Lipidkindergarten

• Grundbaustein der Biomembran

• amphiphile Moleküle

• hydrophile Bereiche (polarer Kopf, starkes Dipolmoment, pH-abhängige Nettoladung -> Wassermoleküle als Solvathülle außen rum)

• hydrophobe (unpolare Kohlenwasserstoffketten) Bereiche

• Um in polaren Lösungsmitteln die freigesetzte Energie zu vermindern, ordnen sich Lipide stets so an, dass nur die polare Kopfgruppe mit dem Lösungsmittel in Wechselwirkung tritt.

• In unpolaren Lösungsmitteln werden die unpolaren Reste nach außen angeordnet.

• Durch diese physikalischen Eigenschaften kommt es auch zur Bildung von Micellen und Doppelschichten.

• p = Packing-Parameter

  • Verhältnis der hydrophilen Köpfe zu den hydrophoben Fettsäureschwänzen

  • Wird er größer als 1, bilden sich invertierte Micellen aus, d.h. die Fettsäureschwänze werden nach außen gekehrt.

  • Wird er kleiner als 1, bilden sich Micellen bei denen die polaren Köpfe nach außen zeigen.

  • Wenn p = 1 gilt, dann wird eine Lipiddoppelschicht ausgebildet.

Lipide lichtgeschützt und kühl lagern -> verhindert Lipidperoxidation durch UV-Strahlung, Enzyme und Mikroorganismen die Lipide abbauen eingeschränkt

Vor Versuch bei Raumtemperatur aufwärmen

• Di-Myristoyl-Glycero-Phospho-Cholin (DMPC) -> 2 gesättigte C-14 Ketten + Cholinrest

• C36H72NO8P

• Tm = 24°C

• CMC = 6nmol

• Platzbedarf pro DMPC-Molekül: 39Å^2 (kristallin), 60-70 Å^2 (vollständig hydratisiert)

• Di-Palmitoyl-Glycero-Phospho-Cholin (DPPC) -> 2 gesättigte C-16 Ketten + Cholinrest

• C40H80NO8P

• Tm = 41,3°C

• CMC = 0,46nmol

• C14H28O2

• Tm = 53,5°C

• Umso längere C-Ketten desto höher Tm (je länger desto mehr vdW WW);

• Ungesättigt tiefere Tm als gesättigte (da weniger WW zwischen Molekülen, weil schlechter nebeneinander angeordnet)

• CMC

• Konzentration, ab der sich Moleküle nicht mehr an der Oberfläche anlagern, sondern in Mizellen -> Oberflächenspannung wird geringer je mehr an Oberfläche angelagert (enregetisch günstiger)

• Die Konzentration der Lipide in Lösung beeinflusst außerdem die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit. Diese wird geringer, je mehr Lipide gelöst sind. Die Formel der Oberflächenspannung ist gegeben durch:

• Flüssigkeiten haben zum Ziel, ihre relative Oberfläche zu minimieren. Die Kraft, welche aufgewendet werden muss, um eine Lamelle mit dem Umfang L aus dem Wasser herauszuziehen, berechnet sich aus:

• Über die Gewichtskraft (F = m * g) kann folgende Formel für die Oberflächenspannung formuliert werden:

• Da die Änderung der Oberflächenspannung abhängig von der Lipidkonzentration an der Oberfläche ist, wird ein lateraler Druck an der Grenzfläche aufgebaut:

• Lipide werden im apolaren Lösungsmittel Chloroform gelöst (1 mM Lösung)

• Ein Tropfen Lipid-Lösung wird auf Deckglas gegeben -> Chloroform verdunstet

• Ein Tropfen bidestilliertes Wasser wird daraufgegeben

• Lipidkristalle von DMPC und DPPC werden unter dem Mikroskop angeschaut, bei Raumtemperatur und bei Erhitzung durch einen Fön

• Bilayer-Bildung bei der Schmelztemperatur beobachten

• amphiphilen Lipide interagieren mit dem Wassertropfen und lagerten sich um diesen an (Lipidring)

• Erhitzen des Objektträgers mit dem Fön -> bei DMPC deutliche Vesikel Ausstülpungen (Micellen)

• Micellen sind auch bei dem Erhitzen von DPPC erkennbar, wobei sie deutlich kleiner ausgefallen sind

• 0,5 ml der 1 nM Lipidlösung werden verdampft

• 0,5 ml Wasser je Lipid wird hinzugegeben und die DMPC- , sowie DPPC-Lösung im Vesikulator eine Stunde auf 44 °C erwärmt

• Es werden auf gesäuberte (es bleibt Siliziumdioxid, welches extrem hydrophil ist) und ungesäuberte Deckgläschen entweder Wasser, DMPC oder DPPC pipettiert und beobachtet

• Auf der ungereinigten Oberfläche bildeten beide Lipidsuspensionen Tropfen.

