Welche Bedeutung haben die Buchstaben im AcronymADME? Nennen Sie die Begriffe und erklären Sie kurz ihre Bedeutung
A: Absorption = Verlauf der Wirkstoffaufnahme in den Blutstrom
D: Distribution = Verteilung des Wirkstoffs im Körper (Gewebe, Flüssigkeit)
M: Metabolism = Umwandlung des WS in Metaboliet (Biotransformation)
E: Excretion, Elimination = Ausscheidung Wirkstoffs & Metabolite
Welche Proben müssen bei ADME Studien gemessen werden? Geben sie für jeden Prozess mindestens eine möglich Probe an. (z.B. Blut ,….).
ADME Proben: Absorption- im Blut messen; Eliminierung- im Urin messen; Distribution- Verteilung in Gewebe messen; Metabolismus- in Leber messen => Metabolite in Blut, Urin
Nennen Sie 3 Beispielfragestellung aus der Pharmaindustrie, in denen Analytik eine Rolle spielt? Was wird in den genannten analytischen Prozessen untersucht?
Pharmaanalytik Beispiele : Gehaltsbestimmung Wirkstoff (QC, Freigabeanalytik), Verteilungsanalyse Wirkstoff (z.B. in Tabletten), Identifizierung neuer Biomarker (Forschung –bessere Diagnostik / Targetmoleküle für die Wirkstoffentwicklung
Wie sehen die zeitlichen Verläufe der unterschiedlichen ADME Prozesse A, E bei oraler Gabe (bei intravenöser Gabe) des Wirkstoffs aus? Nennen sie ein kombiniertes Analysenverfahren , mit dem solche Wirkstoffprofile gemessen werden können.
grün: Intravenöse (IV) Gabe des Wirkstoffs. Maximale Konzentration bei t=0 reduziert sich durch Eliminierung.
Rot: Absorption bei oraler Gabe. Langsame Zunahme der Wirkstoffkonzentration im Blut bis Plateau erreicht wird. Danach erfolgt Eliminierung mit der selben Kinetik wie bei iv Gabe des Wirkstoffs
Die Kombination aus Absorptions-und Eliminierungskurve ergibt den Plasmaspiegel des Wirkstoffs im Patienten (blaue oder schwarze Kurve Therapeutisches Fenster : untere blaue Kurve = schneller Metabolisierer bzw. Eliminierer evtl auch langsame Aufnahme –
Wirkstoffkonzentration erreicht nicht die erforderliche therapeutische Konzentration => keine Wirkung // obere schwarze Kurve : schnelle Aufnahme ggf. langsame Eliminierung.
Wirkstoffkonzentration übersteigt kurzzeitig die therapeutisch erforderliche Konzentration => erhöhtes Risiko für Nebenwirkungen
Mögliche häufig verwendete Analysen Methoden Bsp: HPLC-MS, GC-MS
Was ist ein Biomarker (Definition mit wichtigen Grundeigenschaften) ?
Ein Biomarker ist ein objektiv messbarer Parameter für den durch umfassende Untersuchungen an vielen Proben statistisch gesichert nachgewiesen werden konnte, dass er ein Indikator für
- einen normalen biologischen Prozess
- einen krankhaften (pathogenen) Prozess
- eine pharmakologische Wirkung
- eine therapeutische Intervention ist
Biomarker : Objektiv( i.d.R. quantitativ messbar / statistisch abgesicherter spezifischer Indikator für einen bestimmten Krankheitszustand / Körperzustand (Zustand). Dadurch Indikator für Therapeutische Wirkung (pharmakologisch, etc.) (Änderung Zustand)
Benennen sie die Kurven in der folgenden Abbildung zu ADME und geben sie in einem kurzen Satz an, was jeweils im Körper passiert.
Warum werden in der Spurenanalytik häufig kombinierte Analysenverfahren eingesetzt?
Spurenanalytik mit Kombinationsverfahren: Analyte sind nur in Spuren in der Matrix enthalten. Die Nachweisempfindlichkeit der Analysenmethode reicht dann häufig nicht aus, um den Analyten zu detektieren bzw. zu quantifizieren. Die Matrix stört die Methode. Deshalb sind Anreicherung des Analyten & Abtrennung der Matrix erforderlich = verbessertes Signal zu Rauschen
Was unterscheidet ein analytische Direktverfahren von einem Verbundverfahren. Was ist der Vorteil eines Direktverfahrens? Wo liegen Vorteile von Verbundverfahren?
Direktverfahren : Vorteil Erfordert keine Probenvorbereitung, ist oft zerstörungsfrei Verbundverfahren: Ermöglicht Auftrennung der Probenkomponenten & Anreicherung der Analyte=> Reduktion der Komplexität für Detektor, Erhöhung der Analytmenge für Detektion => Besseres Signal zu Rauschen Verhältnis, reduziert/eliminiert Störungen durch Matrix. Erfordert Kombination verschiedener Methoden (Trennung, Detektion,.
Ist das Probengefäß nach GMP Regeln korrekt beschriftbar? Fehlt etwas?
Korrekte Beschriftung möglich.
Die EU guidelinefordert : definiertes Gefäß (OK) mit Angaben zu eindeutiger Probenbezeichnung (Name) / Inhalt (specimen) / Batch Nr. (No) / Datum Beprobung (Date) / Zusätzlich hier DOB = Date ofBusiness, für Datum, an dem Analysenprobe entnommen wurde
Stimmt die Aussage des Leiters der Qualitätskontrolle: „Eine repräsentative Stichprobe können sie einfach mit einem Löffel von oben aus dem Sack mit Pulver nehmen. Möglichst wenig, um Geld zu sparen.,
Nein! Gerade bei Feststoffen ist es eine Herausforderung eine repräsentative Probe zu nehmen. Oben und unten kann das Pulver unterschiedlich aussehen. Es braucht mehrere Stichproben. Die Methode muss genau beschrieben sein. Dabei muss die Zahl der Stichproben anhand belegbarer Kriterien definiert werden. Es muss gezeigt werden, dass durch diese Beprobung eine repräsentative Probe gewonnen werden kann.
Benennen sie die drei Schritte, die vom zu analysierenden Material bis zur Analyse von einer Probe durchlaufen werden müssen.
Ausgangsmaterial => 1. Probennahme n x repäsentative Stichproben => 2. Probenvorbereitung einer homogenen Laborprobe aus den Stichproben => 3. Herstellung Analysen-& Rückstellproben (Aliquots der Laborprobe => Analyse)
Müssen in diesem See Wasserproben aus unterschiedlicher Tiefe für die Nitratmessung gezogen werden? Wie sieht es beim Sediment aus?
