Vorlesung 6

Eine Solubilisierung von Membranproteinen ist notwendig, um sie aus der Membran zu lösen und in eine wässrige Lösung zu bringen, damit sie weiter untersucht und analysiert werden können. Membranproteine spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, wie zum Beispiel bei der Signaltransduktion, dem Transport von Molekülen und der Zelladhäsion, und ihre Untersuchung ist daher von großem Interesse für die biomedizinische Forschung.

Membranproteine sind jedoch aufgrund ihrer hydrophoben Regionen, die in die hydrophoben Schichten der Lipidmembran eingebettet sind, schwierig zu handhaben und zu untersuchen. Daher müssen sie aus der Membran extrahiert und in eine Lösung gebracht werden, in der sie stabil und löslich sind.

Bei der Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien interagieren die hydrophoben Teile der Detergenzmoleküle mit den hydrophoben Teilen der Membranproteine, während die hydrophilen Teile der Detergenzmoleküle in Kontakt mit dem wässrigen Lösungsmittel bleiben. Diese Wechselwirkungen führen zur Entfernung von Lipiden und der Stabilisierung der Membranproteine in Lösung.

Die spezifischen molekularen Interaktionen hängen jedoch von vielen Faktoren ab, wie zum Beispiel der Größe, Form und Hydrophobizität des Detergenzmoleküls und der Struktur und Konformation des Membranproteins. Die Art und Weise, wie sich das Detergenz an das Membranprotein bindet, kann sich auch auf die Struktur und Aktivität des Proteins auswirken.

Die N-Glykosilierung ist ein Prozess, bei dem Kohlenhydratmoleküle (Zucker) an bestimmte Asparagin-(Asn)-Reste in Proteinen gebunden werden. Es handelt sich um eine posttranslationale Modifikation, die in eukaryotischen Zellen und einigen Prokaryoten stattfindet.

Der Prozess der N-Glykosilierung beginnt im Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo ein spezielles Protein-Komplex, das sogenannte Oligosaccharyltransferase-Komplex (OST), eine aus mehreren Zuckerbestandteilen bestehende Kohlenhydratkette (Oligosaccharid) an das Stickstoffatom des Asn-Rests in der Proteinsequenz bindet. Diese Kohlenhydratkette wird im ER weiter modifiziert, indem weitere Zuckerbestandteile hinzugefügt und durch Glykosidasen, die Proteine, die Zucker binden, wieder entfernt werden.

Die N-Glykosilierung hat verschiedene Funktionen. Sie kann die Stabilität und Faltung von Proteinen beeinflussen, die Proteinaufnahme in Zellmembranen oder das Erkennen von Signalen zwischen Zellen und ermöglichen. Darüber hinaus kann sie auch eine Rolle bei der Immunantwort und der Interaktion mit der extrazellulären Matrix spielen.

Fehler bei der N-Glykosilierung können zu verschiedenen Krankheiten führen. Zum Beispiel können Mutationen in Genen, die an der N-Glykosilierung beteiligt sind, zu angeborenen Störungen der Glykosylierung (CDG) führen. Diese Störungen können sich auf unterschiedliche Weise äußern, darunter Beeinträchtigungen der kognitiven Entwicklung, Schwäche, Fehlbildungen und erhöhte Anfälligkeit für Infektionen.

1. Synthese der Dolicholphosphat-Oligosaccharide (DLOs): Die DLOs werden in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) synthetisiert und bestehen aus einem Lipidanker (Dolicholphosphat) und einem komplexen Kohlenhydratmolekül.

2. Übertragung der DLOs auf das Zielprotein: Die DLOs werden vom Lipidanker auf das Zielprotein übertragen, das über ein bestimmtes Aminosäurerest (Asparagin, Asn) im Konsensussequenz N-X-S/T (wobei X für jede Aminosäure außer Proline stehen kann) verfügt.

3. Trimmen der DLOs: Die DLOs auf dem Zielprotein werden vom Enzym Oligosaccharyl-Transferase (OST) modifiziert und auf die endgültige Größe reduziert.