• Auf der stark hydrophilen Oberfläche der gereinigten Deckgläschen breiteten sich beide erst flach aus und liefen dann die noch nicht berührten Ränder der Gläser ab. Nach Ablaufen der Ränder sammelte sich die Flüssigkeit zu einem Tropfen zusammen. Dieses Verhalten nennt man auch “self-excluded random-walk“. Die Lipidsuspension läuft das hydrophile Glas ab und hinterlässt eine Monolayer aus Lipiden, auch Langmuir-Blodgett Schicht genannt, da die hydrophilen Köpfe der Lipide mit der hydrophilen Siliziumdioxidoberfläche interagieren. Die hydrophoben Lipidschwänze zeigen von der Oberfläche weg und machen diese hydrophob. Deshalb werden die bereits abgelaufenen Bereiche nicht nochmals abgelaufen. Stattdessen zieht sich die nun eher hydrophobe Lösung zu einem Tropfen zusammen, um möglichst wenig Interaktionsfläche mit der nun hydrophoben Monolayer an der Oberfläche zu haben.

• DPPC und DMPC zeigten auch auf den gereinigten Gläschen ein ähnliches Verhalten, jedoch brauchte die DPPC-Suspension deutlich länger. Auf Grund der höheren Schmelztemperatur des DPPCs, sind die Lipide bei Raumtemperatur nicht wie DMPC flüssig und beweglich, sondern größtenteils kristallin. Es dauert wesentlich länger, bis sich die Lipide hier umstrukturieren und eine Monolayer bilden.

• 2 ml einer 10 mM Lösung von Myristinsäure in Ethanol hergestellt

• Schale mit Wasser befüllt

• Schiffchen werden auf einer Seite mit Myristinsäure bestrichen und auf das Wasser gesetzt

• Oberflächenspannung von Wasser herabgesetzt

• Boot bewegt sich entgegen der Seite auf die Myristinsäure gestrichen wurde

• Wilhelmi-Filmwaage wird aufgebaut

• Auf eine Waage wird ein Stapel von Korkuntersätze angeordnet. Ein Filterpapier wird mit der Breite 4 cm geschnitten und in der Mitte wird ein Haken durchgestochen, sodass das Filterpapier an einem Spatel aufgehängt werden kann. Dies wird zwischen die beiden oberen zwei Korkuntersätze gesteckt.

• Das Filterpapier wird angefeuchtet und an eine mit Wasser gefüllte Glasschale angenähert. Die Waage wird auf null gesetzt.

• Zunächst wird das Filterpapier in das Wasser eingetaucht und der erste Gewichtswert wird notiert. Dann wird mit einer Glasspritze in Schritten von etwa 5-10 μL DMPC- Chloroformlösung hinzugegeben und nach jedem Schritt das Gewicht an der Waage abgelesen.

• Der Vorgang wird solange wiederholt, bis sich der Gewichtswert nicht mehr ändert.

• Aus der relativen Masseabnahme Δm wurde zunächst die jeweilige Gewichtskraft berechnet -> Oberflächenspannung wird bestimmt

• Oberfläche pro Lipidmolekül wird berechnet:

• Oberflächenspannung und Lipidkonzentration in Diagramm aufgetragen

• bei Zugabe der DMPC-Lösung bleibt die Oberflächenspannung zunächst kurz konstant, dann abnimmt und ab einer gewissen Lipidkonzentration sich die Oberflächenspannung nicht weiter ändert (Oberfläche mit Lipidmolekülen gesättigt, deshalb ändert sich die Oberflächenspannung nicht weiter)

• Oberflächenspannung über die Fläche pro Lipid in einem Diagramm aufgetragen

• Wenn die Oberfläche mit Lipidmolekülen gesättigt ist, ist die Oberfläche pro Molekül am niedrigsten und damit die Oberflächenspannung am geringsten. Mit steigendem Platzbedarf pro Molekül steigt die Oberflächenspannung.