Genregulation

weil die Genexpression in Auswahl, Dauer und Intensität ein zeitliches gedächtnis zur zuvor abgelaufenen Genexpression darstellt

passive DNA-Demethylierung:

-> neu synthetisierter DNA-Strang wird nach replikation nicht methyliert

aktive DNA-Methylierung:

-> Enzyme vermitteln Demethylierung von Cytosin (zunächst Oxidierunng zu Carboxylgruppe, dann Basenaustausch)

-> kommt z.B. in Gamten vor durch Enzym Ten-Eleven-Transformation Methylcytosin Dioxygenase (TET) bei Zebrafisch

• 2 Paare von je 4 verschiedenen Histonen (Proteine, die strukturelle Organisation der DNA vermitteln) lagern sich zu Nukleosom zusammen

• Histone stark positiv, DNA negativ -> Interaktion: DNA-Doppelstrang umläuft Nukleosom 1,75 mal über Länge von 146 BP

• im Chromatin ist DNA wie Perlenkette aus Nukleosomen organisiert, wobei DNA-Faden die Histon-Perlen umläuft

• Histon 1 verknüpft Nukleosomen für noch höheren Verdichtungsgrad

• ca. 6 Nukleosomen nehmen helixähnliche verdrillte STruktur ein = Solenoid

• Solenoide verdichten sich zu DNA-Schleifen, die an Proteingerüst gebunden sind (jede Schleife ca. 100 kb)

• Verdichtunng um das 10000 fache

Euchromatin:

• locker verdichtet, DNA zugänglich für Replikations- und Transkriptionsvorgänge -> aktiv

• kann reversible Zustände erreichen je nach Situation der Zelle (Hiistonkonzentration) -> Regulation

• nur während Zellteilung hochverdrillt

Heterochromatin:

• hochverdichtet, DNA unzugänglich für Replikation und Transkription

• regulatorische Rolle -> stabilisierende Schutzfunktion für Integrität der Chromosomen, da es Bindunng von DNA-modifizierenden Proteinen unterbindet

• konstitutives Heterochromatin: in allen Zellen zu allen Zeiten dicht gepackt -> stillgelegter Anteil der DNA in Centromer- und Telomer-Region von Chromosomen

• fakultatives Heterochromatin: nur in bestimmten Zelltypen stillgelegt z.B. Stilllegung eines X-Chromosomens in weiblichen Säugetieren

• Histonkonzentration bei Euchromatin

• Methylierung der DNA an Cytosin oder von Histonen -> Inaktivierung

• Acetylierung von Lysinresten der Histone neutralisiert positive Ladung und verringrt damit Interaktion mit DNA -> Aktivierung

• Phosphorylierung von Serin, Threonin, Tyrosin von Histonen inaktiviert Transkription -> Inaktivierung, allerdings sehr variabel und kontextspezifsch

• Chromatinumformung

Chromatinumformungskomplex:

-> bildet sich bevor die eigentlichen Transkriptionsaktivatoren und repressoren aktiv werden

• Histonacetylierung öffnet Chromatin

• Histon-Chaperone binden Histone und setzen DNA frei, sodass sie für TF zugänglich wird

• Histon-Kinase phosphoryliert Aminosäureseitenketten von Histonen

• kontextabhängig kommt es zur Aktivierung oder Inaktivierung von Transkriptionsvorgängen

-> TF können nicht nur auf EBene des Transkriptionskomplexes sondern auch auf Ebene der Chromatinzugänglichkeit wirken

wenn Signaltransduktionsvorgänge irreversible Änderungen an der DNA vornehmen, die auch bei Zellteilungen weitergegeben werden z.B. DNA-Methylierung

• DNA-Methyltransferasen (DNMTs) methylieren Cytosin an C5 zu 5-Methylcytosin (erfolgen in der Regel an CpG-Islands)

• bei Replikation im Zuge der Zellteilung werden beide Parentalstränge der DNA-Helix aufgetrennt und nehmen ihr Methylierungsmuster mit

• neu synthetisierten Stränge sind noch unmethyliert -> Methylierungsmuster wird allerdings durch Erhaltungs-Methylasen übertragen

• methylierte DNA ist stillglegt

• isolierte DNA wird mit Nukleasen behandelt

• Entfernung des Proteinanteils

• Gel-Elektrophorese

• unterschiedlich große DNA-Fragmente -> Abschnitte müssen geschützt gewesen sein

