Fragenbeispiele

A: Absorption = Verlauf der Wirkstoffaufnahme in den Blutstrom

D: Distribution = Verteilung des Wirkstoffs im Körper (Gewebe, Flüssigkeit)

M: Metabolism = Umwandlung des WS in Metaboliet (Biotransformation)

E: Excretion, Elimination = Ausscheidung Wirkstoffs & Metabolite

ADME Proben: Absorption- im Blut messen; Eliminierung- im Urin messen; Distribution- Verteilung in Gewebe messen; Metabolismus- in Leber messen => Metabolite in Blut, Urin

Pharmaanalytik Beispiele : Gehaltsbestimmung Wirkstoff (QC, Freigabeanalytik), Verteilungsanalyse Wirkstoff (z.B. in Tabletten), Identifizierung neuer Biomarker (Forschung –bessere Diagnostik / Targetmoleküle für die Wirkstoffentwicklung

grün: Intravenöse (IV) Gabe des Wirkstoffs. Maximale Konzentration bei t=0 reduziert sich durch Eliminierung.

Rot: Absorption bei oraler Gabe. Langsame Zunahme der Wirkstoffkonzentration im Blut bis Plateau erreicht wird. Danach erfolgt Eliminierung mit der selben Kinetik wie bei iv Gabe des Wirkstoffs

Die Kombination aus Absorptions-und Eliminierungskurve ergibt den Plasmaspiegel des Wirkstoffs im Patienten (blaue oder schwarze Kurve Therapeutisches Fenster : untere blaue Kurve = schneller Metabolisierer bzw. Eliminierer evtl auch langsame Aufnahme –

Wirkstoffkonzentration erreicht nicht die erforderliche therapeutische Konzentration => keine Wirkung // obere schwarze Kurve : schnelle Aufnahme ggf. langsame Eliminierung.

Wirkstoffkonzentration übersteigt kurzzeitig die therapeutisch erforderliche Konzentration => erhöhtes Risiko für Nebenwirkungen

Mögliche häufig verwendete Analysen Methoden Bsp: HPLC-MS, GC-MS

Ein Biomarker ist ein objektiv messbarer Parameter für den durch umfassende Untersuchungen an vielen Proben statistisch gesichert nachgewiesen werden konnte, dass er ein Indikator für

- einen normalen biologischen Prozess

- einen krankhaften (pathogenen) Prozess

- eine pharmakologische Wirkung

- eine therapeutische Intervention ist

Biomarker : Objektiv( i.d.R. quantitativ messbar / statistisch abgesicherter spezifischer Indikator für einen bestimmten Krankheitszustand / Körperzustand (Zustand). Dadurch Indikator für Therapeutische Wirkung (pharmakologisch, etc.) (Änderung Zustand)

Spurenanalytik mit Kombinationsverfahren: Analyte sind nur in Spuren in der Matrix enthalten. Die Nachweisempfindlichkeit der Analysenmethode reicht dann häufig nicht aus, um den Analyten zu detektieren bzw. zu quantifizieren. Die Matrix stört die Methode. Deshalb sind Anreicherung des Analyten & Abtrennung der Matrix erforderlich = verbessertes Signal zu Rauschen

Direktverfahren : Vorteil Erfordert keine Probenvorbereitung, ist oft zerstörungsfrei Verbundverfahren: Ermöglicht Auftrennung der Probenkomponenten & Anreicherung der Analyte=> Reduktion der Komplexität für Detektor, Erhöhung der Analytmenge für Detektion => Besseres Signal zu Rauschen Verhältnis, reduziert/eliminiert Störungen durch Matrix. Erfordert Kombination verschiedener Methoden (Trennung, Detektion,.

Korrekte Beschriftung möglich.

