Cell Biology

Ca. 10.000 unterschiedliche Proteine wovon um die 50% cytosolisch vorliegen.

• Nukleus

• Endoplasmatisches Retikulum

• Golgi Apparat

• Lysosomen

• Vesikel

• Cytoplasma

• Plasmamembran

• Mitochondirae

• Haploides Wachstum

• Komplett sequenziert

• Mutationen sind einfach einzubringen oder zu entfernen

• Wachsen sowohl adhärent als auch suspendiert

• Zellkulturen werden oft von Gewebe entnommen, es existieren aber auch immortalisierte Zelllinien -> unterschiedliche Wachstumstypen

• Genetische Manipulation ist komplex und die Werkzeuge dafür sind herausfordernd in der Anwendung

• Lichtmikroskop

• Fluoreszensmikroskop

• Confocal-Mikroskop

• Spinner Disk-Mikroskop

Das Bild ist recht unscharf und es können keine einzelnen Zellkompartimente, Proteine oder Organellen untersucht werden.

1. Licht (normalerweise UV) geht durch den Exciationsfilter auf den dichromatischen Filter

2. Das monochromatisch Licht wird auf die Objektlinse gespiegelt

3. Das remittierte Licht geht durch den dichromatischen Spiegel auf den Ocular/Kamera

Das Bild muss nachbearbeitet werden um Hintergrundhelligkeit abzuschwächen.

1. Excitation of flourophore substance (S0)

2. Electron shift to excited states (S2)

3. Electrons fall back (vibrational) onto the lowest excited state (S1)

4. Then electrons fall back onto the ground state (here S0) and emit light in another wavelength and visuality

Die Confocalmikroskopie umgeht die Problematik der Hintergrundhelligkeit und Verschwommenheit des Bildes:

• Statt der normalen UV-Lichtquelle wird ein Laser genutzt um spezifisches Licht zu emittieren

• Bevor das Licht auf den dichromatischen Spiegel trifft geht es durch ein Punktloch was einen breiteren Lichtkegel zur Folge hat

• Die Laserstrahlen treffen auf verschiedene Flächen des Objekts und beleuchten so spezifisch die einzelnen Bereiche

• Licht welches zu einem verschwommenem Bild führen würde wird zum Schluss erneut durch ein Punktloch entfernt

Nicht das gesamte Untersuchungsobjekt wird während der ganzen Zeit belichtet, das bedeutet dass die Probe kurze Ruhezeiten haben und die Flourophore “ausgeruht” sind und so Verschwommenheit im Bild vorgebeugt werden können.

Quantum Dots:

• schwere Anwendung wegen ihrer Größe

• Zellen “mögen” keine großen externen Bestandteile

Immunolabeling:

• bestehend aus zwei Antikörpern

  1. primärer Antikörper wird auf das Cytoskelet gebunden

  2. sekundärer Antikörper mit fluoreszierenden Eigenschaften wird auf den ersten gebunden

• ermöglicht genaue Markierung

Genetisches Labeling:

• Proteine markieren fluoreszierend das Innen der Zelle

• GFP (green fluorescet protein)

• Proteine können während des Zellzyklus beobachtet werden

Advatage of genetic labelling:

• Easy implementation of antibodies into the cell

Limitation of classic immuno labeling:

• Immobilization of cells

• Kill of cells to get antibody on these cells

Advatage of genetic labelling:

• Living cells can provide insight into the cell metabolism and mechanism

Limitation of genetic labelling:

• Genes can only be tagged, with CRISPR or plasmid -> transfection of cells are in an overexpression state and are difficult to achieve

Das GFP ist ein modifiziertes Protein, welches original ein Dimer war, welches dann verändert wurde -> Entfernung mancher Beta-Faltblattstrukturen.

Dadurch wurde das GFP von einer normalen zu einer delokalisierten Struktur verändert und ergibt ein Chromophor.

Ablauf:

Im Wiltyp des GFP sind drei Aminosäuren richungsweisend für die fluoreszierende Wirkung. Eine davon wurde im industriell genutzten GFP in die Aminosäure Threonin umgeändert. Das führt dazu, dass nur ein Absorptionsmaximum existiert und nicht mehrere (475 nm).

Verschiedene Fluoreszensproteine ergeben unterschiedliche emittierte Farmspektren aus.

