Wnt-Signaltransduktion

Vorwärts-Genetik: Phänotyp ist beobachtbar, das verursachende Gen muss identifiziert werden

Rückwärtsgenetik: Gen ist bekannnt, Funktion muss geklärt werden

in ihrer räumlich-zeitlichen Expression

zu beginn ein Signalpeptid, womit sie ins ER Lumen reinsynthetisiert werden -> wird dabei abgeschnitten, damit Protein nicht mehr rauskann

• N-Terminus beginnt mit Signalpeptid

• hochkonservierte N-terminale und C-Terminale Domäne, die durch flexiblen Linker verknüpft sind

• N-terminale Domäne wird anschließend im Endomembransystem posttranslational modifiziert: Palmytilierung (Palmitinsäure -> lange unpolare Alkylrest)

• Wnt-Liganden deshalb hydrophob und diffundieren nur über kurze Distanzen

• sowohl N-terminale als auch C-terminale Domäne interagieren mit Rezeptor

• Palmitinkette wird dabei ebenfalls in Oberfläche des Rezeptors eingebettet -> wichtig für Affinität und Spezifität der Liganderkennung

• Ligand nicht gut wasserlöslich, daher wird er von Proteoglykanen (große Molekülkomplexe aus membrangebunden Moleküle und Zuckern) gebunden und Rezeptor präsentiert (können auch als Ligandenreservoir dienen)

! Wnt Liganden können auch auf Zellen weit entfernt Einfluss nehmen -> aber wie mit langem Alkyrest?!

1. Synthese erfolgt in ER, Wntless transportiert Wnt durch ER und Golgi -> posttranslationale Modifikationen

2. Ligand wird an Plasmamembran ausgeschüttet

3. 2 mögliche Wege:

   a) Ligand bindet SOFORT an Zellmembran, der ausschüttenden Zelle -> löst Bildung eines Zytonem (Membraneinstülpung) aus

   b) Ligand wird SOFORT wieder von ausschüttender Zelle über Endozytose aufgenommen -> Verpackung in Endosomen, die zu Exosomen verpackt werden (mehrere Liigandenvesikel) und in Multi-vesikulären Körpern (MVB) zusammengefasst und an Membran ausgeschüttet werden

4. Endozytose von Wntless und Rücktransport zum Golgi

• sehr kleine extrazelluläre Vesikel, die von meisten Zellemn produziert und freigesetzt werrden

• von lipiddoppelschicht umgeben

• enthalten in der Regel signalmoleküle

• werden zur Kommuniktion mit anderen zellen eingesetzt, Steuerung von physiologischen Prozessen wie Gerinnung, intrazelluläre Signalübertragung und Abfallmanagement

• G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

• 7 Transmembrandomänen

• N-Terminus extrazellulär, C-Terminus intrazellulär

• heißen Frizzled

Frizzled hat Ko-Rezeptor: LRP (Protein mit 1 transmembrandomäne) -> Seine Wechselwirkung mit Frizzled und Wnt ist für Aktivierung der Kaskade notwendig!

• Ko-Rezeptor von frizzled -> Wechselwirkung zwingend notwendig für Kaskade

• gegen ihn gibt es diffusible Inhibitoren wie Dickkopf oder Sclerostin oder Wise -> binden an extrazelluläre Domäne von LRP und verhindern so Aktivieruung der Signalkaskade

• Aktivität der Kaskade kann durch diese Inhibition räumlich und zeitlich sehr genau reguliert werden

• Related to receptor tyrosine kinase (Ryk) ist weiter Ko-Rezeptor von frizzled

• Interaktion von Wnt mit Ryk ist für Signalkaskade ebenfalls notwendig

• intrazelluläre Domäne hat keine Kinaseaktivität

• dienen der Komplexbildung von intrazellulären Signaltransduktionsfaktoren, um diese in räumliche Nähe zu bringen

  -> Aktivierung der Wnt Kaskade erfolgt schneller (Begegnungder Reaktionspartner durch Difussion entfällt) und spezifischer (keine störenden WW mit Proteinen der Umgebung)

• Wnt-Inhibitoren: secreted Frizzled-related proteins

• kleine sezernierte Proteine, die in ihrem Aufbau der extrazellulären Domäne von frizzled sehr ähnlen

• binden über Cysteinreiche Domäneim extrazellulären Raum an Wnt-Liganden, sodass diese nicht mehr an Frizzled binden können

• kompetitive Inhibitoren

• kompetitive Inhibierung -> regulation der Aktivierung der Kaskade

• können durch Komplexbildung die Difussionfähigkeit der Wnt-Liganden erhöhen -> Erhöhung des Wirkradius der Liganden

• klasissche Kaskade (kein Sonderfall) -> hängt im Zytoplasma von einem proteinkomplex ab, der als zentrale Komponente die GSK3ß-Kinase enthält

1. Wenn Wnt-Ligand nicht an Frizzled gebunden, ist Signalweg im Ruhezustand -> GSK3ß-Kinase phosphoryliert den zytoplasmatischen Faktor ß-Catenin -> ß-Catenin wird ubiquitiniert und dem Proteasom zum Abbau zugeführt