Die EU guidelinefordert : definiertes Gefäß (OK) mit Angaben zu eindeutiger Probenbezeichnung (Name) / Inhalt (specimen) / Batch Nr. (No) / Datum Beprobung (Date) / Zusätzlich hier DOB = Date ofBusiness, für Datum, an dem Analysenprobe entnommen wurde

Nein! Gerade bei Feststoffen ist es eine Herausforderung eine repräsentative Probe zu nehmen. Oben und unten kann das Pulver unterschiedlich aussehen. Es braucht mehrere Stichproben. Die Methode muss genau beschrieben sein. Dabei muss die Zahl der Stichproben anhand belegbarer Kriterien definiert werden. Es muss gezeigt werden, dass durch diese Beprobung eine repräsentative Probe gewonnen werden kann.

Ausgangsmaterial => 1. Probennahme n x repäsentative Stichproben => 2. Probenvorbereitung einer homogenen Laborprobe aus den Stichproben => 3. Herstellung Analysen-& Rückstellproben (Aliquots der Laborprobe => Analyse)

Die Nitratverteilung im Wasser ist homogen bzgl. der Wassertiefe. Eine Beprobung aus unterschiedlicher Tiefe ist deshalb nicht zwingend erforderlich (.. Könnte aber sinnvoll sein ;-)) . Beim Sediment verändert sich der Nitratgehalt in Abhängigkeit von der Tiefe => Es müssen Stichproben über das Tiefenprofil entnommen werden.

Die Abbildung zeigt, dass die Nitratkonzentration im Sediment eines Sees in den oberen 3 mm um zwei Größenordnungen abnimmt. Wenn man Nitrat im Sediment bestimmen will, ist es ein Riesenunterschied, ob ein Sedimentbohrkern von 1 m Dicke verwendet wird oder ob nur die obersten 2 mm des Sediments abgeschöpft wurden.

Die Probennahme ist der Arbeitsschritt zur Gewinnung einer repräsentativen Probe für die Analyse.

qualitativ: Was ist in der Probe, welches Molekül, welche Struktur, aus was besteht die Probe?quantitativ: Wieviel einer bestimmten Substanz enthält meine Probe ?

Hauptgruppen chemische Analytik : Nasschemische (Gravimetrie, Titrimetrie) & Instrumentelle Methoden (Optische Methoden, Trennmethoden, Elektrochemische Methoden)

Wirkstoffgehalt vielleicht gleich / vielleicht unterschiedlich.

Ohne Angabe zu CV, Standdardabweichung= Fehlerbalken ist eine Aussage darüber

1. Berechnen Massenkonzentration: c(Ca2+) = n /V= n*MG/V = 15 mmol/l * 40,078 mg/mmol = 601,17 mg/l = 601,17 mg/l*g/1000 mg = 0,601 g/l (geltende Ziffern 3 => 150 mM)

2. Berechnen des Gehalts : c(Ca2+) = m(Ca2+) / m(H2O) = m(Ca2+) / V*ρ(H2O) = 0,601 g/ (1l * 1 kg/l) = 0,601 g/kg = 601 mg/kg = 601 µg/g = 601 ppm

Es handelt sich um Gehaltsangaben ohne Einheit Vergleichbar mit %, Promille, .. …

partsper million(10-6) / partsper billion(10-9) / partsper trillion(10-12) /partsper quatrillion(10-15)

Molare Mengen: µmol= 10-6mol(mikro) / fmol= 10-15mol(femto) / amol=10-18mol(atto) / pmol=10-12mol(pico) , zmol= 10-21mol(zepto)

Analyt : Das Molekül, das mich interessiert (über den eine analytische Aussage gemacht werden soll)

Matrix: Bestandteile einer Probe, die nicht Analyt sind, für die ich mich also auch nicht interessiere, die aber den Nachweis der Probe ermöglichen

Repräsentative Proben bei Feststoffen: Inhomogene Verteilung kann nicht durch einfache Mischverfahren homogenisiert werden => viele Stichproben müssen an verschiedenen Stellen entnommen, gemahlen, gemischt, aufgeteilt und verjüngt werden, bis eine repräsentative Laborprobe zur Verfügung steht => die Analysenprobe.

Bei Gasen & Flüssigkeiten muss nichts gemahlen und aufgeschlossen werden und das Mischen ist einfacher erreichbar. => eine repräsentative Probe des Gesamtobjektes ist bei Gasen und Flüssigkeiten mit weniger Aufwand zu gewinnen.