Die Nitratverteilung im Wasser ist homogen bzgl. der Wassertiefe. Eine Beprobung aus unterschiedlicher Tiefe ist deshalb nicht zwingend erforderlich (.. Könnte aber sinnvoll sein ;-)) . Beim Sediment verändert sich der Nitratgehalt in Abhängigkeit von der Tiefe => Es müssen Stichproben über das Tiefenprofil entnommen werden.
Die Abbildung zeigt, dass die Nitratkonzentration im Sediment eines Sees in den oberen 3 mm um zwei Größenordnungen abnimmt. Wenn man Nitrat im Sediment bestimmen will, ist es ein Riesenunterschied, ob ein Sedimentbohrkern von 1 m Dicke verwendet wird oder ob nur die obersten 2 mm des Sediments abgeschöpft wurden.
Die Probennahme ist der Arbeitsschritt zur Gewinnung einer repräsentativen Probe für die Analyse.
Was ist das Ziel der qualitativen Analytik , was das der quantitativen Analytik ? Welche Frage muss gestellt werden?
qualitativ: Was ist in der Probe, welches Molekül, welche Struktur, aus was besteht die Probe?quantitativ: Wieviel einer bestimmten Substanz enthält meine Probe ?
Die chemische Analytik kann in zwei Hauptgruppen und 5 Untergruppen eingeteilt werden. Skizzieren sie diese Einteilung und benennen sie die Gruppen.
Hauptgruppen chemische Analytik : Nasschemische (Gravimetrie, Titrimetrie) & Instrumentelle Methoden (Optische Methoden, Trennmethoden, Elektrochemische Methoden)
Unterscheidet sich der Wirkstoffgehalt der vier Tablettenchargen?
Wirkstoffgehalt vielleicht gleich / vielleicht unterschiedlich.
Ohne Angabe zu CV, Standdardabweichung= Fehlerbalken ist eine Aussage darüber
Berechnen sie den Gehalt einer wässrigen 150 mmol/l Ca2+ Lösung in ppm. MW(Ca)= 40,078 g/mol. Dichte Wasser: ρ = 1 g/ml
1. Berechnen Massenkonzentration: c(Ca2+) = n /V= n*MG/V = 15 mmol/l * 40,078 mg/mmol = 601,17 mg/l = 601,17 mg/l*g/1000 mg = 0,601 g/l (geltende Ziffern 3 => 150 mM)
2. Berechnen des Gehalts : c(Ca2+) = m(Ca2+) / m(H2O) = m(Ca2+) / V*ρ(H2O) = 0,601 g/ (1l * 1 kg/l) = 0,601 g/kg = 601 mg/kg = 601 µg/g = 601 ppm
Was bedeuten die Konzentrationsangaben ppm, ppb, ppt, ppq?
Es handelt sich um Gehaltsangaben ohne Einheit Vergleichbar mit %, Promille, .. …
partsper million(10-6) / partsper billion(10-9) / partsper trillion(10-12) /partsper quatrillion(10-15)
Wieviel mol sind µmol, fmol, amol, pmol, zmol, nmol?
Molare Mengen: µmol= 10-6mol(mikro) / fmol= 10-15mol(femto) / amol=10-18mol(atto) / pmol=10-12mol(pico) , zmol= 10-21mol(zepto)
Definieren Sie die Begriffe Analyt und Matrix.
Analyt : Das Molekül, das mich interessiert (über den eine analytische Aussage gemacht werden soll)
Matrix: Bestandteile einer Probe, die nicht Analyt sind, für die ich mich also auch nicht interessiere, die aber den Nachweis der Probe ermöglichen
Begründen Sie, warum die Gewinnung repräsentativer Proben bei Feststoffen schwieriger ist als bei Gasen oder Flüssigkeiten. Wie können repräsentative Proben von Feststoffen gewonnen werden?
Repräsentative Proben bei Feststoffen: Inhomogene Verteilung kann nicht durch einfache Mischverfahren homogenisiert werden => viele Stichproben müssen an verschiedenen Stellen entnommen, gemahlen, gemischt, aufgeteilt und verjüngt werden, bis eine repräsentative Laborprobe zur Verfügung steht => die Analysenprobe.
Bei Gasen & Flüssigkeiten muss nichts gemahlen und aufgeschlossen werden und das Mischen ist einfacher erreichbar. => eine repräsentative Probe des Gesamtobjektes ist bei Gasen und Flüssigkeiten mit weniger Aufwand zu gewinnen.
Welche drei Gruppen von prinzipiellen Probentypen können bei Tieren und Menschen für die Analyse von molekularen Biomarkern verwendet werden?
Prinzipielle Probentypen aus Mensch und Tier: Körperflüssigkeiten (Blut, CSF) / Gewebe (Tumor, Organ, ), Ausscheidungen (Urin, Kot, Schweiss, )
Welche drei Gruppen von prinzipiellen Probentypen können bei Tieren und Menschen für die Analyse von molekularen Biomarkern und später für die Diagnostik verwendet werden? Was macht die Probentypen diagnostisch besonders interessant?
Prinzipielle Probentypen aus Mensch und Tier:
1. Körperflüssigkeiten (Blut, CSF) - Blut trägt Informationen aus dem gesamten Körper, Gewinnung ist klinische Routine/
2. Gewebe (Tumor, Organ, ) - hohe Konzentration an relevanten Biomarkern , Gewinnung aufwändiger
3. Ausscheidungen (Urin, Kot, Schweiss, ) = sehr einfache Gewinnung, nur teilweise repräsentativ als Biomarker, da Analyte durch Leber / Niere oder Bakterien im Darm metabolisiert werden
Bitte entscheiden sie, bei welchen der folgenden Angaben ein Analysenverfahren, ein Analysenprinzip oder eine Analysenmethode beschrieben werden soll.
A: SOP zur Analyse eines Metaboliten in Mäuseserum schreiben.
B: SOP für eine HPLC-MS Analyse eines Metaboliten schreiben
C: Prüfen, ob ihr Metabolit über eine spezifische UV Absorptionswellenlänge oder mittels Fluoreszenz analysiert werden kann.
Analysenverfahren A
Analysenprinzip C
Analysenmethode B
Nennen sie bitte die zwei prinzipiell möglichen Lösungen, die die Analytik nutzt, um trotz begrenzter dynamischer Detektionsbereiche der Detektoren sehr nachweisempfindliche Analysenverfahren zu etablieren, die sogar wenige Tausend Moleküle reproduzierbar detektieren und quantifizieren können?