SNAP Tags sind Proteine die vom Säugetier-DNA-Reparaturmechanismus kommen. Im Gegensatz zu GFP-Proteinen können SNAP-Labels überall durchgeführt werden und sind bspw. widerstandsfähig gegenüber SDS-Pages und anderen weiterführenden Anwendungen.

Zudem sind die SNAP-Tags ein wenig kleiner als die GFPs.

• AGT-Tag

• Haloalkane tag8

Der Tetracystein-Tag weist eine Arsengruppe auf, die auf die Zellen toxisch wirken kann.

Plasmamebran gebundene Proteine:

• Monomere (small GTPasen)

• Trimere als G-Proteine

Funktionieren als Signalmoleküle

• GEF (guanosin exchange factor) Hilfsproteine: inaktiv -> aktiv

• GAP (GTPase excellerating proteins): aktiv -> inaktiv

Small GTPases all have similar build up of their internal structure, which is used in many different families oft the GTPases:

Die beiden wichtigen Aminosäuren sind Threonin (35) und Glycin (60), welche das Phosphat binden und sich an zwei “Armen” befinden, die, wenn Phosphat gebunden, zueinander gezogen werden. Bei Verlassen der Phosphatgruppe schwingen die beiden Arme auseinander. Diesen Mechanismus nennt man “loaded spring mechanism”.

Das GAP stabilisiert den Intermediate der Bindungsreaktion, sodass die Hydrolysereaktion einfacher ablaufen kann und der Zustand von GTP zum GDP einfacher ablaufen kann.

Normalerweise haben GTPasen eine hohe Affinität zu den Nukleotiden, daher ist die dissoziation sehr langsam und die Signalgeschwindigkeit wäre sehr langsam. Daher benötigen GTPasen Zusatzfaktoren wie GEFs, die diese Signalbildung verschnellern:

1. GEF -> GTPase (hohe Affinität)

2. GTPase -> Nukleotid (gerine Affinität)

3. Nukleotid -> GTPase -> GEF

-> Die Bindung von Phosphat und der loaded spring mechanism.

Proteine/Moleküle besitzen Zielsequenzen an denen die Zelle erkennt in welche Organelle/Richtung eine Substanz transportiert werden soll.

Eine Organelle die durch eine einfache Membran abgeschlossen ist und weder DNA noch andere genetische Information enthält. Daher müssen alle Proteine und Matrixbestandteile in die Organelle transportiert werden.

Die wichtigste Aufgabe der Peroxisomen ist der Fettsäuremetabolismus, an zweiter Stelle folgt die Detoxifizierung der Zellen.

Die Katalase -> H2O2

Die Katalase gilt als Marker-Protein, da es an keiner anderen Stelle in der Zelle vorkommt. Die Reaktion führt zum Wasserstoffperoxid. Für die Reaktion werden jedoch zusätzlich NAD und NADH benötigt -> diese können jedoch nicht durch die Membran gelangen und müssen daher durch intraperoxisomale Reaktino regeneriert werden:

• LDH

• MDH

Die Enzyme werden mittels eines “extended translational readthrough” in das Peroxisom transportiert. Dabei wird das Stop-Codon unterdrückt und in einer erweiterten Translation wirt eine terminale Verlängerung (terminal extension) mit einem PTS-Signal angehängt.

Es gibt zwei Systeme -> PTS1 und PTS2

Zielweisend für Proteine ist die PEX5 Sequenz, die aus Serin + Lysin +Leucin besteht. Der Transport von Proteinen in das Peroxisom erfolgt durch das PTS-System.

1. Die PTS (peroxisomal targetin sequence) wird vopm Pex5 Rezeptor erkannt

2. Pex14 bildet einen “Kanal” für die beladenen Pex5-Rezeptoren

3. Protein wird ins Peroxisom abgegeben -> Targetsequenz bleibt am Protein

4. Pex5 wird erneut aus dem Peroxisom geschleust und zur Erkennung ubiquitiniert

   -> durch Pex-Kaskade 2, 10, 12

Da die Katalase nur in Peroxisomen ist kann diese mit protein Dyes markiert werden.

Peroxisomen können sowohl de novo (neu) als auch aus dem Zellwachstum und der Zellteilung entstehen.