Prinzipielle Probentypen aus Mensch und Tier: Körperflüssigkeiten (Blut, CSF) / Gewebe (Tumor, Organ, ), Ausscheidungen (Urin, Kot, Schweiss, )

Prinzipielle Probentypen aus Mensch und Tier:

1. Körperflüssigkeiten (Blut, CSF) - Blut trägt Informationen aus dem gesamten Körper, Gewinnung ist klinische Routine/

2. Gewebe (Tumor, Organ, ) - hohe Konzentration an relevanten Biomarkern , Gewinnung aufwändiger

3. Ausscheidungen (Urin, Kot, Schweiss, ) = sehr einfache Gewinnung, nur teilweise repräsentativ als Biomarker, da Analyte durch Leber / Niere oder Bakterien im Darm metabolisiert werden

Analysenverfahren A

Analysenprinzip C

Analysenmethode B

Goldene Regeln der hohen Nachweisempfindlichkeit:

OPTION 1. Nutze analytspezifische Detektoren z.B. hochspezifische Antikörper + amplifizierende Detektionssysteme wie Fluoreszenz oder Enzym-Substrat Reaktionen in Immunoassays

OPTION 2. Wenn keine spezifischen Fängermoleküle vorhanden sind, trenne die Matrix von den Analyten ab und reichere die Analyte

Über das Signal zu Rauschen Verhältnis wird die Nachweisempfindlichkeit definiert.

Nur wenn das spezifische Analyt-Signal statistisch signifikant vom unspezifischen Signalrauschen unterschieden werden kann, ist eine statistisch abgesicherte Detektion eines Analyten möglich.

GMP Good Manufacturing Practice: Pharma- und Medizinproduktehersteller – Labore in der Produktions- und Freigabeanalytik /

GLP Good Laboratory Practice: Analysen- und Prüflabore im Bereich Pharma, Lebensmittel, Materialprüfung, ….

GCP: Good Clinical Practice: Ärzte, Pharma bei klinischen Studien, Kliniken – QC für klinische Studien an Menschen incl. ethischer, datenschutzrechtlicher Themen

cGMP: current GMP: In USA wird USP und GMP Regelwerk jährlich im Code of Federal Regulations (CFR = US Gesetzbuch) geregelt Wichtige GMP Artikel

Retrospektiv: Auf Basis von bereits existierenden Messdaten => historisch – heute nicht mehr GXP konform.

Prospektiv: Bei Etablierung eines neuen Verfahrens. Start mit Definition eines Validierungsplans & erwarteten statistische Grenzen für Qualitätskenngrößen (WICHTIG –VORHER FESTLEGEN!!)

Revalidierung: bei Change Control Ereignissen für bestehende Methode erforderlich. Start mit Definition Validierungsplan & erwartete statistische Grenzen für Qualitätskenngrößen (Die sind in der Regel auf bisherigen Messungen bekannt – IN JEDEM FALL den Plan vor Start der Validierung festlegen.) Bei der Revalidierung müssen nicht alle Parameter revalidiert werden. Es reicht die für die Change Control Änderungen relevanten Parameter zu validieren.

egriffe Einteilung Analytik: nasschemische Methoden / instrumentelle Methoden // Gravimetrie, Volumetrie, Optische Methoden, Trennmethoden, elektrochemische Methoden, Sonstige Methoden

Qualifizierung: Überwachung der Laborausrüstung mit Testanalysen über die gesamte Nutzungsdauer.

Prozesse und Parameter müssen von Betreiber des Labors festgelegt und regelmäßig, mind-1x jährlich überprüft werden.

Typen:

DQ: Design Qualification(Hersteller, Nutzer prüft),

IQ: Installation Qualification Delegation an Gerätehersteller möglich. Parameter idR von Hersteller festgelegt.

OQ: Operational Qualification–Test der grundsätzlichen, generellen Eignung des Gerätes, durch Nutzer oder Delegation an Hersteller,

PQ: Performance / Processing Qualification–Spezifisch für Kundenanwendung, (durch Nutzer). In der Regel durch Qualitätskontrollstandards die für das jeweilige Analysenverfahren spezifisch definiert werden.