• Gene für den gleichen Syntheseweg sidn auf Operons in Genclustern lokalisiert

• vorne befindet sich Promotor als an und ausschalter für Expression (Negativ und Positivkontrolle möglich)

• bei schwachen Promotoren Erhöhung der Transkriptionsrate durch Bindung von Transkiptionsaktivator

Beispiel: Tryptophan-Synthese

• Promotregion hat Bindestelle für Repressor mit Tryptophan-bindedomäne

• hohe Trypotophankonzentration = Tryptophan bindet an Repressor, induziert Konformationsänderung, Repressor besetzt Promotorregion -> keine Expression

• niedrige Tryptophan-Konzentration = Repressor löst sich von DNA

• Repressor wird über allosterischen Effekt reguliert (mehrere Tryptophan müssen binden, um Rauschen zu verhindern)

• Repressor sitzt gebunden direkt vor dem Transkriiptionsstart = cis-Regulation

• sehr viel komplexer als bei prokaryoten, da Zellen viel größer und Eukaryoten diploid, sodass Gen und regulatorische Sequenz in mehreren Kopien auf unterschiedlichen Chromosomen vorkommen

• Bindung von TF an DNA erfolgt nicht einzeln, sondern als kleine TFkomplexe

• TF können klare Aktivatoren oder Repressoren sein, aber auch Kofaktoren, die sich an beiden Arten von Komplexen beteiligen können -> Funktion wird durch Kontext der DNA-BIndestellen und ihrer Zuordnung bestimmt

• regulatorische Transkriptionsaktivatoren arbeiten synergetisch = gemeinsame Wirkung der Aktivatoren ist größer als Summe ihrer EInezleffekte (gelingt durch effizientere Rekrutierung der basalen TF und richtige Reihenfolge der Rekrutierungsschritte)

• regulatorische Sequenzen meist kurze Abschnitte mit mehreren TF-Bindestellen -> Schleifenbildung häufig, bei räumlicher Disanz zu Gen

• am Promotor entsteht Transkriptionsinitiationskomplex -> erfodert Vielzahl an Protein-DNA und Protein-Protein-Interaktionen (erhöhen Spezifität) -> Sicherstellung, dass Gen nur exprimiert wird, wenn korrekte Kombination der TF exprimiert wird

  
  

Promotor integriert alle Signale

• Integration beruht auf Wettbewerb zwischen Aktivatoren und Repressoren -> letztlich wird binäre Entscheidung getroffen (an/aus), die in ihrer Stärke variieren kann

Isolatorelemente -> dienen als Sperre für für Transkriptionsregulation, sodass regulatorische Elemente nur in eine Richtung auf dem DNA-Strang aktiv werden können

• spezifische DNA-Bindedomäne + Repressordomäne (modularer Aufbau)

• Konkurrenz um gleich Bindestelle der DNA wie Aktivatoren

• Inhibition der Aktivierungsdomäne von Transkriptionsaktivatoren

• direkte Interaktion mit basalen TF

• Aktivitierungdomänen, welche die Genexpression beschleunigen (Transkriptionsaktivator)

• Silencerdomänen, welche die Genexpression unterdrücken (Transkriptionsrepressoren)

• manche TF enthalten beide Arten von Domänen zb. KLF4 (je nach Interaktionspartner wandelt sich Domäne um) -> kontextspezifisch

Ein TF kann alternativ mit nukleären Proteinen mit Aktivator- oder Repressordomänen interagieren und situativ als Transkriptionsaktivator oder -repressor fungieren.

• Transgene Linien köönnen untereinander ausgetauscht werden (Standardisierung in vielen Laboren -> internationalisisierung)

• mehrere Kombinationsmöglichkeiten

• DNA bindende Domäne entstammt Tet.Repressor TetR aus Bakterien -> bindet als Dimer, Consesnsus-Sequenz = TRE-Sequenz

• Tet-Domäne kann mit VP16-Domäne fusioniert werden -> TF tTA (bindet TRE und kann aktivieren)

• TetR vermittelt in BAkterien Antibiotikaresistenz gegen Tetracycline

• Mutationen erzeugten reverse Tet-Domäne: bindet TRE nicht

• wenn rtTA an Tetracycline bindet, wird durch allosterischen Effekt Bindung mit TRE möglich

• Tet-Off-System: Expressionsystem mit tTa -> grundsätzlich aktiv, lässt sich mit Tetracyclinen abschalten

• Tet-On-System: Expressionsystem mit rtTA -> grundsätzlich inaktiv, lässt sich mti Tetracyclinen anschalten

