a) Zeichnen Sie die Grundstruktur einer Aminosäure auf. b) Zeichnen Sie eine Peptidbindung auf. c) Welche verschiedenen Gruppen von Aminosäuren können unterschieden werden?
Nennen Sie jeweils ein Beispiel.
Beschreiben Sie kurz den Prozess der Translation bei Eukaryonten.
Welche weiteren Modifikationen erfolgen bei eukaryontischen bzw. prokaryontischen Proteinen nach der
Translation?
Nennen sie je zwei synthetische Reduktionsmittel, die bei biochemischen Arbeiten eingesetzt werden und zwei, die in zellulären Prozessen eine Rolle spielen.
Nennen Sie verschiedene Methoden der Zentrifugation zur Isolierung von Zellorganellen, z.B. Chloroplasten.
a) differentielle Zentrifugation
b) Dichtegradienten Zentrifugation
Was bedeutet die „spezifische Aktivität“ eines Proteins und in welcher Einheit wird sie angegeben?
Aufreinigung bzw. Anreicherung eines Enzyms (Proteins): z.B. Malat-Dehydrogenase
d.h. spezifische Aktivität dieses Enzyms in der Lösung soll erhöht werden (Substratumsatz/ mg Protein = μmol /min mg Protein = U/mg Protein)
Berechnung:
1. die Aktivität der MDH in μmol/min ml (= Maß für das gesuchte Protein)
2. die Konzentration aller Proteine in mg Protein/ml gemessen
Aus den Werten wurde die Spez. Aktivität errechnet
Es gibt verschiedene Methoden zum Nachweis der Proteinmenge in einer Lösung. Nennen Sie zwei Methoden.
Lowry-Methode
Bradford-Methode
Auf welchen chemischen Reaktionen beruhen die Proteinbestimmungs-Methoden?
Farbstoffreaktion
In welchem Bereich (Bereich der Proteinkonzentration) ist ein Bradford-Test bzw. Lowry-Test sinnvoll?
Lowry-Test = Nachweisgrenze etwa 1μg Protein/ml
Bradford-Test = Nachweisgrenze etwa 10 μg Protein/ml
benötigtes Proteinvolumen:
Lowry-Test = 1ml
Bradfort-Test = 0,1ml
Proteinaufreinigung/Proteinanreicherung: Aussalzen
Beschreiben Sie den Effekt, den unterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfationen auf Proteinlösungen haben.
Hohe Salzgehalte in einer Lösung bewirken eine Erhöhung der Oberflächenspannung. Die Wasserhülle des Proteins wird dadurch abgetragen und hydrophobe Bereiche werden dadurch präsent. Die hydrophoben Bereiche der Proteine „kleben“ aneinander und werden schließlich ausgefällt.
Manche Ionen initiieren hydrophobe Interaktionen und wirken präzipitierend, „antichaotrope Salze“ z.B. Ammonium-Kationen.
Andere können Wechselwirkungen unterbinden (chaotrope Salze)
Wie läuft das Aussalzen ab?
wie errechnet man die spezifische Aktivität anhand dieser werte, die man durchs Aussalzen erhält?
wie hoch ist die Ausbeute?
was muss man für die Anreicherung angeben?
man teilt die Gesamtaktivität des hypothetischen ENzyms durch die Anzahl der Proteine/Enzyme in mg
—> 96000/3000 = 32
Ausbeute: 96000/100000 x 100 = 96
Anreicherung: 32/10 = 3,2
Nach welchen Eigenschaften erfolgt die Auftrennung von Proteinen während der Elektrophorese bzw. der Chromatographie?
was ist die Elution und wie ist sie bei der Chromatographie möglich?
Nach der Ladung der Proteine
—> Elution (Herausspülen von Proteinen aus der stationören Phase) sowohl möglich mit steigender Salzkonzentration, als auch mit unterschieldichen pH-Werten
Ionenaustausch-Chromatographie
Wie erfolgt die Elution mit steigender Salzkonzentration?
die Proteine binden unterschiedlich stark an die fixierten Ladungen der stationären Phase.
Veränderung und Elution der Proteine durch die steigende Salzkonzentration des Eluenten.