Validierung: Prüfung eines Verfaherns–oder einer Methode auf Eignung für den vorgesehenen Zweck.

Retrospektiv: war früher möglich, heute nicht mehr erlaubt !!l , basierend auf bereits vorliegenden Analysendaten

Prospektiv: Validierungsplan –Analysen –Auswertung = muss komplett neu gemacht werden

Revalidierung= im laufenden Betrieb, z.B. nach Change Control Ereignissen erforderlich. Kann auf relevante Parameter beschränkt werden, muss aber ebenfalls komplett neu gemacht werden.

Unter GXP gibt es eine Hierarchie der Dokumente, an denen man sich orientieren sollte. Hierarchie nach Wichtigkeit:

1. das relevante Arzneibuch Pharm. Eur. (ist in Deutschland Gesetz! ) – falls nicht verfügbar bzw. nicht ausreichend –

2. ICH Guideline, EMA Guideline, FDA Guideline (Zulassungsbehörden geben die Regeln vor, die bei Audit gefordert werden) –

3. Normen DIN, EURACHEM (von Fachleuten festgelegt, nicht zwingend an Pharma orientiert – aber immerhin QC orientiert und unter vielen Fachleuten abgestimmt) –

4. Fachpublikation Peer Review (Fachleute, begutachtet durch 2-3 Fachgutachter = Qualität sichergestellt – aber eben nur2-3 Personen mit evtl. zu wenig Zeit = nicht das gesamte Spektrum an Expertise im Arbeitsgebiet) -

5. Webinar etc, Publikationen ohne Peer Review –als Ideengeber nutzbar

Der Validierungsumfang ist für eine Gehaltsbestimmung ausreichend. Da der Arbeitsbereich durch die Vorgabe des Wirkstoffgehaltes in der Tablette sehr eng begrenzt ist, werden Konzentrationen im Bereich des LLOQ und des ULOQ nie erreicht bzw. liegen weit außerhalb des Arbeitsbereiches und zeigen deshalb sowieso eine schlechte Charge an. Eine Validierung des LLOQ ist deshalb nicht erforderlich. Auf die Bestimmung der Spezifität kann in der Validierung nie verzichtet werden. Das Argument des Chefs ist möglicherweise korrekt für das spätere Analysenverfahren. Sie müssen aber in jedem Fall im Rahmen der Methodenvalidierung beweisen, dass der HPKLC Peak wirklich substanzspezifisch ist und nicht durch Verunreinigungen z.B. aus Reagenzien verursacht wird.

GMP / cGMP

current GMP

GLP

CP

Limit of detection

lower Limit of quantification

Signal des Leerwertes (Blank)

Leersignal je 5 Peakbreiten

95 % Vertrauensbereich

B

A

Destillation: Austausch Flüssig –Gasphase

Extraktion: Flüssig-Flüssig Phase

Kapillar-GC: Flüssig –Gasphase

LC: Flüssig-Festphase

Nernstscher Verteilungskoeffizient zwischen zwei Phasen = thermodynamische Gleichgewichtskonstante = Quotient der Substanzkonzentration in beiden Phasen ( abhängig von Temperatur und Substanz)

K(Substanz)= c(SubstanzPhase1)/c(Substanz,Phase2)

HETP = Hight Equivallent of a / toa Theoretical Plates -Theoretische Bodenzahl kann aus Peakform berechnet werden. Säulenlänge / theoretische Bodenzahl ergibt in Analogie zu einer Destillationskolonne eine Länge, die der Höhe eines virtuellen theoretischen Bodens entspricht

Inneres Chromatogramm: Komponenten einer Probe legen in einer bestimmten Zeit unterschiedliche Wegstrecken zurück => Detektion der Komponenten in der Trennmatrix. Bsp. (DC) Dünnschichtchromatographie

Äußeres Chromatogramm: Komponenten legen gleiche Trennstrecke in unterschiedlicher Zeit zurück. Detektion nach Austritt aus Trennmatrix. BspHPLC, GC

Physikochemische Prozesse bei der Chromatographie:

1. Adsorption –Desorption

2. Verteilungsgleichgewicht zwischen zwei Phasen

Konzentrationsabhängige Adsorptionsisotherme: nur im linearen Bereich ist RT unabhängig von Konzentration. Bei höheren Konzentrationen in der mobilen Phase rutscht RT nach vorne.

