AK
Zellkultur: Warum kann man Mycoplasma nicht durch Sterilisationsfilter eliminieren?
Weil sie kleiner als die Poren sind → kleine sich verbreitende Prokaryoten mit dem
kleinsten selbst-replizierenden Genomdurchmesser von 0,1-2 microns
Wie kann man eine Kontamination mit Mycoplasma nachweisen?
DAPI staining – “Milky Way-Like fog”
Ready-to-use Set basierend auf PCR-Amplifikation einer Gensektion die für 16S-rRNA codiert
Warum fixiert man die Zellen bei der ICC?
Um die Zellen und Gewebekomponenten in einem „life-like state“ zu erhalten
o → Verhindern der Autolyse und Fäulnis oder zellulärem Verfall
o → Verhindern von Verlust und Diffusion von löslichen Substanzen
o → Verbesserung der Starrheit (rigidity) und mechanischer Stärke der Zellen
o Um die Reaktivität zum Färben und anderen Reagenzien (AKs und Nukleinsäure-
sonden) beizubehalten
Nenne verschiedene Fixationsmethoden und beschreibe grob, wie sie funktionieren
Cross-linking
→ create intermolecular bridges and a network of linked antigenic proteins
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▪ + preservation of cell morphology suited for immunostaining of membrane
proteins
▪ - reduced target antigenicity → aldehydes (formalin or formaldehyde,
glutaraldehyde)
▪ Paraformaldehyde (PFA)
—> Powder form of polymerized formaldehyde
—> Decomposes in formaldehyde when heated (in aqueous solution) • Needs to be dissolved in PBS before use
—> Methanol is added to formalin prevent precipitation (effect on
permeabilization)
—> 4% PFA solution is optimal or fixing tissue and cells
Precipitating (denaturing)
→ strong dehydrants and cause the precipitation of cellular proteins
+ good choice for aldehyde-sensitive epitopes, permeabilization step might
be avoided
– can remove small soluble molecules and lipids, not recommended for use
with overexpressed fluorescent proteins highly volatile and flammable →
organic solvents (methanol, acetone, picric acid)
Was ist Trypsin? Wofür wurde es im Praktikum verwendet? Worauf muss man achten,
wenn Trypsin benutzt wird bei der Transfektion und später Membranproteine gefärbt
werden sollen. Welche Alternative zu Trypsin gibt es?
o Serinprotease (23,3 kDa), aus der Bauchspeicheldrüse eines Schweins
o wird verwendet, um Zellen voneinander und von der Zellkulturflasche zu trennen →
splittet Proteine und Peptide der ECM und adhäsiver Zellen
o Man muss auf die Aktivierungszeit und Temperatur achten, diese variiert je nach
Zelltyp und ist normal bei 37°C für 5 min. Zu langes Trypsinieren kann lösliche
Moleküle schädigen
o Alternativen, z.B. für andere Zelltypen sind andere Proteasen wie Kollagenase,
Elastase, etc.
Welches Medium wurde im Praktikum benutzt? Was sind die Hauptbestandteile, nennen
Sie drei Bestandteile.
DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle‘s Medium
o Hat eine erhöhte Konzentration an Vitaminen und Aminosäuren und ist mit höheren
oder niedrigeren Glucoselevels erhältlich
o Weitere Bestandteile sind: anorganische Salze (NaCl, KCl, MgSO4…)L-Aminosäuren
(Arg, His,…), Vitamine (Folic acid, Riboflavin…) und weitere(D-Glucose, Phenolrot,
Natrium-pyruvat)
Nennen Sie vier Gemeinsamkeiten biochemischer Transfektionsmethoden
Aktive Aufnahme durch Endozytose!
o Endosomaler Untergang → Toxizität!
o Erhöhte Zellteilungsrate erhöhte Wahrscheinlichkeit des Einbringens von DNA in den
Zellkern → Konfluenz maximal 60-80 %!
o Verwendung serumfreier Medien nötig!
o Dafür günstig und einfache Prozedur
o Toxizität stark zelltypabhängig
o Toxizität: Ca2+-Phosphat Präzipitation > Lipofektion > Kationische Polymere
Zellzählung: geg. War Bild eines Gruppenquadrats (Neubaure-Zählkammer) mit hellen und
dunklen Zellen, Angabe: Zellsuspension wurde mit 1:1 Trypanblau vermischt. Geben Sie die
Zellzahl der lebendigen Zellen pro mL an.