Goldene Regeln der hohen Nachweisempfindlichkeit:
OPTION 1. Nutze analytspezifische Detektoren z.B. hochspezifische Antikörper + amplifizierende Detektionssysteme wie Fluoreszenz oder Enzym-Substrat Reaktionen in Immunoassays
OPTION 2. Wenn keine spezifischen Fängermoleküle vorhanden sind, trenne die Matrix von den Analyten ab und reichere die Analyte
Was ist die grundlegende Messgröße eines Detektor, die für eine möglichst hohe Nachweisempfindlichkeit erforderlich ist? Warum wird diese Messgröße gewählt?
Über das Signal zu Rauschen Verhältnis wird die Nachweisempfindlichkeit definiert.
Nur wenn das spezifische Analyt-Signal statistisch signifikant vom unspezifischen Signalrauschen unterschieden werden kann, ist eine statistisch abgesicherte Detektion eines Analyten möglich.
Was bedeuten die Abkürzungen GMP, GLP, GCP, cGMP? Welche Institutionen müssen sich an den dort definierten Regeln orientieren?
GMP Good Manufacturing Practice: Pharma- und Medizinproduktehersteller – Labore in der Produktions- und Freigabeanalytik /
GLP Good Laboratory Practice: Analysen- und Prüflabore im Bereich Pharma, Lebensmittel, Materialprüfung, ….
GCP: Good Clinical Practice: Ärzte, Pharma bei klinischen Studien, Kliniken – QC für klinische Studien an Menschen incl. ethischer, datenschutzrechtlicher Themen
cGMP: current GMP: In USA wird USP und GMP Regelwerk jährlich im Code of Federal Regulations (CFR = US Gesetzbuch) geregelt Wichtige GMP Artikel
Welche Arten der Methoden-Validierung kennen sie?
Retrospektiv: Auf Basis von bereits existierenden Messdaten => historisch – heute nicht mehr GXP konform.
Prospektiv: Bei Etablierung eines neuen Verfahrens. Start mit Definition eines Validierungsplans & erwarteten statistische Grenzen für Qualitätskenngrößen (WICHTIG –VORHER FESTLEGEN!!)
Revalidierung: bei Change Control Ereignissen für bestehende Methode erforderlich. Start mit Definition Validierungsplan & erwartete statistische Grenzen für Qualitätskenngrößen (Die sind in der Regel auf bisherigen Messungen bekannt – IN JEDEM FALL den Plan vor Start der Validierung festlegen.) Bei der Revalidierung müssen nicht alle Parameter revalidiert werden. Es reicht die für die Change Control Änderungen relevanten Parameter zu validieren.
Die Analytik kann nach unterschiedlichen Methoden eingeteilt werden. Unten ist das Schema so einen Einteilung gezeigt. Bitte ergänzen sie die Begriffe in den leeren Felder im Schema
egriffe Einteilung Analytik: nasschemische Methoden / instrumentelle Methoden // Gravimetrie, Volumetrie, Optische Methoden, Trennmethoden, elektrochemische Methoden, Sonstige Methoden
Was ist der Unterschied zwischen Qualifizierung und Validierung? Nennen sie die 4 Arten der Qualifizierung im Bereich der Analytik und die drei Möglichkeiten der Validierung. Welche Möglichkeit der Validierung ist aktuell nicht mehr so möglich wie früher?
Qualifizierung: Überwachung der Laborausrüstung mit Testanalysen über die gesamte Nutzungsdauer.
Prozesse und Parameter müssen von Betreiber des Labors festgelegt und regelmäßig, mind-1x jährlich überprüft werden.
Typen:
DQ: Design Qualification(Hersteller, Nutzer prüft),
IQ: Installation Qualification Delegation an Gerätehersteller möglich. Parameter idR von Hersteller festgelegt.
OQ: Operational Qualification–Test der grundsätzlichen, generellen Eignung des Gerätes, durch Nutzer oder Delegation an Hersteller,
PQ: Performance / Processing Qualification–Spezifisch für Kundenanwendung, (durch Nutzer). In der Regel durch Qualitätskontrollstandards die für das jeweilige Analysenverfahren spezifisch definiert werden.
Validierung: Prüfung eines Verfaherns–oder einer Methode auf Eignung für den vorgesehenen Zweck.
Retrospektiv: war früher möglich, heute nicht mehr erlaubt !!l , basierend auf bereits vorliegenden Analysendaten
Prospektiv: Validierungsplan –Analysen –Auswertung = muss komplett neu gemacht werden
Revalidierung= im laufenden Betrieb, z.B. nach Change Control Ereignissen erforderlich. Kann auf relevante Parameter beschränkt werden, muss aber ebenfalls komplett neu gemacht werden.
Bei der Festlegung von QC Methoden unter GXP kann man sich an unterschiedlichen Dokumenten orientieren. Kann man sich beliebig Dokumente wählen oder gibt es eine Hierarchie der Dokumente, die man berücksichtigen sollte? Ordnen sie die angegebenen Dokumente nach der Reihenfolge, die ihnen sinnvoll scheint, um ein validiertes Analysenverfahren unter GXP zu etablieren. Geben sei eine kurze Begründung für ihre Rangfolge. Dokumente: DIN Norm , Arzneibuch Pharm. Eur., wissenschaftlich Fachpublikation einer Fachzeitschrift mit Peer Review Begutachtung , Webinar eines Geräteherstellers, ICH Guideline, EMA Guideline, EURACHEM Guideline
Unter GXP gibt es eine Hierarchie der Dokumente, an denen man sich orientieren sollte. Hierarchie nach Wichtigkeit:
1. das relevante Arzneibuch Pharm. Eur. (ist in Deutschland Gesetz! ) – falls nicht verfügbar bzw. nicht ausreichend –
2. ICH Guideline, EMA Guideline, FDA Guideline (Zulassungsbehörden geben die Regeln vor, die bei Audit gefordert werden) –
3. Normen DIN, EURACHEM (von Fachleuten festgelegt, nicht zwingend an Pharma orientiert – aber immerhin QC orientiert und unter vielen Fachleuten abgestimmt) –
4. Fachpublikation Peer Review (Fachleute, begutachtet durch 2-3 Fachgutachter = Qualität sichergestellt – aber eben nur2-3 Personen mit evtl. zu wenig Zeit = nicht das gesamte Spektrum an Expertise im Arbeitsgebiet) -
5. Webinar etc, Publikationen ohne Peer Review –als Ideengeber nutzbar
Sie sollen eine Qualitätskontrolle von Tablettencharge etablieren. Dazu haben sie eine HPLC-Methode zur Bestimmung des Wirkstoffes etabliert, die sie jetzt validieren müssen. Sie legen den folgende Ablauf in ihrem Validierungsplan fest: Die Probennahme (mindestens 100 Tabletten pro Herstellungsbatch über Stichproben von jeweils 10 Tabletten pro Stunde. Lösen aller Tabletten in Wasser ( 10 ml pro Tablette vorlegen, 30 min bei RT Rühren. Vor der Analyse wird die Lösung optisch auf Homogenität und Farbe geprüft. Dabei nutzen sie eine Arzneibuchvorschrift als Grundlage. Für die Validierung der HPLC Methode planen sie Validierungsversuche zur Bestimmung der Richtigkeit, Wiederholpräzision, Zwischenpräzision, Spezifität und Linearität des Arbeitsbereiches. Ihr Kollege will auch noch Validierungsversuche zur Bestimmung der LLOQ machen. Ihr Chef möchte auf die Versuche zur Ermittlung der Spezifität verzichten, weil ja gar keine andere Substanz den Peak in der HPLC verursachen kann. Ist der von ihnen vorgeschlagene Validierungsumfang angemessen oder haben ihr Chef bzw. ihr Kollege mit ihren Vorschlägen recht?