Bezeichnungen: t0: Totzeit, tR1,2: Retentionszeiten Substanz 1,2 h Peakhöhe, w Peakbreite, w1/2 Peakbreiteauf halber Peakhöhe, Blaue Pfeile = Relative Retentionszeiten (Zeit in stat. Phase)

Beladung Probenschleife : Das Stömungsprofilin den Leitungen isParabol. In der Mitte strömt Lösung schneller als am Rand der Leitung. Bei > ½ ist bereits Probe im Abfall, bei < 3 fach ist noch Lösungsmittel ohne Probe in der Schleife

Hochdruck Gradient: Geringe Gradientenverzögerung aber je eine Pumpe pro Lösungsmittel

Niederdruckgradient: mehrere Lösungsmittel aber Gradientenverzögerung

HPLC : High Pressure/ Hochdruck oder High Performance / Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie

Formeln müssen nicht auswendig gelernt werden –nur interpretiert und erkannt !!

Kapazitätsfaktor : k=(tsubstanz-t0)/t0 (relativer Wert, vergleichbar zwischen Säulen und Trennungen, systemunabhängig –Verhältnis der Zeit in stat. Phase zu zeit in mobiler Phase.

Auflösung : alpha=k2/k1 Verhältnis der rel. Retentionszeiten (Auflösung > 1,4 => vollständige Trennung, Selektivität R = 1,18 *(t2-t1)//w1+w2) -Verhältnis Retentionszeitdifferenz zu Summe der Peakbreiten

Qualität der Trennung wird laut kinetischer Theorie der Chromatographie beeinflußt durch:

1. Eddy –Diffusion –schlechte Säulenpackung, stark disperse Füllmaterialien

2. Longitudinale Diffusion (kleine Moleküle, langsam, hohe Temperatur

3. Massentransfer (Porengröße & Partikelgröße)

Van Deemter Kurve : 1. Eddy Diffusion konstant (A), 2. Longitudinale Diffusion fällt schnell ab (B/u ), 3. Massentransfer (C*u ) je mehr Flussgeschwindigkeit / je größer die Partikel , desto geringer die Bodenzahl = desto höher HETP / siehe nächste Folie

Peakkapazität: Zahl der Peaks, die bei Basislinientrennung auf eine Säule passen

Wenn Peakkapazität< Zahl der Komponenten in Mischung = überlappende Peaks

Longitudinale Diffusion (links unten)

Kleine Moleküle (linke Spalte)

Makromoleküle (rechte Spalte)

Massentransfer & Adsorptionskinetik (rechts oben)

Eddy & Diffusion & Strömungsprofil (rechts unten)

Wichtige Fragen Eddy Diffusion: 1. JA / 2. JA (Strömungsunterschiede an Partikeloberfläche zum Zwischenraum aufgrund von Reibung / 3. NEIN – Eddy Diffusion unabhängig von Flussrate / 4. NEIN – sie hat eine größere Bodenhöhe und damit eine kleinere Bodenzahl !! / 5. NEIN – das ist Massentransfer

Minimale Eddy Diffusion: 1. sphärische Partikel gleicher Größe => dichte Kugelpackung / 2. keine Totvolumina , reproduzierbare Packtechnik / 3. Mechanisch exakt passende Säulenhüllen und eben eingelegte Fritten, die keine Totvolumina zur Packung zeigen

Entgaste Lösungsmittel – sonst Entgasung nach Säule und Luftblasen im Detektor = Spikes als Artefaktsignale

Chromatographietechniken:Proteine GPC , SEC: Größenausschlußchromatographie, IEX, IEC: Ionenaustauschchromatographie, HIC-Hydrophobe Interaktionschromatographie kleine Moleküle: RP, RPC: Umkehrphasen Chromatographie , NP, NPC: Normalphasenchromatographie, HILIC –Hydrophilic Interaction Chromatography/ Hydrophile Interaktionschromatographie