1. Vorläufermembran wird gebildet.

2. Einführen Membranproteine -> PMP70

   • Pex19

   • Pex3

   • Pex16

3. Einführen der Matrixproteine

   • Pex5 -> PTS1

   • Pex7 -> PTS2

   • Pex14

   • …

4. Einführen der Katalase

PTS1 -> Pex5

PTS2 -> Pex7

Mitochondrien origieren von Bakterien und weisen auf:

• doppelte Membran

• enthalte DNA für 13 Proteine

• Maschinerie für oxidative Phosphorylation

• Durch Teilung kommt es zur Vermehrung

Strukturinformation am N-Terminus

Nur ungefaltete Proteine werden transportiert, da Chaperone entscheidend mitwirken Proteine in die mitochondriale Matrix zu schleusen.

Hsc70 Chaperone. Sie befinden sich im Cytosol und halten Proteine im ungefaltete Zustand wofür ATP verbraucht wird. Andere dieser Chaperone sitzen in der Mitochondrialen Matrix und unterstützen den Transport der ungefalteten Proteine.

Die N-Terminale Sequenz wird abgeschnitten und das Protein faltet in seine aktive Form.

Auch unnatürliche Proteine wie DHFR können so transportiert werden.

Dihydrofolatreduktase ist ein Enzym das wichtig für die Bildung von Nukleotiden ist.

Methotraxate ist ein starker Inhibitor, der zu einer Faltung von DHFR führt und so den Transport des Proteins in die Zelle verhindert. Daher konnte bewiesen werden, dass der Transport nur ungefaltet funktioniert.

Ja!

Die Proteine werden über den Weg A in die Zelle eingeführt:

Durch eine Protease werden jedoch die alpha-Helices vom Rest des Proteins gecleaved und anschließend folgt die Faltung im Zwischenraum.

Ein zweiter Weg, der beschreibt wie Proteine im Inter-Membrane-Space landen wird beschrieben durh die Schwefelhaltigen Abschnitte der Cysteingruppen. Dabei formen sich Disulfidbindungen und das Protein faltet sich von selbst.

Der Nukleus besitzt sogenannte nuklear Poren, die ein großer Komplex aus unterschiedlichen Filamenten und Proteinen ist.

• Cytoplasmische Filamente

• Nukleaplasmische Filamente

• Porinproteine die zum Teil membrangebunden sind

• FG-Porins agieren als Filter für die offene Poren.

bis ca. 40 kDa können Moleküle durch die Poren diffundieren. Für größere Substanzen wird ein Carriersystem benötigt:

1. Versehen des Cargos mit NLS (nuclear leading sequence)

2. Komplexbildung des Cargos mit Importins

3. Transport des Komplexes in den Nukleus

4. Austausch unter Ran-GTP-Bindung des Cargos mit GEF-Unterstützung

5. Transport des Komplexes von Ran-GTP und Importins aus dem Nukleus

6. Hydrolyse durch GAPs des GTp zu GDP und auseinanderfallen des Komplexes

Ran-GTP ist kleiner als 40 kDa und diffundiert daher problemlos durch die nuklear Poren in den Nukleus zurück.

Das ER ist auf der Nukleusmembran lokalisiert und besteht aus zwei Haupteilen:

• raues ER (Ribosomen)

• glattes ER (Fettsäuresynthese und Synthese von Phospholipiden)

In der ER-Membran translokalisiert werden ER-Proteine während der Translation transportiert.

Targeting-Sequenz:

XXX- stellen drei Aminosäuren dar, die positiv geladen sind und sich am N-Terminus befinden.

Nein, nur Proteine die noch in der Tranlation sind werden in Vesikel beladen.

Wichtig sind die Microsome!

1. Translatierende Ribosomen am mRNA-Strang mit Signalsequenz

2. Bindung des SRP und Transport des Komplexes an die ER-Membran (SRP-Rezeptor)

3. Unter Phosphathydrolyse (GTP -> GDP) bidnet das Ribosomen ans Translocon

4. Protein translatiert weiter und die Signalsequenz wird abgecleaved

5. Protein faltet sich im ER Lumen

6. Ribosomen und mRNA lösen sich vom Translocon und der Membran

Der/Das Translocon ist im ungebundenen Zustand ein geschlossener Tunnel, der sich bei Bindung mit dem Ribosom/mRNA/SRP-Komplex öffnet indem er sich konformativ verändert.