o Anzahl ausgezählter Zellen im Gruppenquadrat
o Formel zur Berechnung der Zellzahl in der Suspension
o Zellzahl lebendiger Zellen pro mL
Du hast in 4 Gruppenquadraten insgesamt 40 Zellen gezählt. Berechne die
Konzentration der Zellen pro mL. Verdünnung? (angenommen 1:1)
40 Zellen / (4 mm² * 0,1 mm * 0,5) = 200 Zellen/mm³ = 200 Zellen/µL = 2 * 10^5
Zellen/mL
Zellzählung: Du willst die Zellen nun ausplattieren, so dass du 0,5*10^5 Zellen in einem 500
µl well hast. Berechne, wie viel Zellsuspension und Pufferlösung du in ein Well pipettieren
musst
Muss um den Faktor 4 verdünnt werden, d.h. 125 µL Zellsuspension und 375 µL
Pufferlösung
Zellkultur, Transfektion: Nennen Sie 4 Anzeichen für bakterielle Kontamination in einer
eukaryotischen Zellkultur.
o Poor growth of the cells
o Turbidity of the medium (unclear medium)
o Colour change of the medium into yellow – acidification
o Detachment of the cells o Microscopic recognizable “storm” of the cell lawn
o Sterility control: small volumes of the solutions used on LB-Agar and overnight
incubated at 37°C
Transfektion: Nennen Sie Unterschiede zwischen stabiler und transienter Transfektion
Transiente Transfektion:
▪ Schneller Abbau fremder DNA
▪ „Verdünnung“ bei der Zellteilung
o Stabile Transfektion: Integration der eingebrachten DNA im Wirtsgenom (Einbringen
in Zelle → Zellkern → chromosomale DNA → Selektion z.B. über Antibiotika-
Resistenz
Transfektion: Welche Methode eignet sich zur Transfektion von
o Organen, Organellen, akuten Hirnschnitten
Physikalisches Verfahren: Gene Gun
• DNA an Wolfram- oder Goldpartikel absorbiert
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• „Beschuss“ des Gewebes
• Ursprünglich für Pflanzenzellen entwickelt
• Auch geeignet zur Transfektion von Primärzellen, Organen und
Organellen (Mitochondrien und Chloroplasten)!
• Fehlende Zellspezifität!
Primären Neuronen
Physikalisch: Transfektion seneszenter Zellen, Nukleofektion (spezialform der
Elektroporation, für sich nicht teilende Zellen (primäre Neuronen) - DNA
gelangt direkt in den Zellkern
HEK-293t
biochemisch: ca2+phosphat-präzipitation, Lipofektion, kationische Polymere
(PEI-Dendrimere) für HEK (da gut für stark proliferierende Zellen)
weitere Transfektionsmethoden
▪ Mikroinjektion zur Generierung transgener Mäuse
▪ Elektroporation für Suspensionszellen
▪ Außer biochemischen und physikalischen Verfahren auch virale Vektoren
möglich
ICC: Sie wollen eine ICC von primären Neuronen durchführen. Welche Kombination von
Seren, primären AKs und sekundären AK eignet sich dazu? (nur eine Möglichkeit)
NeuN färbt Neuronen (durch Cy3), DAPI färbt Nuclei und Cy5 (Y188) war gegen APP o NGS, Rabbit-anti-APP und Goat-anti-rabbit-Cy5 ???
What are HEK 293 t cells)
human embryonic kidney cells
immortalized
high transfectability
express the SV40 antigen
derived from a foetus, were immortalized via transfection with adenovirus 5 DNA
can maintain a high copy number of transfected plasmid and express recombinant proteins at a high level
How is a cell line established?
Taking tissue from a primary tissue and immortilazing it
How does DNA get into the cell?
Biochem Verfahren:
Ca-Phosphat-Präzipitation
Lipofektion
Kationische Polymere —> PEI
Physikalische Verfahren:
Mikroinjektion
Elektroporation
Gene gun
Magnetofektion
Virale Verfahren:
Adenoassozierter Virus
Adenovirus
Lentivirus
What are the potential problems with transfection?
Ca-P-Präzipitation : Zellstress, Nur bei adhärenten Zellen, Stark vom pH Wert abhängig
Biochem. : Endosomaler Untergang —> Toxizität (DNA wird im Endosomen abgebaut), Verwendung serumfreier Medien nötig
Mikroinjektion: Anspruchsvoll, zeitaufwändig und zeitraubend
Gene gun: Fehlende Zellspezifität
Physikalische Verfahren: Zellstress
Immunogenität, technisch aufwändige Herstellung, hohe Kosten wegen Sicherheitsvorschriften, geringe Kapazität, hohe Variabilität
How can the transfection efficiency be infleunced?
Zelldichte, DNA Menge, Menge des transfizierten Materials, Konzentration des Transfektionsreagenz
Differene between transiently and stably transfected cells
transient:
DNA wird nicht ins Wirtsgenom eingebaut
Stabil:
DNA wird ins Wirtsgenom eingebaut
What are the essential steps for antibody staining?