HPLC System schematischer Aufbau: Lösungsmittelbehälter –(Mischer Niederdruck)-Degasser-Pumpe –Injektor –Trennsäule Detektor –(Auswerte-PC & -programm)

GPC-Funktionsprinzip: Kleine Moleküle können tiefer in Poren der stationären Phase eindringen. Dort ist Transport diffussionskontrolliert. Kleine Moleküle bleiben im Durchschnitt länger innerhalb der stat. Phase als große. => Große Moleküle werden häufiger in der Strömung der mobilen Phase transportiert als kleine Moleküle => Trennung nach Molekülgröße ( = hydrodynamisches Volumen)

IEX-Funktionsprinzip: Geladene stationäre Phase bindet gegensätzlich geladene Analytmoleküle. Diese können durch andere Ionen derselben Ladung von stationärer. Phase verdrängt werden => Ionenaustausch. Stärke der Bindung beeinflusst Transport durch mobile Phase => Trennung

CEX-Ladung stationäre Phase : Negativ –da positiv geladenen Kationen ausgetauscht werden.

CCC Gegenstromchromatographie = countercurrentchromatography. Zwei nicht mischbare flüssige Phasen. Phase mit geringerer Dichte wird in folgenden „Schütteltrichter“ transferiert –Phase mit höherer Dichte verbleibt in Schütteltrichter (=stationär). Es findet Stoffaustausch zwischen den flüssigen Phasen entsprechend dem Nernst‘schenVerteilungssatz statt.

Load Beladen Injekt Injizieren

Korrekte Substanz: A1: Substanzspezifischen Detektor verwenden (MS, MSMS, spezifische UV-Wellenlänge Fluoreszenz, elektrochemischer Detektor. A2: mehrere Detektoren mit unterschiedlichem Detektionsprinzip = mehrere unabhängige Informationen zu Peak erhöhen Spezifität der Detektion. A3: Bei Analysen mit wenig Komplexität reicht die Elutionvon Standardsubstanz und Analyt im selben Retentionszeitfenster (Varianz der RT muss über eine Methodenvalidierung bestimmt werden). Quantitative Analyse Voraussetzungen A=erfüllt (korrekte Substanz) + Mengenabhängige reproduzierbare Änderung der Signalintensität (=Detektorresponse, ideal linearer Zusammenhang) sichergestellt und über Analysen mit valider Standardsubstanz gezeigt (=Validierung)

Siehe Skript : OPTISCH: UV/Vis(Absorptionsdetektor), Fluoreszenz (Emissionsdetektor), Brechungsindexdifferenz (R, Differenzdetektor), RALS, MALD, LALS (Lichtstreudetektor), KONDUKTOMETRISCH: Leitfähigkeitsdetektor (Strom, Widerstand) VOLTAMETRISCH / AMPEROMETRISCH: Elektrochemischer Detektor (Spannung/Strom bei chemischer Oxidation / Reduktion) ESI-MS, APcI-mS, .. (Massenselektiver Detektor, Ionen in B-und E-Feldern), chemischer Reaktionsdetektor(chemische Umsetzung zu detektierbaremProdukt)

Lambert Beer: 1/T = E = log(I0/I) = ε▪conc▪d (molarer Extinktionskoeffizient, Konzentration, Schichtdicke), Extinktion / Absorptivitätoder Transmission / Durchlässikgkeit. Beschreibt mathematischen Zusammenhang zwischen absorbierter Lichtenergie und Stoffkonzentration. E ist wellenlängenabhängig und eine SubstanzsoezifischeGröße.

