Gene und Gentechnik

• Bakterien haben Kompetenz, freie DNA aufzunehmen

• Trifft Bakterium auf freie DNA in Form eines Plasmidrings, so nimmt es diese auf

• Ständiger Gentransfer

• einseitiger Tausch von einem Spender auf einen Empfänger

• Vorraussetzung: Spenderzelle besitzt F+ und Empfänger F-

• F ist ein Faktor für Ausbildung einer Plasmabrücke (Pili)

• Treffen zwei Faktoren aufeinander, bildet sich Plasmabrücke aus und der Einzelstrang des Spenders wird auf Empfänger übertragen

• Andere Fragmente können mitgerissen werden und auch in Empfänger gelangen

• Aktiver Genaustausch und ständig in Bakterienpopulationen

• ist kein Lactose vorhanden, bindet Repressor an Operator und blockiert Polymerase (Gene können nicht abgelesen werden)

• Bindet Lactose an Operator, verändert sich Struktur des Repressors (Konformationsänderung)

  • Polymerase kann Strukturgene ablesen

• Enzyme werden gebildet, die Lactose abbauen können

• Transkriptioen können Polymerase aktivieren oder hemmen

• spezifische Transkriptionsfaktoren

  • Silencer = Abwächung der Transkription

  • Enhancer = Verstärkung der Transkription

    • Entscheiden über die Intensität der Transkription

• Methylgruppen enzymatisch an Cytosine der DNA angehängt

• Basensequenz bleibt erhalten (keine genetische Mutation, sondern Modifikation)

• durch äußere und innere Einflüsse oder Replikationsfehler

• Mutationen auf codierenden Bereich -> Veränderung der Proteinstruktur oder -funktion

  • Entstehung von Krankheiten

1. stumme Mutation

   • ohne Aminosäurenaustausch

   • Keine Auswirkungen auf entstehendes Protein

2. Missense-Mutation

   • durch Austaisch des ersten, zweiten oder dritten Nucleotids eines Tripletts entsteht neue Aminosäure

   • Neues Protein mit anderer oder keiner Funktion

3. Nonsense-Mutation

   • spezielle Form der Missense-Mutation

   • Durch Ersetzen einer Aminosäure kann Stoppcodon entstehen

   • Funktionsloses Protein

1. Insertion

   • Einfügen einer Base verschiebt Leseraster

   • Komplette Aminosäurensequenz ändert sich

2. Deletion

   • Entfernen einer Base verschiebt Leseraster

   • Komplette Aminosäurensequenz ändert sich

3. Duplikation

   • Verdoppeln einer Base verschiebt Leseraster

   • Komplette Aminosäurensequenz ändert sich

1. Veränderung des Phänotyps: Beispiel Änderung der Hautfarbe

2. Krankheiten: Beispiel schwere Stoffwechselerkrankung

3. Genetische Vielfalt: besser anpassen und überleben

4. Selektion: Angepasstheit an Umwelt -> Überlebensvorteil

5. Gendrift: Verlust der genetischen Vielfalt

Veränderte DNA -> veränderte mRNA -> verändertes Polypeptid -> anderes Strukturprotein -> Stoffwechsel kann nicht katalysiert werden

• schneiden DNA an bestimmten Sequenzen in zwei Teile

• Blunt ends = gerades Schneiden (Vaterschaftstest)

• Sticky ends = schneiden in Treppenmuster (Gentransfer)

• Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts

1. Denaturierung

   • DNA bei 95°C denaturiert

   • Doppelstrategie in Einzelstränge

2. Hybridisierung

   • Einzelstränge auf 55°C abgekühlt

   • Zwei Primer heften sich an Zielsequenz (ermöglichen Anknüpfen der Taq-Polymerase) -> arbeiten gegenläufig

3. Polymerisierung

   • haben Primer gebunden, wird alles auf 72°C erhitzt (beste Temperatur für Taq-Polymerase)

   • Polymerase startet an Primer und bildet Tochterstrang zu Einzelstränge

Vorgang läuft in 20 bis 50 Zyklen ab, damit genügend Kopien vorliegen

• Ziel: DNA-Fragmente auf Grund ihrer Größe bzw. Länge voneinander zu trennen

• Beispiel: Nachweis eines Gens

• Ablauf

  • Restriktionsenzym zerschneidet Enzym (blunt end)

  • Viele DNA Fragmente entstehen mit unterschiedlicher Länge

  • Gelektrophorese, um die Länge herauszufinden

  • DNA wird durch Färben sichtbar gemacht

  • In kleine Taschen eines Agarosegels pepittiert

  • Gel mit DNA in eine Pufferlösung gelegt und an elektrisches Feld angeschlossen

  • DNA ist negativ und wandert sehr langsam zum positiven Pol

  • Man lässt das Gel etwa 30-60min “laufen”

  • DNA Fragmente der gleichen Länge ordnen sich an derselben Stelle an

    • Entstehung eines Bandenmusters

  • Vergleich mit anderen DNA-Stücken bekannter Größe

= identische Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts

• Ablauf

  1. Restriktion

     • spezifische DNA-Abschnitt und Vektor mit Hilfe von Restriktionsenzymen geschnitten

  2. Ligation

     • Fremd-DNA (vom Spender) mit dem Plasmid unter katalytischen Wirkung des Enzyms Ligase verbunden

       • Rekombinierte DNA

       • Sticky ends des Menschen (Spenders) mit sticky ends des Bakteriums verbinden

  3. Transformation

     • Plasmid in Wirtszelle (E. Coli) eingeschleust

     • Zellwand verändert

  4. Selektion und Vervielfältigung

     • Zellen voneinander trennen, bei denen der Gentransfer funktioniert hat von denen, wo es nicht funktioniert hat

     • Bei Erfolg: Wachstum

• Moleküle, die verwendet werden, um Fremd-DNA in Wirtszellen einzuführen und zu replizieren

• Vektoren als Transportmittel für DNA-Fragmente oder Gene

• Gebräuchlichsten Vektoren sind Plasmide

• Plasmide kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die in Bakterien und in einigen eukaryotischen Zellen vorkommen

• können Fremd-DNA aufnehmen und in Bakterien repliziert

• Herstellung von rekombinierten Proteinen, Schaffung transgender Organismen und Entwicklung von Gentherapie-Methoden

• Gene, die an Regulation des Zellwachstums und Zellteilung beteiligt sind

• Wenn diese Gene mutieren oder überexprimiert werden, können sie in Onkogene umgewandelt, die das Zellwachstum und Zellteilung unkontrolliert stimuliert

• Entstehung von Krebs

• Gene, die normalerweise Zellwachstum und Zellteilung regulieren

  • Krebsrisiko reduzieren

• Wenn die Gene mutiert oder inaktiv sind, unkontrolliertes Zellteilung und Vermehrung von Krebszellen