Dabei wird ein Plug entfernt, der zuvor vor der Öffnung des Translocons lokalisiert ist.

Es gibt 5 verschiedene Typen der Membranassoziation die auf einem ähnlichem Weg basieren. Dadurch können Proteine unterschiedliche Wirkungsweisen in der Membran ausüben. Als zentraler Punkt gilt jedoch ein alpha-Helix-Anker der das Protein in der Membran befestigt.

1. Wie normal bindet das Ribosom mit dem mRNA-Strand ung SRP am Translocon, welches sich öffnet.

2. Die Signalsequenz wird gecleaved.

3. Im Peptidstrang bildet sich ein Stopp des Transfers und eine Ankersequenz folgt, die die alpha-Helix ausbildet

4. Translocon schließt sich

5. Ribosom bildet Protein zu Ende

6. Ribosom verlässt Membran

Der Vorgäng äuft gänzlich anders ab:

1. Protein wird gebildet und vom Get3 Rezeptor unter ATP-Bindung gebunden

2. Komplexbildung von Get3 mit Get 1 und 2

3. Akerbildung des C-Terminus in der Membran unter Phosphatverbrauch

4. Get-Komplex löst Protein und Get3 löst sich von den Membranproteinen

Wichtig ist die bestimmte Sequenz -> Caxx die auf drei Aminosäuren vor dem C-Terminus basiert:

• Cystein

• aliphatische Aminosäure (bspw. Valin)

• andere Aminosäure

Drei Enzyme sind an der Einbindung und Veränderung des Ankers beteiligt:

• Transferase

• Peptidase

• Transferase

1. Transferase addiert Farnesylpyrophosphat

2. Peptidase cleaved hinterm Cystein die AAX-Bestandteile

3. Methyl wird ans Ende des Cysteins transferiert.

Was auf der Außenseite des ERs ist wird im Innern der Plasmamebran enden.

Peroxisomen besitzen nur eine Membran, Mitochondrien haben zwei Membranen, daher verkompliziert sich der Prozess bei den Mitochondrien ein wenig

Peroxisomen:

Der Mechanismus basiert auf den PTS1 und PTS2 Systemen bei denen der Pex5/7 Rezeptor am Pex14 Protein in der Membran bindet und die Proteine abgibt, die Targeting Sequenz bleibt dabei am Protein zurück.

Mitochondrien:

Proteine müssen ungefaltet sein und werden durch Chaperone Hsc70 dabei unterstützt. Im Innern wird die Target-Sequenz gecleaved. Die Importwege ändern sich, wenn das Protein im Inner Membrane Space bleiben soll.

Chaperone

PelB

• Bildung von Disulfidbrücken

• Glycolysation

• Faltung und Assembly von Multisubunits

• spezifische Proteolytische Spaltung

Das Protein PPI modifiziert die Rotation von Prolin-Peptidbindungen in Proteinen. Diese Bindungen unterscheiden sich von Bindungen andere Aminosäurem, da hier statt einer 180° Freiheit nur 60° Freiheit in der Drehung vorhanden ist.

-> Faltung von Proteinen wird so mehr variabel

Die PDi ist die Protein-disulfid-isomerase und ist nur im ER-Lumen vorzufinden. Das Enzym unterstützt die Bildung von Disulfidbrücken. Diese Disulfidbrücken werden dann spezifisch nur von Eukaryoten ausgebildet.

Die PDi kann auch fehlgebildete Disulfidbrücken reparieren.

Der Organismus besitzt kein ER und auch keine Protein-disulfid-isomerase.

Die wichtigste Funktion einer Glycosylation ist die Stabilisierung und Sicherung der Faltung. Außerdem sind glycosylierte Proteine in therapeutischer Anwendung oft akzeptabler.

• N-linked Oligosaccharide zum Nh2 der AS Asparagin

• O-linked Oligosaccharide zum OH der AS Serin

Bei nur einem Zuckermolekül liegt eine höhere Instabilität vor, daher werden mehrere Zucker einzeln hinzugefügt.

1. zwei Phosphatbausteine werden von UDP -> UMP auf das Dolichol geladen.