Hauptkomponenten in Reihenfolge des Lichtweges: Lampe (Wolfram Halogen (Vis), Deuterium (UV), Gitter(Wellenlängenselektion) , Halbdurchlässiger Spiegel für Referenzstrahl zu Detektor 1, Messzelle (Durchflusszelle, Quarz für UV-Transparenz), Detektor2 (Photodiode), PC (Signalauswertung). Differenz Intensität Signal des Referenzdetektors 1 (I0) zu Intensität Signal Detektor 2 (I1) nach Durchtritt durch Messzelle mit Substanz berechnen => Nach Lambert-Beer-Gesetz sind I1/I0= E proportional zu Konzentration der Substanz, da Signalweg d für gegebene Flusszelle und Extinktionskoeffizient für gegebene Substanz und Wellenlänge unverändert

Brechungsindexdetektor: Lichtbrechung an Grenzfläche reines Elutionsmittel zu Messzelle und zu Referenzzelle wird über verdrehen des Prismas so ausgerichtet, dass beide Strahlen mit maximaler Intensität auf eine Photodiodetreffen. Wenn sich Elutionsmittelmit Analyt in Messzelle befindet ändert sich der Brechungsindesin der Messzelle. Das an der Messzelle gebrochene Licht wird unter einem anderen Winkel gebrochen und trifft nicht mehr mit maximaler Intensität auf die Fotodiode des Detektors. Bei Änderung des RI an Messzelle => weniger Intensität auf Photodiode=> Differenzsignal entspricht RI-Änderung und ist proportional zu Analytkonzentration. In der Regel unterscheiden sich die Brechungsindices von Lösungsmittel und Analyt in Lösung. Deshalb ist der RI Detektor ein Universaldetektor. Baugruppen: Lampe(ggf. Gitter für monochromatische Strahlung) –Prisma mit Mess-und Referenzzelle–Photodiode.

Der Brechungsindex von reinen Lösungsmitteln ändert sich, wenn andere Moleküle in diesem Lösungsmittel gelöst sind. Diese Änderung ist weitgehend unabhängig von der Art des gelösten Moleküls. Deshalb kann über den Brechungsindex die Reinheit eines Lösungsmittels bestimmt werden. Da praktisch jedes Analytmolekülden Brechungsindex des Lösungsmittels ändert und diese Änderung von der Molekülkonzentration abhängt, kann der RI Detektor praktisch alle Moleküle detektieren. Nur im Falle eines identischen Brechungsindexes zweiérElutionsmitteländert sich das Signal zwischen Referenz-und Messzelle nicht.

FID: Starke Lichtquelle (Blitzlampe, Laser) –Monochromator Anregungslicht (Gitter, Filter) –(halbdurchlässiger Spiegel + Fotodiode zur Messung von Intensitätsschwankungen Anregungslicht) -Messzelle –Monochromator Emission orthogonal zu Richtung des Anregungslichtes –Fotodiodedetektiert Intensität emittiertes Licht. Orthogonale Detektion: Fluoreszenz tritt selten auf und erfordert hohe Intensität der Anregung. Das meiste Anregungslicht trifft nicht auf Analytmoleküle=> Transmission + Streuung an Partikel, Gasbläschen, etc. Die Emission erfolgt wie die Streuung in alle Raumrichtungen = geringe Emissionsintensität unter kleinen Raumwinkeln. In Richtung der Transmission können keine 100% des Anregungslichtes ausgeblendet werden. Deshalb muss unter einem Raumwinkel detektiert werden, bei dem möglichst wenig Streulicht auftritt (z.B. orthogonal zur Anregung). Dort kann Streulicht geringer Intensität über Filter oder Gitter ausgeblendet werden. Nur emittiertes Licht trifft auf die Fotodiode des Detektors.

Fluoreszenz: Elektronen liegen in Molekülen bei minimaler Energie im elektronischen Grundzustand (S0) vor. Licht kann Energie E= h▪ν1 bereitstellen, mit der Elektronen in einen angeregten Zustand im Molekül (S1,S2,..) übergehen (=> Absorption). Durch strahlungslose Energieverluste ( Stöße und Schwingungen) gehen die Elektronen bei den meisten Mplekülenin kurzer Zeit wieder in den Grundzustand über. Bei starren Molekülgerüsten relaxierendie Elektronen strahlungslos teilweise nur in einen angeregten elektronischen Zustand. Von dort erfolgt die weitere Relaxation über die Abgabe eines Lichtquants E= h▪ν2 mit dem Energieunterschied zwischen den Molekülorbitalen. Fluoreszenz tritt v.a. bei π-π* Übergängen in Molekülen mit ausgedehnten starren delokalisiertenElektronensystemen auf. Schwingungszustände S0 S1 ∆E=h▪ν1 S0 S1 ∆E strahlungslos S0 S1 ∆E=h▪ν2