Der Validierungsumfang ist für eine Gehaltsbestimmung ausreichend. Da der Arbeitsbereich durch die Vorgabe des Wirkstoffgehaltes in der Tablette sehr eng begrenzt ist, werden Konzentrationen im Bereich des LLOQ und des ULOQ nie erreicht bzw. liegen weit außerhalb des Arbeitsbereiches und zeigen deshalb sowieso eine schlechte Charge an. Eine Validierung des LLOQ ist deshalb nicht erforderlich. Auf die Bestimmung der Spezifität kann in der Validierung nie verzichtet werden. Das Argument des Chefs ist möglicherweise korrekt für das spätere Analysenverfahren. Sie müssen aber in jedem Fall im Rahmen der Methodenvalidierung beweisen, dass der HPKLC Peak wirklich substanzspezifisch ist und nicht durch Verunreinigungen z.B. aus Reagenzien verursacht wird.
Bitte ergänzen sie die Begriffe in den leeren Feldern
GMP / cGMP
current GMP
GLP
CP
Alternativ LOD, LLOQ – ICH guideline
Limit of detection
lower Limit of quantification
Signal des Leerwertes (Blank)
Leersignal je 5 Peakbreiten
95 % Vertrauensbereich
B
A
Vergleichen Sie Destillation, flüssig-flüssig Extraktion, Kapillar-Gaschromatographie und Flüssigchromatographie. Zwischen welchen Phasen werden Analyteausgetauscht?
Destillation: Austausch Flüssig –Gasphase
Extraktion: Flüssig-Flüssig Phase
Kapillar-GC: Flüssig –Gasphase
LC: Flüssig-Festphase
Was beschreibt der Nernst‘scheVerteilungskoeffizient? Schreiben sie die Formel auf.
Nernstscher Verteilungskoeffizient zwischen zwei Phasen = thermodynamische Gleichgewichtskonstante = Quotient der Substanzkonzentration in beiden Phasen ( abhängig von Temperatur und Substanz)
K(Substanz)= c(SubstanzPhase1)/c(Substanz,Phase2)
Was bedeutet die Abkürzung HETP in der Chromatographie? Was muß man sich darunter vorstellen?
HETP = Hight Equivallent of a / toa Theoretical Plates -Theoretische Bodenzahl kann aus Peakform berechnet werden. Säulenlänge / theoretische Bodenzahl ergibt in Analogie zu einer Destillationskolonne eine Länge, die der Höhe eines virtuellen theoretischen Bodens entspricht
Was ist der Unterschied zwischen einem Innerenund einem äußeren Chromatogramm? Nennen Sie je eine Beispielmethode, die innere bzw. äußere Chromatogramme erzeugt.
Inneres Chromatogramm: Komponenten einer Probe legen in einer bestimmten Zeit unterschiedliche Wegstrecken zurück => Detektion der Komponenten in der Trennmatrix. Bsp. (DC) Dünnschichtchromatographie
Äußeres Chromatogramm: Komponenten legen gleiche Trennstrecke in unterschiedlicher Zeit zurück. Detektion nach Austritt aus Trennmatrix. BspHPLC, GC
Mit welchen zwei physikochemischen Prozessen können die meisten Vorgänge bei chromatographischen Trennprozessen beschrieben werden?
Physikochemische Prozesse bei der Chromatographie:
1. Adsorption –Desorption
2. Verteilungsgleichgewicht zwischen zwei Phasen
In welchem Bereich der konzentrationsabhängigen Adsorptionsisotherme muß die Trennung erfolgen, um reproduzierbare, konzentrationsunabhängige Retentionszeiten für eine Substanz zu erreichen?
Konzentrationsabhängige Adsorptionsisotherme: nur im linearen Bereich ist RT unabhängig von Konzentration. Bei höheren Konzentrationen in der mobilen Phase rutscht RT nach vorne.
Geben Sie die Bezeichnungen für das nebenstehende schematische Chromatogramm an.
Bezeichnungen: t0: Totzeit, tR1,2: Retentionszeiten Substanz 1,2 h Peakhöhe, w Peakbreite, w1/2 Peakbreiteauf halber Peakhöhe, Blaue Pfeile = Relative Retentionszeiten (Zeit in stat. Phase)
Warum sollte die Probenschleife bei quantitativen HPLC Analysen zu max. 1/2 bzw. min 3-fach überladen werden?
Beladung Probenschleife : Das Stömungsprofilin den Leitungen isParabol. In der Mitte strömt Lösung schneller als am Rand der Leitung. Bei > ½ ist bereits Probe im Abfall, bei < 3 fach ist noch Lösungsmittel ohne Probe in der Schleife
Was sind Vor-und Nachteile der Hochdruck-und Niederdruckmischung von HPLC Gradienten?
Hochdruck Gradient: Geringe Gradientenverzögerung aber je eine Pumpe pro Lösungsmittel
Niederdruckgradient: mehrere Lösungsmittel aber Gradientenverzögerung
Was bedeutet das AcronymHPLC?
HPLC : High Pressure/ Hochdruck oder High Performance / Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie
Was sind die Begriffe relative Retention (Kapazitätsfaktor), Selektivität und Auflösung für sokratische chromatographische Trennungen definiert? Welche Aussage ist damit möglich?
Formeln müssen nicht auswendig gelernt werden –nur interpretiert und erkannt !!
Kapazitätsfaktor : k=(tsubstanz-t0)/t0 (relativer Wert, vergleichbar zwischen Säulen und Trennungen, systemunabhängig –Verhältnis der Zeit in stat. Phase zu zeit in mobiler Phase.