2. Für jeden Zucker wird Phosphat verbraucht GTP -> GDP

3. aus unbekannten Gründen flippt die Reaktion nach ein paar Schritten ins Innere des ER Lumen

Das Dolichol-Phosphat stellt die Basis als erstes Phosphat vor der Glycosylation dar.

Die Glycosylationssequenz wird auf ein frisches Protein geladen:

Chaperone halten die Aggregation:

• Calnexin als ER-Membranprotein

• Calreticulin

Drei aufeinander folgende Glucose Zucker.

Zwei der drei Moleküle werden hydrolysiert, während das letzte am Calnexin gebunden wird. Nachdem die Thiol-Oxidoreduktase die Faltung katalysiert hat wird der letzte Zucker ebenfall entfernt.

Der Sekretionsweg erfüllt die Aufgabe der zellinternen Müllabfuhr. Dies kann sowohl ziellos als auch zielgerichtet durchgeführt werden.

Ziellos -> Wichtig für Nährstoff-Recycling

Zielgerichtet -> reine Müllentsorgung ohne Nährstoffrückgewinnung

Der unfolded protein response beantwortet hohe Konzentrationen an ungefalteten Proteinen. Es gibt drei Wege wie Zellen diese Problemstellung lösen:

• IRE1

• PERK

• ATF6

Unspezifische Degradation bei einem pH-Wert von 5.0 durch aktive Hydrolasen:

• Nukleasen

• Proteasen

• Glycosidasen

• Lipasen

• Phosphatasen

ATP-basierte Protonenpumpen.

• Phagocytose

• Endocytose

• Autophagose

Die Membranen des Mitochondriums bekommt Lecks.

1. Initiation -> Formierung des pre-Autophagosoms (Phagophore) aus dem ER mit ER-Membranen

2. Nukleation und Elongation der Autophagophore -> PIP1 zu PIP2

3. Schließen und Formieren des Autophagosoms

4. Fusion mit Lysozymen mit SNAREs und RAB7

Das Proteasom ist aus verschiedenen Untereinheiten aufgebaut:

• Ubiquitinrezeptoren

• ATPase

• 2xCap-Protein

• Core-Protein

Ubiquitin ist nur dann ein Marker für das Waste-Management, wenn es mit dem Lysin48 verbunden ist. Es müssen mehrere Ubiquitinbausteine aufeinander folgen, wenn es als Erkennungssequenz dienen soll.

Der Rezeptor bindet das Ubiquitin welches dann von der DUB Enzymkaskade abgebaut wird:

1. E1 activation of ubiquitin via ATP -> AMP uptake

2. E2 conjugation of ubiquitin and transfer of ubiquitin onto the ubiquitin-ligase (E3)

3. Ring E3 or HECT E3 process the ubiquitylation to a chain.

4. Recognition and deubiquitylation (recycle of ubiquitin)

5. Unfolding of the degrading protein and further proteasomal activities

Deubiquitinase

• Spezifität ist einfacher zu kontrollieren

• Die Hierarchie und Organisation der Enzymkaskade ermöglicht eine breite Palette an zu degradierenden Substraten

Es gibt nur ein E1 Enzym, welches die Aktivierung der Ubiquitinbausteine katalysiert. Mit jedem weiteren Schritt werden mehr Enzyme bereitgestellt und spezifischer. Das Enzym E3 liegt in vielen unterschiedlichen Formen vor um die unterschiedlichsten Proteine zu markieren.

-> Proteine können regulatorische Wirkungen haben wie Cyclins oder andere Signalproteine, wenn der Signalprozess abgeschlossen ist müssen diese Proteine auch ohne Fehlfaltung degradiert werden.

-> Wachstumshormone etc.

Die katalytische Fähigkeit des Proteasoms ist ähnlich der katalytischen Triade, jedoch wird hier ein Threonin statt dem Serin genutzt.

1. Wassermolekül greift nucleophil die Thr-OH-Gruppe an -> Threonin wird nucleiert und greift die Peptidbindung an

2. Tetrahedraler Zwischenzustand

3. Wasser greift erneut den Zwischenzustand an und N-Terminus verlässt Peptid

4. Auftrennung des C-Terminus

• N-end-Regel

• Ammphiphatische oder hydrophobische Peptide

• Phosphorylierte Signale

• Destruktionsbox

• KEN-Box

Der N-Terminus besitzt eine Halbzeit. Normalerweise liegt am N-Terminus das Methionin, welches zu einem stabilen Protein führt. Wenn dies jedoch durch mögliche Prozesse verändert wurde verringert sich die Halblebenszeit des Proteins.