• zeitliche Kontrolle über Genexpresion

• ermöglicht Ansteuerung gezielter Stellen im Genom

• Beispiel:

  • Zinkfinger-Peptidstruktur von TF bilden alpha-Helix, mit der sie spezifische BAsen auf der DNA kontaktieren

  • mehrere Zinkfinger können durch ß-Faltblätter hinteriander geschaltet werden

  • 1 Zinkfinger bindet 3 nebeneinander liegende Basen

  • eigene Entwerfung von Zinkfingerstrukturen

• wenn an Sequenz der programmierten Domäne noch ein nukleäres Lokalisationssignal und Transkriptionsaktivatordomäne gesetzt wird, erhält man Transkriptionsaktivator mit frei gewählter Sequenz

• ermöglicht neue Form der Gentherapie

• analog mit Repressor

• Vereinfachung mit TAL-Effektoren (TALEN) -> Repeat Variable Diresidue

• CRISPR/Cas-System

light-oxygen-voltage sensitive domain: unter blauer Lichtabsoprtion wird zb Flavin an Thiolgruppe von Cystein gebunden und löst sich wieder wenn Licht weg ist

• Vermittlung von Homo und Heterodimerisierung (Optogenetik)

• LOV zwischen DNA-bindendene Domäne und Transaktivatordomäne von TF kann Licht Dimerisierung stimuliert werden -> Licht stimulierte Genexpresion

• besteht aus ca 60 AS, die 3 alpha-Helices ausbilden, welche Basen in major groove binden, sodass sie als TF dienen

• Protein Engrailed gehört zu Homeobox-TF

• in der Regel Repressor

• exprimiert in Wirbeltieren im sich entwickelnden Gehirn

• ungewöhnlich: nicht zellautonome Sezernierung -> kann daher auch als SIgnalmolekül wirken

bevorzugte Sequenz, welche ein TF bindet (speziesabhängig und hochkonserviert)

1. radioaktive Markierung von DNA + Inkubierung mit Proteinextrakten -> Behandlung mit DNAsen

• verdauen alle ungeschützten DNA-Abschnitte, Proteingebundenen Abschnitte bleiben intakt

• können mit Gel-Elektrophorese getrennt und sequenziert werden

• Bindungsstärke kann ermittelt werden: hochaffine Bindungen brauchen nur wenig Protein und lösen sich erst unter stringenten Bedingungen

1. footprint-Analyse:

• radioaktive Markierung eines DNA-Abschnitts + Inkubation mit TF

• DNAsen oder chem. Hydrolyse erezuggt Gemisch unterschiedlich langer Sequenzen -> bindestelle durch TF geschützt

• Auftrennung nach Größe

Bestimmung der Consensussequenz:

• Inkubation des TF mit ganzer Bib von kurzen DNA-Abschnitten willkürlicher Sequenz

• Aufreinigunng

• Sequenzierung

• relative Häufigkeit für jede Basenposition bzgl einer der 4 Basen

Abschluss von Signalkaskaden, die Information in Zellkern bringen und selbst an Regulation der Expression der Zielegene beteiligt sind

• müssen Peptidsequenzen haben, die spezifische DNA-Sequenz erkennen können (meist 4-8 Basen)

• die Seitenketten von AS treten in direkte WW mit den Nukleotidbasen -> aufgrund der Struktur der DNA nur mit Basen entlang dr großen und kleinen Furche (hauptsächlich mit großer Furche, da dort mehr Platz für Interaktion und Basen dort großflächiger exponiert

• hohe Affinität

• eine der stärksten WW die bekannt sind

• Seitenketten der AS intergagieren va. mit freien EP von Elementen der Basen + H-Atome zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen

• die hohe Affinität zu mhereren aufeinanderfolgenden Basen garanntiert Spezifität der Bindung

• Helix-Loop-Helix-Domäne (2 alpha-Helices)

• Homöodomäne (3 alpha-Helices)

• Zinkfingerdomäne (alpha-Helix und ß-Faltblatt)

  ! 3 Zinkfingerdomänen hintereinander erhöhen Sequenzspezifität

• Leucin-Zipper

• Pou-Domäne

• Ausbildung von Dimeren erhöht Vielfalt der Erkennungssequenzen

• Kombination mehrerer (verschiedener) DNA-Bindedomänen zur Erhöhung der Sequenzspezifität, deer Bindungsstärke und Vielfalt an Kombinationen