Der Extinktionskoeffizient des Fluorescaminsist nur wenig von den Umgebungsbedingungen (wässrig / organisch) abhängig. Deshalb erhält man für dieselbe Menge derivatisierteAminosäure immer dasselbe UV-Signal. Bei der Fluoreszenz gibt es dagegen eine sehr starke Umgebungsabhängigkeit. In organischen Lösungsmittel ist die Fluoreszenzausbeute in der Regel deutlich höher als in wässriger

UV-Vis: Gitter oder Prisma als Monochromator verwenden. Schnelle Bewegung (Scan) des Monochromators ermöglicht es, dass unterschiedliche Wellenlängen durch einen Spalt auf die Probe fallen. Die Spaltbreite definiert dabei die Wellenlängengenauigkeit. Der Scan mehrerer Wellenlängen oder des gesamten Spektrums braucht Zeit => eher langsam. Gitter + Diodenarray–erfasst einen breiten Wellenlängenbereich gleichzeitig => schnell. Die Auflösung hängt dabei von der Zahl der Dioden ab.

Zu jedem Messzeitpunkt wird der Quotient aus Signal 1 / Signal 2 berechnet => Bei einer Substanz muss dieser Quotient immer gleich sein => es ergibt sich eine Rechteckkurve. Überlagern sich Spektren verschiedener Komponenten im selben Peak –z.B. bei unvollständig getrennten Substanzen -ändert sich der Quotient im Verlauf des Peaks. Es entstehen Abweichungen von der Rechteckkurve.

Anwendungen 3D-HPLC: Peakreinheitskontrolle, Identifizierung von Komponenten in komplexen Proben über Vergleich mit Spektrenbibliotheken.

Vorteil MS Detektor: sehr hohe Selektivität durch sehr kleine Massenungenauigkeit (< +/-0.5 Da oder besser, je nach Analysator) => hohe S/N-Raten bei komplexen Proben => gute Nachweissensitivität, Quantifizierung überlappender Peaks in UV-Spur über eindeutig zuordenbare Peakflächenin den Massenspuren. Zusätzliche Information zu Molekülstruktur 8bei MSMS) , geringe Analytmengen, sehr schneller Detektor, => breite Anwendungsmöglichkeiten (Forensik, Pharma, Lebensmittel, …

Probe wird in Lösung durch Kapillare gepumpt, die unter hoher Spannung steht ( z.B. +2000 V). An der Spitze der Kapillare tritt ein Tropfen aus, an dessen Oberfläche sich aufgrund der angelegten Spannung die entsprechend geladenen Ladungsträger sammeln ( positiv –Kationen / naativ–Anionen), um den größtmöglichen Abstand voneinander einzuhalten. Die Oberflächenladung nimmt zu, bis die Abstoßung größer wird als die Oberflächenspannung => dann zerreißt der Tropfen und es entsteht ein Spray aus kleinen Tröpfen => Taylor Kegel. Das Volumen der kleinen Tröpfchen sinkt durch Verlust des Lösungsmittels => Gasmoleküle schlagen bei Stößen mit TröfchenLösungsmittelmoleküle aus der Oberfläche heraus. Die Oberflächenladung der Tröpfchen steigt wieder an, bis die Ladungsabstoßung die Oberflächenspannung erneut übersteigt und noch kleinere Tröpfchen entstehen. Im elektrischen Feld zwischen Kapillarspitze und Einlass zum MS Analysator wandern Ionen in richtungMS Analysator. Am Schluss werden Lösungsmittelmoleküle durch Stöße mit Gasmolekülen von den Analytmolekülenentfernt. Geladenen Analytmolekülewerden durch das elektrische Feld ins Vakuum des Massenanalysators beschleunigt. Gasmoleküle werden durch einen Stickstoffgegenstrom am MS Einlass abgelenkt und gelangen