Unterschiedliche, dann terminale, Aminosäuren haben dann unterschiedlich lange Lebenszeiten.

Durch ein lineares Fusions-Protein, bei dem Methionin mit DHFR verlängert wurde und mit Ubiquitin ein beta-Gal-Protein angehängt wurde.

Durch Cleaving des beta-Gal im Prozess entfernt was dann mikrobiologisch nachgewiesen werden kann.

Andere Aminosäuren wären ein Ziel für die X-Sequenz (lysin) der Ubiquitinilierung.

Es gibt drei Wege auf denen das Signal aktiviert werden kann:

1. Phosphorylation durch ATP-Verbrauch

2. Demaskierung durch Proteindissoziatino

3. Durch Wasseraddition fällt natürlicher N-Terminus weg

1. Diversität

   Unterschiedliche Prozesse können Proteine unterschiedlich transportieren. Diese Unterscheidung hilft zu entscheiden woher und wohin Substanzen gebracht werden sollen.

2. Kontrolle

   Durch die Aufbewahrung von Vesikeln können Transportwege aufgehalten, umgekehrt und abgebrochen werden.

3. Unterscheidung zwischen Plasmamembranen

   Durch die Internalisierung der Membranproteine kann die Plasmamembran besser organisiert werden.

Zuerst beginnt der Prozess mit der Aktivierung durch small GTPasen:

1. Cargoprotein binden an einen Rezeptor

2. Formen des Vesikels mit Coat-Proteinen

3. Fusion des Vesikels mit der Zielmembran und Entfernung der Coatproteine

4. Öffnen der Vesikel mit der Zielmembran -> SNARE-Proteine

   • T-SNARES (an target Membran)

   • V-SNARES (an Vesikel)

SNAP receptor protein

• Syntaxin

• SNAP25

soluble NSF attachment protein

N-maleimide sensitive fusions proteine

• COP I

• COP II

• Clathrin

1. GTPase rekrutiert Sar1 und hydrolysiert

2. GTPase verankert N-Terminus in Membran

3. Coatproteine lagern sich um die GTPasen

4. Cargoproteine wandern in das sich formende Vesikel

5. GTP-Hydrolyse mit Sar1 führt zur Entfernung der Coat-Proteine

6. Recycling der GTPasen und Coat-Proteine

Für das Andocken der Vesikel mit den Zielmembranen ist das Rab-Protein wichtig, da es als Rezeptor dient und am Rap-Rezeptor bindet.

Die weiteren Schritte werden vom SNARE-Komplex durchgeführt.

Durch den SNARE-Komplex:

Ein Kompelx aus NSF- und SNAP-Proteinen dreht unter ATP-Verbrauch den Cis-SNARE-Komplex wieder auseinander.

• ATP-Komplex -> split washer (Schlitzscheibe)

• ADP-Komplex -> open flat washer (Unterlegschreibe)

Im Golgi erfolgt der Transport etwas anders. Mit anderen Vesikeln bilden COPII-Vesikel einen Cluster, welcher Teil des Golgi wird und in die Organelle integriert wird.

KDEL-Sequenz

KDEL ist ein Protein, welches spezifisch für das ER ist, wenn es im Golgi falsch transportiert wurde.

Für den Transport vom Golgi zurück zum ER.

Die unterschiedlichen Gruppen des Goldi sind nicht zusammen verknüpft:

• Cis-Cisterne (Richtung ER)

• Mediate-Cisterne

• Trans-Cisterne (Richtung Cytosol)

Mittels GFP tracking der verschiedenen Proteine:

• Vrg4 ist vorrangig in den ersten Schritten/Bereichen des Golgi zu finden

• Sec7 existiert eher in den hinteren Bereichen

-> Fluoreszensmikroskopie

Clathring ist ein spezielles Coat-Protein, welches die Form einer Triskele aufweist.