Beispiel: Eine Gelmatix trägt z.B. Carboxylat-Gruppen, an die bei pH 7,0 positiv geladene Proteine binden. Durch Zugabe von NaCl (oder anderes Salz) kann das Protein wieder von den Carboxylat-Gruppen abgelöst werden, da nun die Na+-Ionen mit den positiv geladenen Gruppen des Proteins um die Bindung am Ionenaustauscher konkurrieren.
Proteine mit geringer positiver Nettoladung werden eher verdrängt als Proteine mit hoher positiver Ladung.
gäbe es einen Kationaustauscher in der Sonde, dann würden da immer viele positiv geladene Proteine dranbinden —> währenddessen könnten die negativ geladenen Proteine eluiert werden.
durch Zugabe von NACL (Salz) —> konkurrenz für positiv geladene Proteine —> diese werden eher eluiert.
Wie erfolgt die Elution mit steigendem pH-Wert?
a) Im sauren pH-Bereich sind die Aminogruppen (hauptsächlich der basischen Aminosäuren) protoniert und das Protein tritt als Kation auf. —> Saurer pH = Protein ist Kation (positiv geladen)
b) Im basischen pH-Bereich überwiegen die negativen Ladungen an den Seitenketten von Asp und Glu und das Protein tritt als Anion auf. —> basischer pH = Protein ist Anion (negativ geladen) —>
ändert man den pH-Wert auf basisch, würden mehr Proteine negativ geladen werden und so könnten mehr Proteine eluiert werden!
Ausbeute: 80000/100000 x 100 = 80
Anreicherung: 200/10 = 20 —> das Protein wurde 20 mal angereichert
Welche Moleküleigenschaft ist für die Auftrennung von Proteinen bei der Gel-Ausschluss-, bzw. bei der Ionenaustauschchromatographie am wichtigsten?
Bei der Ionenaustauschchromatographie ist die Ladung am wichtigsten
bei der Gel-Ausschluss die Größe und Form
Beschreiben und skizzieren Sie das Prinzip einer Ionenchromatographie mit einem Anionenaustausch- Gelmaterial.
Das Gelmaterial enthält viel Anionenausstausch material
d.h. viele positiv geladene Teile —> daran binden sich dann viele negtiv geladene Proteine —> die positiv geladenen Proteine können so durch das Gelmaterial hindurchwandern und so von den negativen Proteinen (also nach ihrer Ladung) getrennt werden.
2. Gelfiltrations-Chromatographie
Welche Größe (große, mittlere, kleine) von Proteinen kommt in einer Gel-Ausschluss-Chromatographie in der Regel zuerst von der Säule?
Die Gel-Ausschluss-Chromatographie (GFC) basiert auf der Größenausschluss-Trennung von Molekülen durch ein poröses Gel. Größere Moleküle können die Poren des Gels nicht durchdringen und werden daher schneller ausgeschlossen und eluieren früher aus der Säule als kleinere Moleküle. —> Trennung der Moleküle basierend auf ihrer Größe.
welche Variablen gibt es?
pH-Wert
Puffer
Trenngel
Säulendimension
Wie wird die Anreicherung bei einer Proteinaufreinigung berechnet?
Bezieht sich auf die spezifische Aktivität (spez. Akt. nach dem Aufreinigungsschritt im Verhältnis zur spez. Aktivität im Rohextrakt)
Wie wird die Ausbeute bei einer Proteinaufreinigung berechnet?
Bezieht sich auf die Gesamtaktivität (Gesamtaktivität nach dem Aufreinigungsschritt im Verhältnis zur Gesamtaktivität im Rohextrakt * 100%)
Zeichnen Sie das Grundprinzip einer Gelelektrophorese mit negativ geladenen Proteinen auf. Ein Protein ist einfach, eins zweifach und eins fünffach negativ geladen.
Wie wird die Proteinaufreinigung überprüft?
Welches Gelmaterial wird in der Regel für eine Gelelektrophorese von Proteinen verwendet?
Polyacrylamidgel
Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
wovon ist die Laufrichtung der Proteine abhängig?
Größe
elektische Ladung
a) Beschreiben Sie ganz kurz die 2-D-Gelelektrophorese zur Auftrennung von Proteinen. b) Welchen Vorteil hat sie gegenüber der 1-D-Gelelektrophorese zur Auftrennung von Proteinen.