Fixation, chemical crosslinking, permeabilization, blocking
Immunostaining: Ab incubation, direct/indiret IF detection (primary, second), counterstaining
What are possible error sources during staining and how could appropriate control experiments look like?
unspecific binding of Abs
Autofluorescence
Media is not optimal match for Ab
Washing steps and incubation time
Kann ich Ab mit bloßem Auge sehen?
Absorptionsmaxima lernen, DAPI, Alexa488, Fmcherry
DAPI: 358nm und 461nm
Alexa488: 488nm und 525nm
fm Cherry: 587nm und 610nm
Calcium-Phosphat Präzipitation
• Lösen der DNA in Calciumchlorid
• Tropfenweise Zugabe von Natriumphosphat
• DNA und Calciumphosphat bilden unlöslichen
Komplex
• Aufnahme in die Zelle durch Endozytose
• Transfektionseffizienz: ca. 60 – 80 %
Transfektion durch Liposomen, Vesikel oder Micellen
o Komplexierung anionischer
Nukleinsäuren an kationischen Lipiden
o Einschluss der DNA
o Fusion mit der Zellmembran
o Endozytose
Kationische Polymere
Polyethylenimin (PEI)
Dendrimere: Kern aus tertiären Aminen
und netzartigen Verzweigungen aus
primären Aminverbindungen
-> sphärische Kugel, an deren Hülle positive Aminogruppen sitzen
In wässriger Lösung positiv geladen
-> Interaktion mit negativ geladener DNA
Aufnahme des DNA-Dendrimer-
Komplex über Endozytose
Anschwellen und Platzen der
endosomalen Vesikel -> DNA wird ins Cytosol entlassen
Weniger toxisch und billiger als Lipofektion
Effizienz: ca. 50 % bei HEK Zellen
Biochemischen Verfahren: Gemeinsamkeiten
• Aktive Aufnahme durch Endozytose !
• Endosomaler Untergang à Toxizität !
• Erhöhte Zellteilungsrate erhöht Wahrscheinlichkeit des Einbringens von
DNA in den Zellkern —> Konfluenz maximal 60 – 80% !
• Verwendung serumfreier Medien nötig !
• Toxizität stark zelltypabhängig:
Ca > Lipofektion > Kationische Polymere
Direkte Injektion der Fremd-DNA in Cytoplasma oder Zellkern
Transfektion seneszenter (vermehren sich nicht, aber sterben auch nicht) Zellen möglich !
Elektrischer Puls zerstört kurzfristig Membranpotential der Zelle • Membranporen —> Eindringen der Fremd-DNA ins Zytoplasma
Nucleofection
Spezielle Form der Elektroporation
• Nukleofection-Reagenz: DNA gelangt direkt in den Zellkern
• Transfektion sich nicht teilender Zellen, z.B. primäre Neurone, mit hoher Effizienz möglich
Gene Gun
DNA an Wolfram- oder Goldpartikel adsorbiert
Physikalische Verfahren: Gemeinsamkeiten
„Durchlöchern“ der Zellmembran ermöglicht Eindringen der DNA in die Zelle
Hohe Transfektionseffizienz —> auch für Zellen mit geringer Teilungsrate geeignet
Prinzipiell großer Zellstress!
Virale Transfektio
Virus-vermittelte Transfektion = Transduktion —> für schwer zu transfizierende Zellen (in vivo und in vitro, 95 -100%)
Ausnutzen der Fähigkeit von Viren, Zellen zu infizieren und DNA in den Zellkern einzuschleusen
Je nach Virus transiente oder stabile Transfektion
BME - what does it stand for?
Basal Medium Eagle
MEM, DMEM - what does it stand for? What is it composed of?
Dulbecco´s modified Eagle´s medium
o Increased concentration of vitamins and amino acids
o Available with higher or low glucose levels o Composition:
▪ Anorganic salts (NaCl, KCl, MgSO4…)
▪ L-Amino acids (Arg, His,…)
▪ Vitamine (Folic acid, Riboflavin…)
▪ Other components (D-Glucose, Phenolrot, sodium pyruvate)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute (medium)
Complete media
supplemented with antibiotics and sera
Sera
o Serum (latin for Molke/Whey)
o Liquid portion of the blood obtained as a supernatant by centrifuging a blood sample
o Corresponds to blood plasma but without coagulation factors
Serum heat-inactivation
Heat-inactivation (heating to 56°C for 30 minutes) is done to inactivate complement,
a group of proteins present in sera that are part of the immune response. This is
sometimes important for cells that will be used to prepare or assay viruses, or cells
that are sued in cytotoxicity assays or other systems where complement may have
an unwanted influence.