1. Aktivierung der Clathrin-Proteine mit GTP

2. Clathrin-Proteine bilden ein verwobenes Muster

3. Auxilian-Proteine binden am Clathrin

4. Cargo wird eingebracht

5. Abschnüren des Clathring-Käfigs mit Dynamin unter GTP-Verbrauch

6. Der Käfig wird mit Unterstützung von Chaperons (Hsc70) abgestoßen

• Abschnüren

• Abschneiden

Der neueste Stand der Forschung zeigt ein abschneiden (Scheeren) des Clathrin-Käfigs von der “Muttermembran”.

Clathrin stellt die Basis für die Vesikel dar:

Eine Mutation die dominant, also aktiv wirksam ist und die normale Aktivität negiert.

Lipoproteine sind ein komplexer Aufbau der den Transport von hydrophobischen Substanzen in einer wässrigen Umgebung ermöglicht.

Aufbau von Innen nach Außen:

1. Cholesteryl ester

2. Phospholipide

3. Unverestertes Cholesterol

4. Apolipoprotein B-100

• VLDL

• IDL

• LDL -> von der Leber (cholesterol und triacylglycerole)

• HDL -> von der Leber (cholesterol)

Hohe LDL führt zu einer Akkumulation von LDL im Blut, was normalerweise an das Gewebe weitertransportiert werden würde. Wenn es oxidiert akkumuliert es sich jedoch dauerhaft, was zu einer Entzündung führt.

1. Foam Zellen werden gebildet und akkumulieren

2. fibrotische Plaques formen sich

3. Komplex aus Plaques, Muskelzellen form Thrombose

Aus Filamenten und Motorproteinen:

• Microtubuli

• Actinfilamente

• Zwischenfilamente

• Septins

Septins wurden durch fluoreszens entdeckt und sind ein wichtiger Mitspieler im Budding und der Zellteilung.

Septins sind aus immer wiederkehrenden Bausteinen aufgebaut, aber kein Dimer oder Monomer. Vielmehr sind es unterschiedliche Bausteine:

Septins sind Hexamere die in Oktamere konvertiert werden. Zwei besondere Regionen können beschrieben werden:

• GTP-Bindedomain

• G-Domain, welche von N- und C-Termini umrahmt wird.

Formt ein unpolares Filament.

Aktin und Mikrotubuli haben die gemeinsame Eigenschaft, dass sie ein Transportmittel für Organellen und Vesikel durch Motorproteine ​​sind -> Septine hingegen sind unpolar und daher hat ein Motor keine Laufrichtung.

Sie verändern sich im Laufe des Zellzyklus.

Es gibt in Säugetieren verschiedene geordnete Strukturen die mehr Flexibilität haben.

Das SEPT2

Das Actinfilament ist aus einem Monomer aufgebaut, welches in Akkumulation ein filamentöses Polymer bildet:

Das eine Ende ist das (-)-Ende. Das andere ist das (+)-Ende, an dem sich der Strang verlängert. Eigentlich verlängert es sich an beiden Enden, doch am (-)-Pol dissoziiert es schneller als dass es assoziiert.

Das Monomer (G-actin) wird mit ATP beladen.

Die Aktinfilamente dissoziieren in einer bestimmten Geschwindigkeit (Ein- oder Aus-Rate). Es zeigt sich, dass das (+)-Ende eine viel geringere Dissoziationsrate aufweist als das (-)-Ende. Daher wächst das (-)-Ende viel langsamer und schwächer als das gegenüberliegende Ende.

Profilin (Aufbau) und Cofilin (Abbau)

Profilin bindet an ATP-Aktin und erhält einen ATP-Aktin-Pool für das Wachstum eines Aktinfilaments aufrecht. Dies unterstützt eine weitere Bewegung von ATP-Aktin zum (+)-Ende, wo das Profilin dann das ATP-Aktin verlässt.

Das Cofilin ist ein Gegenprotein, das das Schrumpfen des (-)-Endes beschleunigt. Cofilin kann viele Untereinheiten auf einmal annehmen, sodass der Schrumpfungsprozess sehr schnell abläuft.

-> Formin

besteht aus zwei Armen, die jeweils aus verschiedenen Untereinheiten bestehen.