Auflösung : alpha=k2/k1 Verhältnis der rel. Retentionszeiten (Auflösung > 1,4 => vollständige Trennung, Selektivität R = 1,18 *(t2-t1)//w1+w2) -Verhältnis Retentionszeitdifferenz zu Summe der Peakbreiten
Welche kinetischen Prozesse beeinflussen die Qualität einer chromatographischen Trennung?
Qualität der Trennung wird laut kinetischer Theorie der Chromatographie beeinflußt durch:
1. Eddy –Diffusion –schlechte Säulenpackung, stark disperse Füllmaterialien
2. Longitudinale Diffusion (kleine Moleküle, langsam, hohe Temperatur
3. Massentransfer (Porengröße & Partikelgröße)
Zeichnen Sie schematisch eine Van-Deemter Kurve. Diskutieren Sie die Anteile der drei unterschiedlichen kinetischen Prozesse am Kurvenverlauf.
Van Deemter Kurve : 1. Eddy Diffusion konstant (A), 2. Longitudinale Diffusion fällt schnell ab (B/u ), 3. Massentransfer (C*u ) je mehr Flussgeschwindigkeit / je größer die Partikel , desto geringer die Bodenzahl = desto höher HETP / siehe nächste Folie
Wie ist die Peakkapazitätdefiniert (keine Formel, nur beschreiben!) ? Was passiert, wenn die Zahl der Komponenten größer als die Peakkapazitätist?
Peakkapazität: Zahl der Peaks, die bei Basislinientrennung auf eine Säule passen
Wenn Peakkapazität< Zahl der Komponenten in Mischung = überlappende Peaks
Graphische Darstellung der Summe aller Effekte, die zur Peakverbreiterungin Chromatogrammen führen.
Longitudinale Diffusion (links unten)
Kleine Moleküle (linke Spalte)
Makromoleküle (rechte Spalte)
Massentransfer & Adsorptionskinetik (rechts oben)
Eddy & Diffusion & Strömungsprofil (rechts unten)
Welche Aussagen sind richtig.
1. Die Eddy Diffusion wird durch die Qualität der Trennsäulen beeinflußt
2. Die Viskosität von Lösungsmitteln und Probenbestandteilen führt zur Peakverbreiterung
3. Je höher die Flussrate desto größer wird die Eddy Diffusion
4. Eine Trennsäule mit schlechter Säulenpackung (Lücken zwischen den Partikeln der Säulenfüllung) hat eine größere theoretische Bodenzahl als eine Trennsäule mit guter (dichter) Säulenpackung.
5. Bei der Eddy Diffusion wandern Moleküle unterschiedlich schnell in Poren ein.
Wichtige Fragen Eddy Diffusion: 1. JA / 2. JA (Strömungsunterschiede an Partikeloberfläche zum Zwischenraum aufgrund von Reibung / 3. NEIN – Eddy Diffusion unabhängig von Flussrate / 4. NEIN – sie hat eine größere Bodenhöhe und damit eine kleinere Bodenzahl !! / 5. NEIN – das ist Massentransfer
Wie wird bei modernen Chromatographiemedien die Eddy Diffusion minimiert?
Minimale Eddy Diffusion: 1. sphärische Partikel gleicher Größe => dichte Kugelpackung / 2. keine Totvolumina , reproduzierbare Packtechnik / 3. Mechanisch exakt passende Säulenhüllen und eben eingelegte Fritten, die keine Totvolumina zur Packung zeigen
Warum sollten HPLC Lösungsmittel entgast sein?
Entgaste Lösungsmittel – sonst Entgasung nach Säule und Luftblasen im Detektor = Spikes als Artefaktsignale
Was bedeuten die folgenden Abkürzungen? Nennen Sie die vollen Namen der ChromatographietechnikenGPC, RP, IEX, HILIC, SEC, HIC, IEC, NP. Welche davon werden eher zur Trennung von Biopolymeren, welche zur Trennung niedermolekularer Verbindungen benutzt?
Chromatographietechniken:Proteine GPC , SEC: Größenausschlußchromatographie, IEX, IEC: Ionenaustauschchromatographie, HIC-Hydrophobe Interaktionschromatographie kleine Moleküle: RP, RPC: Umkehrphasen Chromatographie , NP, NPC: Normalphasenchromatographie, HILIC –Hydrophilic Interaction Chromatography/ Hydrophile Interaktionschromatographie
Beschreiben Sie schematisch den Aufbau eines (Niederdruck) HPLC Systems mit den wichtigsten Komponenten
HPLC System schematischer Aufbau: Lösungsmittelbehälter –(Mischer Niederdruck)-Degasser-Pumpe –Injektor –Trennsäule Detektor –(Auswerte-PC & -programm)
Erklären Sie das Funktionsprinzip der Größenausschlußchromatographie.
GPC-Funktionsprinzip: Kleine Moleküle können tiefer in Poren der stationären Phase eindringen. Dort ist Transport diffussionskontrolliert. Kleine Moleküle bleiben im Durchschnitt länger innerhalb der stat. Phase als große. => Große Moleküle werden häufiger in der Strömung der mobilen Phase transportiert als kleine Moleküle => Trennung nach Molekülgröße ( = hydrodynamisches Volumen)
Erklären Sie das Funktionsprinzip der Ionenaustauschchromatographie.
IEX-Funktionsprinzip: Geladene stationäre Phase bindet gegensätzlich geladene Analytmoleküle. Diese können durch andere Ionen derselben Ladung von stationärer. Phase verdrängt werden => Ionenaustausch. Stärke der Bindung beeinflusst Transport durch mobile Phase => Trennung
Welche Ladung trägt die stationäre Phase einen Kationenaustauschers?
CEX-Ladung stationäre Phase : Negativ –da positiv geladenen Kationen ausgetauscht werden.
Erklären sie das Prinzip der Gegenstomchromatographie. Was bedeuteddas Kürzel CCC ?
CCC Gegenstromchromatographie = countercurrentchromatography. Zwei nicht mischbare flüssige Phasen. Phase mit geringerer Dichte wird in folgenden „Schütteltrichter“ transferiert –Phase mit höherer Dichte verbleibt in Schütteltrichter (=stationär). Es findet Stoffaustausch zwischen den flüssigen Phasen entsprechend dem Nernst‘schenVerteilungssatz statt.
Zeichnen sie in das folgende Schema eines HPLC Injektionsventils die fehlenden Verbindungen für den Zustand Laden (Load) und Injizieren (Inject) ein. Verwenden Sie zur Bezeichnung der Anschlüsse die Zahlen bei den aufgeführten Begriffen.
Load Beladen Injekt Injizieren
Welche 5 Anforderungen werden an optimale Partikel der stationären Phase gestellt?
