Genotypisierung

o Falsch vorbereitetes Gel (ungleichmäßige Erstarrung)

o Verschütten aus dem well (zu viel aufgetragen, das Gel zu viel bewegt)

o Falsch vorbereitete Probe (zu viel Salz im Puffer)

o Fragmentierte DNA: DNAse, mechanisch, chemisch oder enzymatisch

o Kontamination: v.a. vor PCR, wenn keine filter tips benutzt wurden

o Sekundärstrukturen: hoher GC-Gehalt führt zur Ausbildung stabiler

Sekundärstrukturen und Denaturierung von T zu schwach

o Zu wenige PCR-Zyklen: Konzentration zu gering

o Falsches annealing T: Primer können nicht an DNA binden

o Abgebaute DNA: Fragmentierung falsch vorbereitete Probe: fehlende Komponenten

für PCR, falsche Probenvorbereitung

Nachträgliche Genotypisierung mangels äußerlicher Marker → differentielle PCR

über veränderten Genlocus

o Positiv-Kontrolle: heterozygotes Tier (1 Allel KO) – um zu sehen, ob es überhaupt

Banden gibt oder ob grundsätzlich was schiefgelaufen ist

o negativ-Kontrolle: Wasser (keine DNA) – um zu sehen, ob auch andere Komponenten

im Puffer eine Reaktion hervorrufen

Chelatoren, die Mg2+ und Ca2+ komplexieren und damit Zellbindungen (Cadherine

brauchen Ca2+) auflösen und DNAsen (die Mg2+ brauchen, um funktionsfähig zu

sein) inaktivieren

o Positive Selektion: Herpes-Simplex-Virus-Tyrosinkinase = HSV-TK → die selektieren,

die Resistenz haben oder Hygro – andere Sequenz, um zu schauen ob beide Vektoren

eingefügt wurden

o Negative Selektion: DT = Diphtherietoxin → tötet Zelle, die nicht richtig transformiert

ist

o Ist damit der Puffer gemeint oder der Ablauf der PCR?

▪ Genotypisierungs-Lyse-Puffer und Proteinase K (100:1)

• (NH4)2SO4 – Protein Präzipitation (Ausfällung)

• Tris/HCl 8,8 – sorgt für richtigen pH-Wert

• MgCl2 – positive Ionen stabilisieren DNA • Beta-MercaptoEtOH – reduziert Disulfidbrücken im Proteinen und

denaturiert

• EDTA – Komplexiert (cheliert) Metallionen (Mg2+ und Ca2+), damit

DNAsen nicht arbeiten können und Zell-Zell-Verbindungen

destabilisiert werden

• SDS – Tensid, destabilisiert die Membran

• Triton - ?

• HPLC-Wasser – hochrein (spezifische Reinheit und Leitfähigkeit)

• Proteinase K – inaktiviert Nukleasen, Ca2+ als Kofaktor benötigt

• Über Nacht bei 56°C→Temperatur erhöhen, damit Proteinase K auch ohne zweiwertige Kationen arbeiten kann

  
  

PCR ABLAUF

dsDNA wird denaturiert (erhitzen) → Einzelstrang-DNA → Addition

spezifischer Primern (Oligonukleotide) → Synthese des komplementären

DNA-Strangs (Taq-Polymerase) → dsDNA wird wieder denaturiert (etwa 35

mal wiederholen → Auftrennung der DNA im Agarosegel, PCR-Produkt wird

nach Ethidiumbromidfärbung im UV-Licht sichtbar

Kontaminationenvermeiden!

▪ Filter-Tips (gegen Aerosolbildung)

▪ UV-Bestrahlung der Geräte, Reagenzien (hier nicht angewendet)

▪ Kittel anziehen

1. ESC sind pluripotent

   • ▪  1. Entnahme von ES-Zellen aus Blastocysten mit z.B. XY-Konstitution

   • ▪  2. Vermehrung der ES-Zellen, Durchführung der homologen Rekombination

   • ▪  3. Selektion rekombinanter Zellen mittels Neomycin, diese auch durch

     Reportergen erkennbar

   • ▪  3b. Neomycinresistenzgen mit Cre-Rekombinase herausgelöst

   • ▪  4. Injektion rekombinanter ES-Zellen in Wirtsblastocyste

   • ▪  5. Ammenmutter

   • ▪  6. Geburt→Chimärenmaus mit Gonade (Hoden)

