Zielzelle eingefügt werden.

3. Tumorigenität: Abhängig von den verwendeten Methoden kann die Reprogrammierung adulter Zellen zur Gewinnung von iPSCs erhebliche Risiken bergen, die ihre Anwendung beim Menschen einschränken könnten. Die Inaktivierung oder Deletion des Tumorsuppressors p53, der ein Schlüsselregulator von Krebs ist, erhöht die Reprogrammierungseffizienz signifikant. Es scheint also einen Kompromiss zwischen Reprogrammierungseffizienz und Tumorbildung zu geben.

4. Unvollständige Neuprogrammierung: Auch die Neuprogrammierung steht vor der Herausforderung der Vollständigkeit. Dies ist besonders herausfordernd, da der genomweite epigenetisch Code auf den des Zielzelltyps umformatiert werden muss, um eine Zelle vollständig neu zu programmieren.

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Kristina S.

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