Warum werden HPLC Trennungen von Pharmazeutischen Wirkstoffen bevorzugt im Reverse Phase Modus durchgeführt? Was sind Vorteile des Reverse Phase Modus?
Was bedeuten die Abkürzungen NP und RP in der Chromatographie? Was bedeutet HILIC? Beschreiben Sie in Stichworten das jeweilige Trennprinzip und die Polarität von stationärer und mobiler Phase.
Welche der folgenden Oberflächenmodifikationen ist die C8 Octyl-Phase, welche die C4 Butylphase?
Was bedeutet Endcapping bei der Umkehrphasenchromatographie? Was wird dabei gemacht, warum?
Was kann man aus einer eluotropen Reihe ablesen?
Welches Lösungsmittel ist für die Analyse einer Fettsäure (UV Detektor 214 nm) oder eines Farbstoffs (UV /Vis Detektor 480 nm) geeignet? Wo sind Probleme mit hohem Rückdruck zu erwarten? Die Elution des Analyten von Silica dauert mit DMSO zu lange. Welche der folgenden Lösungsmittel würden die Elution beschleunigen?
Wasser (Elutionsstärke ε0 =1, UV-Cutoff 190 nm, Viskosität η=1,00 mPas), ACN (ε0 = 0,5, UV-Cutoff 190 nm, η=0,37 mPas), Chloroform (ε0 = 0,31, UV-Cutoff 245 nm, η=0,57 mPas) , DMSO (ε0 = 0,48, UV Cutoff 270 nm, η= 2,24 mPas)
Welche Voraussetzungen müssen erfüllt sein, damit eine quantitative Analyse von Substanzen mittels HPLC möglich ist? Woher weiß ich, dass ich die richtige Substanz quantifiziere und dass ich die Menge der Substanz mit dem verwendeten Detektor bestimmen kann?
Korrekte Substanz: A1: Substanzspezifischen Detektor verwenden (MS, MSMS, spezifische UV-Wellenlänge Fluoreszenz, elektrochemischer Detektor. A2: mehrere Detektoren mit unterschiedlichem Detektionsprinzip = mehrere unabhängige Informationen zu Peak erhöhen Spezifität der Detektion. A3: Bei Analysen mit wenig Komplexität reicht die Elutionvon Standardsubstanz und Analyt im selben Retentionszeitfenster (Varianz der RT muss über eine Methodenvalidierung bestimmt werden). Quantitative Analyse Voraussetzungen A=erfüllt (korrekte Substanz) + Mengenabhängige reproduzierbare Änderung der Signalintensität (=Detektorresponse, ideal linearer Zusammenhang) sichergestellt und über Analysen mit valider Standardsubstanz gezeigt (=Validierung)
Welche Detektionsverfahren werden in der HPLC eingesetzt? Nennen Sie 4 Verfahren und das zugehörige Messprinzip (Stichworte)
Siehe Skript : OPTISCH: UV/Vis(Absorptionsdetektor), Fluoreszenz (Emissionsdetektor), Brechungsindexdifferenz (R, Differenzdetektor), RALS, MALD, LALS (Lichtstreudetektor), KONDUKTOMETRISCH: Leitfähigkeitsdetektor (Strom, Widerstand) VOLTAMETRISCH / AMPEROMETRISCH: Elektrochemischer Detektor (Spannung/Strom bei chemischer Oxidation / Reduktion) ESI-MS, APcI-mS, .. (Massenselektiver Detektor, Ionen in B-und E-Feldern), chemischer Reaktionsdetektor(chemische Umsetzung zu detektierbaremProdukt)
Geben Sie die Gleichung für das Lambert-BeerscheGesetz an. Was bedeuten die einzelnen Größen? Beschreiben Sie, was das Lambert-BeerscheGesetz aussagt in Ihren Worten.
Lambert Beer: 1/T = E = log(I0/I) = ε▪conc▪d (molarer Extinktionskoeffizient, Konzentration, Schichtdicke), Extinktion / Absorptivitätoder Transmission / Durchlässikgkeit. Beschreibt mathematischen Zusammenhang zwischen absorbierter Lichtenergie und Stoffkonzentration. E ist wellenlängenabhängig und eine SubstanzsoezifischeGröße.
Beschreiben sie den Grundaufbau eines UV/VisDetektors mit den wichtigsten Baugruppen. Wie kann die Absorption bei unterschiedliche Wellenlängen gemessen werden?
Hauptkomponenten in Reihenfolge des Lichtweges: Lampe (Wolfram Halogen (Vis), Deuterium (UV), Gitter(Wellenlängenselektion) , Halbdurchlässiger Spiegel für Referenzstrahl zu Detektor 1, Messzelle (Durchflusszelle, Quarz für UV-Transparenz), Detektor2 (Photodiode), PC (Signalauswertung). Differenz Intensität Signal des Referenzdetektors 1 (I0) zu Intensität Signal Detektor 2 (I1) nach Durchtritt durch Messzelle mit Substanz berechnen => Nach Lambert-Beer-Gesetz sind I1/I0= E proportional zu Konzentration der Substanz, da Signalweg d für gegebene Flusszelle und Extinktionskoeffizient für gegebene Substanz und Wellenlänge unverändert
Erläutern Sie kurz das Funktionsprinzip eines Brechungsindexdetektors und geben sie die wichtigsten Baugruppen an.
Brechungsindexdetektor: Lichtbrechung an Grenzfläche reines Elutionsmittel zu Messzelle und zu Referenzzelle wird über verdrehen des Prismas so ausgerichtet, dass beide Strahlen mit maximaler Intensität auf eine Photodiodetreffen. Wenn sich Elutionsmittelmit Analyt in Messzelle befindet ändert sich der Brechungsindesin der Messzelle. Das an der Messzelle gebrochene Licht wird unter einem anderen Winkel gebrochen und trifft nicht mehr mit maximaler Intensität auf die Fotodiode des Detektors. Bei Änderung des RI an Messzelle => weniger Intensität auf Photodiode=> Differenzsignal entspricht RI-Änderung und ist proportional zu Analytkonzentration. In der Regel unterscheiden sich die Brechungsindices von Lösungsmittel und Analyt in Lösung. Deshalb ist der RI Detektor ein Universaldetektor. Baugruppen: Lampe(ggf. Gitter für monochromatische Strahlung) –Prisma mit Mess-und Referenzzelle–Photodiode.