Aminoacid – L-Glutamin
o Glutamine is an important nitrogen source
Cells with a high energy turnover additionally need glutamine → Why the L-amino acid?
Because that is the one that exists in our body, R is only chemically available?
Alternative to Glutamin:
Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin – GlutaMAX
NaHCO3 – sodium bicarbonate
o Buffer! → prevents a fast acidification of the medium due to CO2 production of the
cells
o The higher the concentration of NaHCO3 in the medium, the higher the CO2 value in
the incubator should be (otherwise the medium becomes alkaline).
Salts and buffers
o Maintaining osmotic pressure and membrane potential
o Sodium, potassium, calcium, magnesium, chloride and phosphate
o Two-valued ions (Mg2+ and Ca2+) serve as cofactors and are important for
adherence and for the formation of cell-cell contacts
o Buffers – to prevent pH fluctuations
o HEPES buffer is used as a replacement for bicarbonate buffers – better at
maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration
Signs of mycoplasma contamination
Mycoplasmas are parasites for humans, animals and plants
o Mycoplasma is not visible by the “naked eye”
o Indirect signs:
▪ Premature yellow appearance of the medium
▪ Deteriorated cell growth
▪ Cytopathic effects (CPE) – cell damage
▪ Decreased adherence of the cells
Transformation
Transformation: nicht-virales Einbringen von Fremd-DNA in
kompetente Bakterien
Transduktion
Infektion durch ein Virus oder viralen Vektor
Warum Säugetierzellen transfizieren?
Um die Funktion bestimmter Gene oder Genprodukte zu untersuchen, z.B. als
Modellsystem während der target Validierung oder um Expression eines bestimmten
Gens anzuregen/zu unterdrücken, z.B. gene therapy, oder um rekombinante Proteine
zu produzieren, z.B. tissue plasminogen activator oder TNF-alpha
Primärkultur vs. Zell-Linie
Primärkultur (Finite Kulturen)
▪ = zeitlich begrenzt kultivierbar
▪ Isolierte Zellen aus Gewebe und Organen, z.B, Neurone
▪ Typische Veränderungen im Verlauf der Kultivierung, typische in vivo-
Eigenschaften
▪ Hoher Arbeits- und Zeitaufwand
Zell-Linien (Permanente Kulturen)
▪ = zeitlich unbegrenzt kultivierbar
▪ Immortalisiert = unsterblich
• Tumorzellen
• Stabil transfizierte Zellen (EBV, SV-40)
• Transfektion mit Telomerase
Fixation - why?
To preserve cells and tissue components in a “life-like state”
• → prevention of autolysis and putrefaction or cellular decay
• → prevention of loss and diffusion of soluble substances
• → enhancement of rigidity and mechanical strength of the cell
• To retain reactivity to stains and other reagents (antibodies and nucleic acid probes)
Types of fixatives:
o → create intermolecular bridges and a network of linked
antigenic proteins
o + preservation of cell morphology suited for immunostaining
of membrane proteins
o - reduced target antigenicity → aldehydes (formalin or
formaldehyde, glutaraldehyde)
• Precipitating (denaturing)
o → strong dehydrants and cause the precipitation of cellular
o + good choice for aldehyde-sensitive epitopes,
permeabilization step might be avoided
o – can remove small soluble molecules and lipids, not
recommended for use with overexpressed fluorescent
proteins highly volatile and flammable → organic solvents
(methanol, acetone, picric acid)
Paraformaldehyde (PFA)
• Powder form of polymerized formaldehyde
• Decomposes in formaldehyde when heated (in aqueous solution)
• Needs to be dissolved in PBS before use
• Methanol is added to formalin prevent precipitation (effect on
• 4% PFA solution is optimal or fixing tissue and cells
Phalloidin staining
▪ Natural product (Amanita phalloides)
▪ High affinity for (F-) actin
▪ Can be labelled fluorescently (Alexa Fluor® 488)
▪ Advantages over antibodies:
• No need for secondary antibody, denser labelling, low non-specific
binding
Blocking
Reduction of non-specific binding of antibodies
▪ Blocking buffer: heat-inactivated normal serum from the same species as the
host secondary antibody (alternatives: FCS, BSA, casein protein, non-fat dry
milk, gelatine)
It is possible to perform the staining with those three different fluorophore
because their excitation and emission spectras are compatible?
there is no major overlap between the spectras, which is important to
avoid a bleed-through
▪ A Bleed through means that the excitation spectra of two fluorophores
are too close to each other and partially overlap
▪ So some fluorescent signals are detected in multiple channels which leads
false positive signals
▪ Overall the number of possible stainings at the same time is limited
Last changeda year ago