2. Liganden Wnt1, Wnt3a, Wnt8 und Wnt8b binden an Rezeptoren

3. intrazelluläre Konformationsänderungen im Frizzled und LRP Rezeptor

4. Dishevelled wird an Rezeptoren gebunden und zur Membran rekrutiert

5. Dishevelled bindet GSK3ß-Kinase, sodass Kinase an membran rekrutiert wird

6. GSK3ß-Kinase phosphoryliert dort Lrp und wird so aus Zytoplasma entfernt/inhibiert

7. ß-Catenin wird nicht mehr phosphoryliert und degradiert -> reichert sich an

8. Konzentrationserhöhung von ß-Catenin ermöglicht Kernimportweg

9. im Zellkern bindet ß-Vatenin an inaktiven Komplex der TF TCF/LEF, wodurch diese aktiv werden -> Aktvierung der Transkription

• Zellteilung

• Festlegung von Entwicklungsschicksalen der Zellen

1. kanonische Wnt-Signalkaskade

2. Ca2+ Signaltransduktionsweg

3. planarer Zellpolaritäts-Signaltransduktionweg

• Ligandenbindedomäne CRD -> reich an Cysteinen, die Disulfidbrücken bilden

• G-Protein bindende Domäne

• 2 PDZ-Domänen -> Domäne für Protein-Protein-Wechselwirkungen

  
  

  
  

  Ligandenbindung an CRD-Domäne löst intrazellulär Konformationsänderungen aus, sodass heterodimere G-Proteine und Proteine miit PDZ-Domäne mit Frizzled interagieren können

  
  

• lange dünne Membranfortsätze (ähnlich wie Filopodien)

• kann bis zu 100 mikrom lang werden und über diese Distanzen anderen Zellen Signalmoleküle präsentieren

• schlecht diffundierende Liganden können so über weite STrecken wirken

• weder ß-Catenin und LRP beteiligt

• Ligand: Wnt5a

• Ligandenbindunng erfolgt über Fzd und Korezeptor RYK/Ror

• Aktivierung hängt auch von exprimieten Kofaktoren ab

1. Bindung von Wnt5a an Fzd/RYK/Ror-Komplex

2. Rekrutierung von Dishevelled

3. aktivierter Frz interagiert direkt mit trimerem G-Protein

4. aktiviertes G-Protein aktiviert Phospholiase C

5. Phospholipase C spaltet an Membran PI(4,5)P2 zu IP3 und DAG

6. IP3 bindet und öffnet IP3-abhängige Ca2+-Kanäle

7. Einstrom von Ca2+ -> steigende Konzentration aktiviert Calmodulin

8. Calmodulin aktiviert CaMKinaseII

9. CaM-Kinase II phosphoryliert TF im Zytoplasma, die dann in Zellkern wandern können

10. parallel aktiviert DAG mit Ca2+ Ionen Proteinkinase C, welche auch TF phosphoryliert

• Zelladhäsion

• Zellmigration

• Trennung verschiedener Gewebe

• Phosphodiesterase spaltet sekundäre Botenstoffe cAMP und cGMP in AMP und GMP, die durch GPCRs erzeugt werden -> Ausbremsung der GPCR-Signalwege

• ebenso Inhibition der Ca2+ Freisetzung aus dem ER, da cGMP keine Kinase mehr aktivieren kann

• weder ß-Catenin noch LRP beteiligt

• Liganden: Wnt5b und Wnt11

• Fzd + Korezeptor RYK/Ror + Van Gogh like

1. Aktivierung von Rezeptor durch Liganden

2. Rekrutierung von Dishevelled

ab hier 2 Wege:

a) Aktivierung des Sishevelled-associated activator of morphogenesis 1 (DAAM1) im Zytoplasma

-> rekrutiert kleine GTPase RhoA -> aktiviert Rho-assoziierte Kinase ROCK -> Aktinpolymerisation

b) Dishevelled bindet und aktiviert kleine GTPase Rac -> aktiviert über Jun-KInase Genexpressionsvorgänge, die das Überleben der zellen unterstützen

• Aktin Polymerisation (Gestaltung des Zytoskeletts)

• Mikrotubuli Stabiliserung + Organisation

• transkriptionale Aktivierung von Zellüberlebensgenen

• Zellform -> Polarität der Zellen (Ausrichtung)

• Lithium-Ionen -> inhibieren GSK3ß -> Akkumulation von ß-Catenin -> Aktivierung der Kaskade

• Wnt-Agonist 1 überquert Zellmembran und führt unabhängig von GSK3ß die Kaskade

• Wnt-Antagonist C53 inhibiert Palmytoylierung und damit Ausschüttung der Liganden

• iCRT3v inhibiert Interaktion von ß-Catenin und TCF-TFs

• Inhibitor zb. Axitinib

• pharmakologisch

• über proteinvarianten z.b.

  • Phosphorylierung N-Terminus ß-Catenin -> konstitutiv aktive Variante

  • Deletionen an Dishevelled -> dominant negativ

Vorteil:

• genetisch kodiert

• gezielt in einem bestimmten Zelltyp

• beliebib frei wählbarer Zeitpunkt

• mit Expression von Reporterprotein kann dokumentiert werden

• aktivierte Kinasen CaM-Kinase II und PKC senden phosphorylierte TF in Zellkern, welche Aktivitt der TCF/LEF-TF unterbinden

  -> Ca2+ Weg unterdrückt kanonische Kaskade