4. Transport und weitere Verarbeitung: Das Zielprotein wird vom ER in den Golgi-Apparat transportiert, wo weitere Zuckerbausteine hinzugefügt oder entfernt werden, um die endgültige glykosylierte Form des Proteins zu erhalten.

Der Unterschied zwischen N- und O-Glykosylierung hauptsächlich auf die beteiligten Aminosäurereste und die Orte der Modifikation zurückzuführen. N-Glykosylierung bindet an Asparagin-Reste, während O-Glykosylierung an Serin- oder Threonin-Reste gebunden wird. N-Glykosylierung findet im Endoplasmatischen Retikulum statt, während O-Glykosylierung im Golgi-Apparat stattfindet. Beide Modifikationen können die Funktion und Eigenschaften von Proteinen beeinflussen und spielen wichtige Rollen in verschiedenen biologischen Prozessen.

Die Transmembranvorhersage über den Hydropathie-Index basiert auf der Annahme, dass Transmembranproteine hydrophobe und hydrophile Bereiche aufweisen. Hydrophobe Aminosäuren sind dabei in der Regel in den Transmembranbereichen zu finden, während hydrophile Aminosäuren in den extrazellulären und intrazellulären Bereichen des Proteins vorkommen.

Der Hydropathie-Index ist ein Maß für die hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften einer Aminosäure. Er wird durch den Vergleich des Verhaltens einer Aminosäure in einer hydrophoben und einer hydrophilen Umgebung bestimmt. Ein hoher Hydropathie-Index weist auf eine starke Hydrophobizität einer Aminosäure hin, während ein niedriger Index auf eine starke Hydrophilie hinweist.

Bei der Transmembranvorhersage über den Hydropathie-Index wird der Hydropathie-Index für jedes Aminosäurerest im Protein bestimmt und in ein Diagramm übertragen, das die Positionen der Aminosäurereste in Bezug auf die Membran anzeigt. Dabei werden die hydrophoben Bereiche des Proteins als Transmembranbereiche interpretiert und die hydrophilen Bereiche als extrazelluläre oder intrazelluläre Bereiche.

Die Topologie von Membranproteinen beschreibt die räumliche Anordnung der verschiedenen Strukturelemente eines Proteins in der Lipid-Doppelschicht der Zellmembran. Im Inneren der Lipidschicht kann das Proteinrückgrat keine WasserstoffbrückenBindungen mit den Lipiden ausbilden → die Atome des Rückgrats müssen miteinander Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden, (Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den C=O und N-H Atomen des Rückgrats) sie müssen entweder a-helikale oder b-Faltblattkonformation annehmen.

Die dreidimensionale Faltung des Proteins wird vor allem durch die Diederwinkel des Proteinrückgrats bestimmt. Pro Residue gibt es 2 frei drehbare Diederwinkel, die als (Phi, zwischen C' − N − Cα − C‘, Carbonyl-C-Atome) und (Psi, zwischen N − Cα − C' − N, Amid-Stickstoffe) bezeichnet werden.

Die hydrophobe Umgebung erzwingt, dass Strukturen von Transmembranproteinen entweder reine ß-Barrels oder reine a-helikale Bündel sind.

Nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChR) sind eine Art von ionotropen Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Zellen vorkommen und für Anionen und Kationen permeabel sind. Sie sind aus fünf Untereinheiten aufgebaut, die um eine zentrale Pore angeordnet sind. Jede Untereinheit besteht aus vier transmembranen Domänen (TM1-TM4), wobei die TM2-Domäne die Pore bildet. Die Untereinheiten können entweder aus α- oder β-Subtypen bestehen, wobei mindestens zwei α-Untereinheiten vorhanden sein müssen.

Die Untereinheiten sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden und bilden so eine pentamere Struktur, die als Pore bezeichnet wird. Jede Untereinheit hat eine Bindungsstelle für den Neurotransmitter Acetylcholin, der den Rezeptor aktiviert und eine Konformationsänderung auslöst, die den Durchfluss von Natriumionen in die Zelle ermöglicht.

