Fragenkatalog: Sequenzierung von Nukleinsäuren, Sequenzvergleich und Sequenzsuche

• = Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül

• 1.) Vervielfältigung eines spezifischen DNA-Abschnitts durch Klonierung

  • Einbringen des DNA-Abschnitts in z.B. Bakterien

  • Vermehrung

  • Isolierung der Plasmide/DNA

  • Reinigung

  • Sequenzierung

• 2) Vervielfältigung einess pezifischen DNA-Abschnitts durch PCR

  • Vermehrung durch PCR

  • Auftrennung im Gel

  • Isolierung und Reinigung

  • Sequenzierung

• ddNTP´s (=didesoxyribonucleoside tripphosphat) haben keine OH-Gruppe an Position 2 und 3 der —> daher kann daran auch kein weiteres Nukleotid anbauen —>Abbruch der Strangsysnthese

  
  

  

• Denaturierung von DNA-Doppelsträngen

• DNA-Einzelstrang: Polymerase synthetisiert Komplementärstrang:

  Primer + Polymerase + dNTPs + ddNTPs

• Einbau von ddNTPs:

  • - führt zum Abbruch der Synthese

  • - erfolgt zufällig —> mal werden dNTPs und manchmal eben ddNTPs eingesetzt

• Es entsteht je Reaktionsansatz ein Gemisch verschieden langer Ketten

• Auftrennung durch Elektrophorese

• zunöchst werden ganhz normal dNTPs durch die DNA-Polymerase eingesetzt —> Strang wird fortgesetzt

• irgendwann (zufälliger Zeitpunkt) wird anstelle von dNTPs ein ddNTP eingesetzt —> Stopp der Strangsynthese da ddNTPs keine OH-Gruppe an 2. und 3. Stelle der Ribose besitzen, wo normalerweise das nöchste Nukleotid ansetzt

• Auftrennung der unterschiedlichen langen Nukleotidketten durch Kapillarelektrophorese

• ddNTP ist mit Fluoreszensfarbstoff versehen —> jede Base unterschiedlicher Farbstoff —> Je nach Farbstoff weiß man welche Base in der DNA vorkommt —> so erfolgt also die Sequenzierung

• DNA-Polymerase

• ATP-Sulfurylase

• ATP-Luciferase

• Apyrase

• Prinzip der Pyrosequenzierung:

• Das zur Verlängerung des Stranges einzubauende Nukleotid (hier z.B. T) liegt nicht im Reaktionsansatz vor, sondern wird separat hinzu pipettiert.

• Das anschließend beim Nukleotid- einbau freigesetzte Pyrophosphat (PPi) aktiviert eine enzymatische Kaskade, die zur Generierung eines Lichtblitzes führt, dessen Stärke direkt proportional der Menge an eingebautem Nukleotid ist.

• Bevor das nächste Nukleotid hinzu pipettiert wird, baut die Apyrase überschüssiges Nukleotid ab.

1. Hybridisierung von einzelsträngiger Template-DNA + Primer

2. DNA-Synthese:

   DNA-Polymerase: DNA + ein dNTP ➞ verlängerte DNA + PPi (=Pyrophosphat) falls es das richtige Nukleotid ist

3. Detektion(bei passendem Nukleotid):

   • ATP-Sulfurylase Reaktion: PPi + Adenosin-5’-phosphosulfat ➞ ATP

   • Luciferase Reaktion: ATP + Luciferin ➞ Oxyluciferin + Licht

4. Abbau von nicht eingebauten Nucleotiden und ATP durch Apyrase, so dass die Reaktion mit einem anderen dNTP erneut durchgeführt werden kann (4 Zyklen pro gelesene Base! )

Die Pyrosequenzierung ist gut automatisierbar und eignet sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben

• NCBI

  Pubmed, Protein- und DNA Sequenz-Suche, Taxonomy und Bücher

• NCBI-BLAST

  Zur Identifizierung von Sequenzen mit dem BLAST Algorithmus

• Basic local alignment search tool