Sie besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Elektrophorese-Schritten:
Der erste Schritt ist eine isoelektrische Fokussierung (IEF), bei der die Proteine basierend auf ihrem isoelektrischen Punkt (pI) auf einem pH-Gradienten sortiert werden. Hierbei werden die Proteine in einem flachen Gel in einem elektrischen Feld entlang eines pH-Gradienten bewegt, bis sie an dem Punkt angekommen sind, an dem ihr pI der pH-Wert entspricht.
Im zweiten Schritt werden die Proteine aus dem IEF-Gel auf ein zweites Gel, einem SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE), überführt. Hier werden sie basierend auf ihrer Größe getrennt und sichtbar gemacht.
Vorteil: Durch die Kombination der Ladungstrennung durch IEF und der Größentrennung durch SDS-PAGE können sehr komplexe Proteinmischungen aufgetrennt und analysiert werden. Dadurch können auch Proteine mit sehr ähnlichen Größen und Ladungen voneinander getrennt werden, was in einer 1-D-Gelelektrophorese nicht möglich ist.
Erkläre die Isoelektrische Fokussierung: pH-Gradient im Gel
Wenn Sie SDS einsetzen, führen Sie dann eine denaturierende oder eine native Gelelektrophorese durch?
Welche Funktion übt SDS aus a) in Bezug auf den Zustand des Proteins und b) auf die Laufeigenschaft des Proteins?
denaturierende Gelelektroporese, da SDS denaturiert und entfaltet Proteine, indem es die Proteinstruktur aufbricht und eine negative Ladung auf alle Proteinmoleküle aufbringt, um sie gleichmäßiger im Gel zu trennen.
a) denaturiert Proteine —> Spaltet sie in Untereinheiten —> lineare Konformation wird gescaffen und ist erfordlerich für Wanderung druchs Gel
b) Aufladung von Proteinen —> Proteine werden negativ geladen —> Dadurch können sie im elektrischen Feld des Gels aufgrund ihrer Größe getrennt und nachgewiesen werden.
Wie erfolgt die Bestimmung des Molekulargewichts eines Proteins durch SDS-PAGE
Welche Färbemethoden gibt es zur Sichtbarmachung von Proteinen in Gelen nach einer Elektrophorese. Nennen Sie für jede Methode auch einen vergleichenden Vorteil bzw. Nachteil.
Was bedeutet „Blotten“ (fertigen Sie auch eine Skizze an)
Transfer von biologischen Molekülen wie DNA, RNA oder Proteinen von einem Gel auf eine Membran.
—> Dieser Prozess ermöglicht es, diese Moleküle zu immobilisieren und ihre spezifische Identifizierung und Analyse durch verschiedene Nachweismethoden wie Hybridisierung oder Immunmarkierung zu ermöglichen. Die gebräuchlichsten Blotting-Methoden sind der Southern Blot, der Northern Blot und der Western Blot, die je nach Art des Moleküls und der zu untersuchenden Fragestellung eingesetzt werden.
Beschreiben Sie ganz kurz „Western Blot“, „Southern Blot“ und „Northern Blot“ (Was wird aufgetrennt und was soll nachgewiesen werden, grob das jeweilige Verfahren, Sichtbarmachung)
Western Blot:
Proteine werden aufgetrennt
Diese werden auf Memrban transferiert
markierung mit spezifischen Antiköroern —> so werden sie sichtbar
—> Funktion: Menge und Präsenz bestimmter Proteine bestimmen
Southern Blot:
Funktion: Nachweis von spezifischen DNA-Sequenzen in einer Probe
Auftrennung der DNA-Fragmente durch Elektorphorese
Übertragung auf Membran
Membran wird mit Sonde hybridisiert, die spezifisch für gesuchte DNA-Sequenz ist
Sichtbarmachung durch Autoradiographie oder Fluoreszenz
Northern Blot:
FUnktion: Identifizierung von RNA-Molekplen in einer Probe
Auftrennung der RNA-Fragmente durch Elektorphorese
Membran wird mit Sonde hybridisiert, die spezifisch für gesuchte RNA-Sequenz ist
Erkläre die Funktionsweise von Western-Blot genauer
Primärer Antikörper bindet an ein Antigen, welches auf einer Membran fixiert ist.