Warum wird der RI Detektor als Universaldetektor bezeichnet
Der Brechungsindex von reinen Lösungsmitteln ändert sich, wenn andere Moleküle in diesem Lösungsmittel gelöst sind. Diese Änderung ist weitgehend unabhängig von der Art des gelösten Moleküls. Deshalb kann über den Brechungsindex die Reinheit eines Lösungsmittels bestimmt werden. Da praktisch jedes Analytmolekülden Brechungsindex des Lösungsmittels ändert und diese Änderung von der Molekülkonzentration abhängt, kann der RI Detektor praktisch alle Moleküle detektieren. Nur im Falle eines identischen Brechungsindexes zweiérElutionsmitteländert sich das Signal zwischen Referenz-und Messzelle nicht.
Beschreiben sie den Grundaufbau eines Fluoreszenzdetektors mit den wichtigsten Baugruppen. Warum wird das Fluoreszenzlicht orthogonal zur Richtung des Anregungslichtstrahls detektiert werden?
FID: Starke Lichtquelle (Blitzlampe, Laser) –Monochromator Anregungslicht (Gitter, Filter) –(halbdurchlässiger Spiegel + Fotodiode zur Messung von Intensitätsschwankungen Anregungslicht) -Messzelle –Monochromator Emission orthogonal zu Richtung des Anregungslichtes –Fotodiodedetektiert Intensität emittiertes Licht. Orthogonale Detektion: Fluoreszenz tritt selten auf und erfordert hohe Intensität der Anregung. Das meiste Anregungslicht trifft nicht auf Analytmoleküle=> Transmission + Streuung an Partikel, Gasbläschen, etc. Die Emission erfolgt wie die Streuung in alle Raumrichtungen = geringe Emissionsintensität unter kleinen Raumwinkeln. In Richtung der Transmission können keine 100% des Anregungslichtes ausgeblendet werden. Deshalb muss unter einem Raumwinkel detektiert werden, bei dem möglichst wenig Streulicht auftritt (z.B. orthogonal zur Anregung). Dort kann Streulicht geringer Intensität über Filter oder Gitter ausgeblendet werden. Nur emittiertes Licht trifft auf die Fotodiode des Detektors.
Erklären sie, wie bei manchen Molekülen Fluoreszenz auftritt. Wie kann man die Stokes-Verschibung zwischen Absorptions-und Emissionsspektrum erklären. Warum zeigen die meisten Moleküle keine Fluoreszenz sondern nur Absorption?
Fluoreszenz: Elektronen liegen in Molekülen bei minimaler Energie im elektronischen Grundzustand (S0) vor. Licht kann Energie E= h▪ν1 bereitstellen, mit der Elektronen in einen angeregten Zustand im Molekül (S1,S2,..) übergehen (=> Absorption). Durch strahlungslose Energieverluste ( Stöße und Schwingungen) gehen die Elektronen bei den meisten Mplekülenin kurzer Zeit wieder in den Grundzustand über. Bei starren Molekülgerüsten relaxierendie Elektronen strahlungslos teilweise nur in einen angeregten elektronischen Zustand. Von dort erfolgt die weitere Relaxation über die Abgabe eines Lichtquants E= h▪ν2 mit dem Energieunterschied zwischen den Molekülorbitalen. Fluoreszenz tritt v.a. bei π-π* Übergängen in Molekülen mit ausgedehnten starren delokalisiertenElektronensystemen auf. Schwingungszustände S0 S1 ∆E=h▪ν1 S0 S1 ∆E strahlungslos S0 S1 ∆E=h▪ν2
Ihr Kollege hat zwei Aminosäuren mit Fluoreszenzlabel (Fluorescamin) derivátisiertund mittels HPLC analysiert. Der UV-Detetektormisst die Absorption des Fluorescaminsbei 390 nm. Die Fluoreszenz wird bei 475 nmgemessen. Von beiden derivatisiertenAminosäuren wurden jeweils 20 pmolauf die Säule gegeben. Warum zeigen sich im UV-Chromatogramm zwei Peaks mit vergleichbarer Peakfläche und in der Fluoreszenzspur sehr unterschiedliche Peakflächen?
Der Extinktionskoeffizient des Fluorescaminsist nur wenig von den Umgebungsbedingungen (wässrig / organisch) abhängig. Deshalb erhält man für dieselbe Menge derivatisierteAminosäure immer dasselbe UV-Signal. Bei der Fluoreszenz gibt es dagegen eine sehr starke Umgebungsabhängigkeit. In organischen Lösungsmittel ist die Fluoreszenzausbeute in der Regel deutlich höher als in wässriger
Wie werden mehrere Wellenlängen in UV-VisDetektoren erfaßt. Wie können sekundenschnell komplette Spektren aufgezeichnet werden?
UV-Vis: Gitter oder Prisma als Monochromator verwenden. Schnelle Bewegung (Scan) des Monochromators ermöglicht es, dass unterschiedliche Wellenlängen durch einen Spalt auf die Probe fallen. Die Spaltbreite definiert dabei die Wellenlängengenauigkeit. Der Scan mehrerer Wellenlängen oder des gesamten Spektrums braucht Zeit => eher langsam. Gitter + Diodenarray–erfasst einen breiten Wellenlängenbereich gleichzeitig => schnell. Die Auflösung hängt dabei von der Zahl der Dioden ab.
Wie funktioniert eine Peak PurityAnalyse aufgrund von Chromatogrammspuren, die bei mehreren Wellenlängen aufgezeichnet wurden?
Zu jedem Messzeitpunkt wird der Quotient aus Signal 1 / Signal 2 berechnet => Bei einer Substanz muss dieser Quotient immer gleich sein => es ergibt sich eine Rechteckkurve. Überlagern sich Spektren verschiedener Komponenten im selben Peak –z.B. bei unvollständig getrennten Substanzen -ändert sich der Quotient im Verlauf des Peaks. Es entstehen Abweichungen von der Rechteckkurve.
Wozu kann 3D-Detektion / Diodenarraydetektionin der HPLC Analytik genutzt werden?
Anwendungen 3D-HPLC: Peakreinheitskontrolle, Identifizierung von Komponenten in komplexen Proben über Vergleich mit Spektrenbibliotheken.
Was ist der Vorteil eines massenselektiven Detektors?
Vorteil MS Detektor: sehr hohe Selektivität durch sehr kleine Massenungenauigkeit (< +/-0.5 Da oder besser, je nach Analysator) => hohe S/N-Raten bei komplexen Proben => gute Nachweissensitivität, Quantifizierung überlappender Peaks in UV-Spur über eindeutig zuordenbare Peakflächenin den Massenspuren. Zusätzliche Information zu Molekülstruktur 8bei MSMS) , geringe Analytmengen, sehr schneller Detektor, => breite Anwendungsmöglichkeiten (Forensik, Pharma, Lebensmittel, …
Skizzieren Sie den Grundaufbau eines einfachen Massenspektrometers und eines Tandem-MS Gerätes?