• FH2 katalysiert im aktiven Zustand den Filamentaufbau

• DAD und DID Regionen

• RhoGTPase Region

• FH1 interagiert mit dem profilin während des Aufbaus

Formin ist aktiv, wenn die DID- und DAD-Regionen von einander getrennt vorliegen, dann liegt die FH2-Domain frei und kann katalytisch wirken. Dieser Schritt wird vom Rho-Faktor induziert.

• Inhibierung der Hydrolyse von GTP

• Mimierung des GTP-gebundenen Zustandes

• Dominant negative Mutation die das GDP “freezed” würde eine dauerhafte Inaktivität zur Folge haben

1. Keine Mutation -> Kontrolle

2. Dominant aktives Rho -> Überproduktion der Actinfilamente im Zellinnern

3. Dominant aktives Rac -> Überproduktion der Actinfilamente an der Zellmembran

4. Dominant actives Cdc42 -> Überproduktion der Actinfilamente als Spikes nach Außen

Die drei membrangebundenen GTPasen erkennen Signalmoleküle wie Wachstumsfaktoren und katalysieren eine Zellantwort, was in der Ausbildung von Actinfilamenten resultiert.

Rac -> Ausbildung von Actinfilamenten an der Zellmembran

Rho -> Ausbildung von Actinfilamenten im Zellinnern

Cdc42 -> Ausbildung von Actinfilamenten in Spykeform

Arp2/3:

Der Arp2/3-Komplex bindet nach Aktivierung durch eine Rho-GTPase mit einer Aktin-Untereinheit und dem NPF am vorhandenen Aktin-Strang mit dem (-)-Ende und verlängert sich am (+)-Ende.

• Fimbrin

• Actinin

• Spectrin

• Filamin

• Dystrophin

Myosin ist ein Motorprotein für Actin und besteht aus drei Teilen:

• Kopf

• Nacken

• Schwanz

Es gibt verschiedene Arten des Myosins, für den Transport von Cargovesikeln entlang der Actin Filamente ist jedoch ein Myosinprotein mit zwei “Beinen” notwendig.

Andere Myosin-Transporter verschieben entweder Actinfilamente gegeneinander oder bewegen sich entlang der Zellmembran was für Membranassoziation notwendig ist.

Die Bindung von ATP dient der Lösung des Myosins aus den Aktinfilamenten und dem Aufbau elastischer Energie. Dann bindet Myosin an Aktin und verliert das Phosphat von ATP -> ADP, was zur Bewegung führt.

Immer von (+) zu (-)!

• Head over Head

• Inchworm (Rauben) -movement

Microtubuli sind neben Actin und Septins ein weiteres Filament innnerhalb der Zelle und spielen eine besondere Rolle im Zellzyklus und Strukturgebung der Zelle.

• Nukleusstabilität

• Zellwachstum

• Transport über weite Distanzen

Aufgebaut aus zwei Untereinheiten:

alpha und beta, die abwechseln aneinandergereite Ketten ergeben. Mehrere Ketten lagern sich dann zu Röhren zusammen.

• alpha Tubulin -> GTP

• beta Tubulin -> GDP

Prototubuli

Mittels Fluoreszensmikroskopie, Immunostaining funktioniert nicht, da die Zellen dann sterben.

Mikrotubuli sind dynamisch. Sie wachsen wie Aktinfilamente am (+)-Ende. Sie werden instabil, wenn nicht genügend ATP-gebundene Tubuli vorhanden sind. Diese Destabilisierung kann durch die Bindung sogenannter „endbindender“ Proteine ​​(EBs) verhindert werden, die die spezifische (+)-Endstruktur erkennen. Das katastropheninstabile Ende des BIP kann durch GTP-Röhren „aufgerüstet“ und vor der Katastrophenabzocke gerettet werden.

Kinesin

Like Myosin, Kinesin transports in direction of the (+)-end. Kinesin and Myosin cooperate together, also there are again different kind of Kinesins, which fulfill the movement:

• Kinesins 1 and 2 are used for organelle transport.

• Kinesin 5 is used for the intermovement of two different microtubules.

• Kinesin 13 is used for end assembly of the microtubules, which has a catastrophic effect on the microtubules.

Dynamine, die sich von (+) nach (-) bewegen und daher etwas Besonderes sind. Dyneine sind sehr groß und bestehen aus mehreren Untereinheiten.