4. Methoden der Proteinreinigung und –charakterisierung

• nach Löslichkeit

• nach Zellkompartiment

• nach Größe

• nach Ladung

• nach Affinität

• nach Hydrophobizität

• Trennung nach Zellkompartiment

• Differenzielle Zentrifugation:

Es wird Schritt für Schritt bei zunehmender Geschwindigkeit zentrifugiert. Das dichteste Material bildet bereits bei geringen Geschwindigkeiten ein Pellet. Das weniger dichte Material bleibt im Überstand.

• Trennung nach Größe

Poröse Gelkügelchen (gelb) erlauben kleinen Proteinen (rot) Zutritt, sperren große Proteine dagegen aus. Daher wandern große Proteine schneller durch die Säule als kleine Proteine

Große Proteine eluieren früher als kleinere. Die Zonen, in denen sich Protein bewegen, verbreitern sich durch Diffusion.

• Trennung nach Ladung

Trennung durch Bindung an geladene Gruppen an den Oberflächen der Chromatographiesäule

• Anionenaustausch-chromatographie:

  Negativ geladene Proteine (Anionen) binden an positiv geladene Gruppen an der Oberfläche

• Kationenaustausch-chromatographie:

  Positiv geladene Proteine (Kationen) binden an negativ geladene Gruppen an der Oberfläche

• Trennung nach Bindungseigenschaften

Concavalin A, ein Lectin, besitzt eine Affinität zu Glucose. Es kann an kovalent auf einer Säule gebundene Glucosemoleküle binden. Andere, nichtbindende Proteine können durch Waschen entfernt werden. Concavalin A kann mit einer konzentrierten Glucoselösung von der Säule eluiert werden

• Trennung nach Größe durch Gelelektrophorese SDS-Page

• Trennung nach Größe erfordert eine Denaturierung der Proteine.

• Denaturierung erfolgt durch Aufheizen in Natrium – Dodecyl-sulfat.

• Inter- und intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen werden durch Bindung an Dodecylgruppe ersetzt.

• Trennung nach Ladung

• Herstellung eines Gels mit pH Gradienten

• Auftragung der Proteinmischung auf das Gel

• Anlegen einer Spannung

• Wanderung geladener Proteine innerhalb des pH Gradienten

• Proteine fokussieren an dem pH Wert an dem ihre Ladung insgesamt 0 (neutral) ist = isoelektrischer Punkt pI