An diesen wiederum bindet der sekundäre Antikörper, der z. B. mit dem Enzym HRP (horseradish peroxidase, Meerrettich-Oxidase) gekoppelt ist.
HRP katalysiert die Umsetzung von Luminol in seine oxidierte Form, dessen Chemilumineszenz detektiert werden kann.
Was sind polyklonale Antikörper?
-Wie werden sie hergestellt?
Polyklonale Antiseren sind eine Mischung aus verschiedenen gegen diverse Epitope (antigene Determinante, Antikörper- Bindungsstelle) gerichteten Antikörpern.
Antigen auswählen: Zunächst muss das Antigen, gegen das der Antikörper gerichtet sein soll, ausgewählt und produziert werden. Entweder wird das Protein isoliert oder ein Peptid aus einem Protein wird in vitro synthetisiert.
Immunisierung: Anschließend wird das Peptid einem Tier gespritzt, dessen Immunsystem dann Antikörper dagegen bildet. Als Antikörper-Produzenten werden besonders Kaninchen oder Mäuse verwendet, aber auch Ziegen oder Schafe verwendet.
Serumentnahme: Nach ein paar Wochen wird dem Tier Serum entnommen. Dies enthält gegen das Antigen gerichtete polyklonale Antikörper.
Was sind monoklonale Antikörper? Wie können sie hergestellt werden? Welcher Antikörpertyp ist spezifischer gegen ein Antigen, poly- oder monoklonale Antikörper?
Monoklonale Antikörper sind homogen und bestehen aus identischen Antikörpermolekülen, die alle die gleiche spezifische Bindungsstelle für das Zielantigen aufweisen.
Möglichkeit auf künstlichem Wege monoklonale Antikörper herzustellen
Fusionierung von B-Zellen aus einer immunisierten Maus (produzieren Antikörper, können sich aber nicht teilen) mit Maus-Tumorzellen (sind unsterblich).
Klon, der von einer einzelnen fusionierten Zelle abstammt, wird selektioniert und vermehrt
Diese Zellen produzieren einen identischen Antikörper
monoklonale Antikörper sind spezifischer gegen ein Antigen
Was bedeutet „Epitop“?
ist ein spezifischer Teil eines Antigens, auf den ein Antikörper oder ein T-Zell-Rezeptor binden kann.
Beschreiben Sie kurz drei Bespiele, wo Antikörper für analytische Nachweise in der Biologie oder Medizin genutzt werden.
WesternBlot: Nachweis eines Proteins auf einem Filter nach Auftrennung durch ein Elektrophorese-Gel
ELISA:Enzyme-linkedImmunosorbentAssay Quantifizierung von Antigenen oder Antikörpern im Serum, Zellsuspensionen etc. mittels enzymgekoppelter Antikörper z.B. Schwangerschaftstest
Immunohistochemie: Nachweis eines Antigens auf einer Zelloberfläche, in Zellen oder Organellen mittels Antikörpern auf Gewebsdünnschnitten (Cryo- oder Paraffinschnitte) und damit indirekter Nachweis von Zelltypen, Differenzierungsstadien etc.
Erkläre ELISA: Enzymgekoppelter Immunnachweis
Funktion?
FUnktionsweise (3 Schritte)?
Funktion:
Mit Hilfe des ELISA können Proteine (z.B. Hormone) in einer Probe (Blutserum, Urin, etc.) nachgewiesen werden.
Funkitonsweise:
a) Beschreiben Sie ganz kurz das allgemeine Verfahren der Massenspektrometrie. (Funktion?) b) Welche Einheit haben die durch Massenspektrometrie erzeugten Daten/Werte?
Funktion: Identifizierung unbekannter Proteine —> Exakte Bestimmung der Proteinmasse
Verfahren:
Welche Form der Massenspektrometrie wird bei der Analyse von Proteinen häufig eingesetzt? Beschreiben Sie auch ganz kurz, was mit den Proteinen gemacht wird, bevor sie in der Massenspektrometrie analysiert werden können.
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