   • ▪  7. Paarung einer normalen weiblichen Maus mit einer Chimärenmaus mit

     verändertem Zielgen in einigen Spermien

   • ▪  8. Nachkommen

   • ▪  F1→Nachkommen können heterozygot für verändertes Gen sein

   • ▪  F2→Nachkommen können homozygot für verändertes Gen sein (KO-

     Mutanten oder transgene Mäuse)

Harsches Detergens, kann die Nuklearmembran permeabilisieren – da Intrazellulär gefärbt und somit auch dort blockiert werden soll→muss durch Zellmembran gelangen können

1. Embryonale Stammzellen gewinnen

2. Einbringen der Vektoren

3. Einbringen der Cre-Rekombinase

4. Test der biologischen Kompetenz

Ziel → Generierung einer neuen APP KO Mauslinie

...aus Blastocyste einer WT-Maus!

Blastocyste ist pluripotent!!

mittels Elektroporation!

ebenfalls mit Elektroporation!

Für die Deletion von APP

Positive Selektionsmarker:

Neomycin- und Hygromycin-Resistenz

Negativer Selektionsmarker:

Diphtherie-Toxin (DT) und HSV-TK

Proteinase K

Ziel → Abbau der Zell- und Gewebestrukturen zur Freisetzung der DNA

Proteinabbau → zersetzt Histone, inhibiert Nukleasen

anschließend:

• ●  Inkubation bei 56 °C über Nacht

• ●  Inaktivierung der Proteinase K bei 96 °C

• ●  Zentrifugation der Proben

476 bp

410 bp

• als Positivkontrolle: heterozygote KO Maus (APP +/-)

• als Negativkontrolle: H2O

• interkaliert mit DNA und kann mit UV-Licht sichtbar gemacht werden

Dass sie die gleiche Annealing Temperatur haben

sollten nicht an sich gegenseitig binden

sollten keine hairlike structures bilden

Denaturierung vom Protein —> DNA wird freigelegt

puffert —> sorgt für den richtigen pH Wert

• positive Ionen stabilisieren DNA

• reduziert Disulfidbrücken in Proteinen und denaturiert diese

• DNA ist in Histonen gewickelt, diese will man lösen

• DNAsen und Nukleasen deaktivieren

• komplexiert Metallionen (Mg2+ und Ca2+(Zell-Zell-Verbindungen)), damit die DNAsen nicht arbeiten können und Zell-Zell Verbindungen destabilisiert werden

Tensid —> Permeabiiserung der Membran

Tensid —> Permeabiliserung der Membran

• hochrein (spezifische Reinheit und Leitfähigkeit)

• inaktiviert Nukleasn, verdaut Histone, Ca2+ wird als Kofaktor benötigt

• Falsch vorbereitetes Gel (ungleichmäßige Erstarrung)

• Verschütten aus dem well (zu viel aufgetragen, das Gel zu viel bewegt)

• Falsch vorbereitete Probe (zu viel Salz im Puffer)

• Fragmentierte DNA: DNAse, mechanisch, chemisch oder enzymatisch

• Kontamination: v.a. vor PCR, wenn keine filter tips benutzt wurden

• Unspezifische Primer: binden off target oder bilden Primerdimere

• Falsch zubereitete Probe (zu viel Mg2+)

• Kontamination: mit fremder DNA oder ausversehen ladder zum sample hinzugefügt

• Sekundärstrukturen: hoher GC-Gehalt führt zur Ausbildung stabiler Sekundärstrukturen und Denaturierung von T zu schwach

• Zu wenige PCR-Zyklen: Konzentration zu gering

• Falsches annealing Temp: Primer können nicht an DNA binden

• Abgebaute DNA: Fragmentierung

• Falsch vorbereitete Probe: fehlende Komponenten für PCR, falsche Pufferzusammensetzung

• nicht determiniert; können ganzen Organismus ausbilden, aber keine Plazenta Strukturen

Wir würden nicht wissen, ob beide Vektoren eingebracht worden wären

• Maus ist fake schwanger (Verpaarung mit sterilem Mann)

• Sie produziert dann Hormona

• dann kann man die Blastozyten entnehmen

Nicht-homologe Rekombination :

• 100 x wahrscheinlicher als homologe Rekombination

• off target, random integration

• standard integration gegen die man selektieren muss

• Nur Maus und Ratte (das ist also keine triviale Sache)