Single-Pass-Membranproteine sind eine Art von integralen Membranproteinen, die nur einmal die Membran durchqueren. Sie bestehen aus einer hydrophoben Transmembran-Domäne, die sich in der Membran befindet, und zwei hydrophilen Domänen, die sich auf der extrazellulären und intrazellulären Seite der Membran befinden.

Diese Proteine erfüllen verschiedene Funktionen in der Zelle, je nach ihrer Position und ihrer spezifischen Aminosäuresequenz. Einige Single-Pass-Membranproteine dienen als Rezeptoren für Hormone, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmitter, während andere als Transporter oder Kanäle für Ionen und Moleküle fungieren.

-> z.B. Glykophorin A aus Erythrozyten

Im Gegensatz zu Single-Pass-Membranproteinen gibt es auch Multi-Pass-Membranproteine, die mehrere Transmembran-Domänen aufweisen und die Membran mehrmals durchqueren.

Die Translokation eines Membranproteins über die ER-Membran erfolgt in der Regel während der Synthese des Proteins durch Ribosomen, die an die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) gebunden sind.

1. Erkennung der Signalsequenz: Wenn ein Membranprotein synthetisiert wird, enthält es am N-Terminus eine spezifische Signalsequenz, die das Protein als Ziel für die Translokation zum ER kennzeichnet. Diese Signalsequenz wird von dem Signal Recognition Particle (SRP) erkannt, das eine Bindung an die Ribosomen und das Stoppen der Proteintranslation veranlasst.

2. Bindung an den Translokonkanal: Der SRP-Rezeptor bindet an das SRP, das an das Ribosom gebundene Protein und den Ribosomen-Translokonkanal-Komplex bindet. Der Translokonkanal ist ein Proteintransporter, der die ER-Membran durchspannt.

3. GTP bindet an den SRP-Rezeptor, die Pore wird geöffnet. Das Polypeptid wird in die Pore inseriert.

4. GTP wird Hydrosiliert und SRP freigesetzt.

5. Die Signal-Peptidase entfernt die Signal-Sequenz und das Polypeptid wird ins ER hinein verlagert.

6. Das fertige Polypeptid wird ins ER-Lumen entlassen. Die Ribosomen lösen sich vom ER und die Translokationspore schließt.

Die Klonierung eines Membranproteins mit Capsaicin im Jahr 1997 bezog sich auf die Entdeckung des menschlichen Vanilloid-Rezeptor-1 (VR1), der eine Rolle bei der Schmerzwahrnehmung spielt und durch Capsaicin aktiviert werden kann. Capsaicin ist der scharfe Bestandteil von Chilischoten, der ein brennendes Gefühl in Mund und Rachen verursacht. Capsaicin stimuliert freie nozizeptive Nervenendigungen (Ad- und C-Fasern) ähnlich der Wirkung von noxischer Hitze und bedingt den Einstrom von Calciumionen.

Die Klonierung von VR1 wurde von einem Team von Wissenschaftlern unter der Leitung von David Julius durchgeführt. Die Wissenschaftler verwendeten eine cDNA-Expressionsbibliothek, um Gene zu identifizieren, die für Proteine kodieren, die auf Capsaicin ansprechen. Sie führten eine funktionelle Genomik durch, um die von Capsaicin aktivierten Gene zu identifizieren, und identifizierten VR1 als das Zielprotein.

Um VR1 zu klonieren, extrahierten die Wissenschaftler RNA aus menschlichen sensorischen Neuronen und synthetisierten daraus cDNA. Dann nutzten sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um das VR1-Gen aus der cDNA zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde in einen Vektor eingefügt und in Bakterien kloniert, um eine große Menge von VR1-Protein zu produzieren.

Die Klonierung von VR1 war ein wichtiger Durchbruch in der Erforschung von Schmerzrezeptoren und hat dazu beigetragen, unser Verständnis von Schmerzmechanismen und der Wirkung von Capsaicin auf den Körper zu verbessern.