Probe wird in Lösung durch Kapillare gepumpt, die unter hoher Spannung steht ( z.B. +2000 V). An der Spitze der Kapillare tritt ein Tropfen aus, an dessen Oberfläche sich aufgrund der angelegten Spannung die entsprechend geladenen Ladungsträger sammeln ( positiv –Kationen / naativ–Anionen), um den größtmöglichen Abstand voneinander einzuhalten. Die Oberflächenladung nimmt zu, bis die Abstoßung größer wird als die Oberflächenspannung => dann zerreißt der Tropfen und es entsteht ein Spray aus kleinen Tröpfen => Taylor Kegel. Das Volumen der kleinen Tröpfchen sinkt durch Verlust des Lösungsmittels => Gasmoleküle schlagen bei Stößen mit TröfchenLösungsmittelmoleküle aus der Oberfläche heraus. Die Oberflächenladung der Tröpfchen steigt wieder an, bis die Ladungsabstoßung die Oberflächenspannung erneut übersteigt und noch kleinere Tröpfchen entstehen. Im elektrischen Feld zwischen Kapillarspitze und Einlass zum MS Analysator wandern Ionen in richtungMS Analysator. Am Schluss werden Lösungsmittelmoleküle durch Stöße mit Gasmolekülen von den Analytmolekülenentfernt. Geladenen Analytmolekülewerden durch das elektrische Feld ins Vakuum des Massenanalysators beschleunigt. Gasmoleküle werden durch einen Stickstoffgegenstrom am MS Einlass abgelenkt und gelangen
Wie funktioniert der ESI-Prozess (Elektrospray Prozess)? Beschreiben Sie in Stichworten.
Wie funktioniert die MALDI Ionisierung von Biomolekülen ? Beschreiben Sie in Stichworten
MALDI Prozess :Probe in hoher Verdünnung (1:1000 –1:10 000) mit Matrix mischen und auf leitfähigem Träger auskristallisieren lassen. Analytmolekülewerden in Kristallgitter der Matrix eingebaut. Träger mit kristallisierter Matrix in Vakuum der ionenquelle mit Laser beschießen (Wellenlänge = Absorptionsmaximum der Matrix). Die Matrixmoleküle absorbieren die Lichtenergeiund werden schlagartig zu Schwingungen angeregt, durch die der Kristall an der Auftreffstelle des Lasers verdampft. Die eingebauten Analytmolekülegelangen dadurch unzersetztins Vakuum und übernehmen von der Matrix Ladungsträger. Durch Stöße in der Matrixwolke bleibt in der Regel nur ein Ladungsträger auf dem Analytmolekül. Dadurch entstehen Analytionen, die im el. Feld zwischen Träger und Flugrohr(ca. 20 kV) beschleunigt werden..
Wie funktioniert ein Flugzeit Massenseparator??
Ionen werden in el. Feld der Quelle vor dem Flugrohrbeschleunigt. Alle Ionen erhalten dieselbe elektrische Feldenergie als kinetische Energie => kleine Ionen sind schneller als große, mehrfach geladene schneller als einfach geladene)–Stoppuhr startet bei Laserpuls und Ionisierung –Ionen fliegen dann in feldfreiem Vakuum mit konstanter Geschwindigkeit und erreichen den Detektor nach unterschiedlichen Flugzeiten. Die Flugzeiten werden für alle Ionensignale am Detektor gemessen. Aus Flugzeit und Anfangsbeschleunigung (el. Feldenergie) kann das m/z-Verhältnis der Ionen berechnet werden.
Welche Substanzen können von einem Brechungsindexdetektor, der allgemein auch als Universaldetektor bezeichnet wird –nicht detektiert werden?
Substanzen, die denselben Brechungsindex wie das Elutionsmittelhaben, könnten nicht detektiert werden. Da sich der Brechungsindex eines Lösungsmittels ändert, wenn Fremdsubstanzen enthalten sind ist dieser Fall prinzipiell zwar denkbar, aber sehr unwahrscheinlic
Skizzieren sie den schematischen Aufbau eines Diodenarraydetektors
Siehe Skript: Licht der Lichtquelle durchstrahlt die Probe und wird wirdan einem Gitter gebeugt. Langwellige Strahlung wird stärker gebeugt als Kurzwellige Strahlung. Das gebeugte Licht fällt auf einen Array aus Photodioden, die die Intensität des schmalen Spektralbereiches Bestimmen, der auf die Diode fällt ( z.B. 1024 Fotodioden für 512 nm= 0,5 nmpro Fotodiode). Der Diodenarrayerfasst
Beschreiben sie den Fragmentionenscanund den MRM Scan. Was wird zeitabhängig in Q1 und Q2 eines Tripel Quadrupol MS Gerätes gemessen? Nennen sie eine typische Anwendung.
Q1 filterdie Elternionenmasse aus MS Spektrum. Elternionwird in Stoßzelle fragmentiert und alle Fragmentmassenim Q3 analysiert. Beim MRM Scan wird nur eine starke FragmentionenmasseimnQ3 detektiert. Das spart Zeit, weil Q1 und Q3 nur bei einer Einstellung (= ein Übergang) messen. Moderne Geräte können ca. 60 solcher Übergänge pro Sekunde messen. Bspanwendung: Quantifizierung mehrere Wirkstoffe, Pestizide etcin Proben
Sie haben eine monolithische Trennsäule gekauft, mit der sie die bisherige Dauer ihrer HPLC -Trennung auf ihrer alten HPLC-Anlage von 60 min auf 20 min bzw. 10 min reduzieren können, wenn sie eine 3-fach bzw. 6-fach höhere Flussrate benutzen. Die gefundenen Peakflächen und Varianzen bei einer 5-fach Analyse derselben Standardprobe zeigt die Tabelle rechts. Haben sie eine Erklärung für die reduzierte mittlere Peakfläche und die steigende Varianz ihrer Messung? Bei einer 20-fach höheren Flussrate dauert ihre Trennung nur noch 3 min, sie sehen aber keine Peaks mehr. Was ist passiert? Erklären sie bitte das Phänomen.
Sie haben eine Trennung, bei der sie mit 5% ACN in Wasser starten und den Gradienten bis zu 80% ACN in Wasser erhöhen. Mit wässrigen Proben klappt die Trennung immer. Ihr Mitarbeiter analysiert Standdards, die er in 50% ACH in Wasser verdünnt hat und findet plötzlich breite, schlecht definierte Signale und eine enorme Streuung der Peakflächen, auch wenn er denselben Standdard mehrfach injiziert. Er will eine neue Säule für 850 € bestellen. Genehmigen sie die Bestellung?
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