Praktikum

Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO), andererseits aber auch die Vermehrung, Lagerung, Zerstörung oder Entsorgung einer gentechnischen Anlage sowie innerbetrieblicher Transport von GVO.

Organismen, bei denen das genetische Material mit Hilfe molekularbiologischer Methoden in einer bestimmten Weise verändert worden ist.

Plasmide, die genutzte werden, um Fremdgene in Bakterien einzubringen

Plasmide sind extrachromosomale, zirkuläre, doppelsträngige DNA-Moleküle, die in Bakterien natürlicherweise vorkommen und autonom replizieren (selbstvermehrend). Sie können zwischen Bakterien ausgetauscht werden und codieren für Gene, welche z.B. Antibiotikaresistenzen vermitteln.

• ORI (Origin of Replication): Replikationsursprung für die Vervielfältigung

• MCS (Multiple Cloning Site): ein Abschnitt mit einer Reihe von Restriktionsschnittstellen

• eine Antibiotikaresistenz für die Selektion.

Unter Klonierung wird in der Molekularbiologie das einbringen eines Fremdgens, also eines ausgesuchten DNA-Abschnitts (Inserts)und die anschließende Selektion und Vermehrung des neuen Plasmids in Bakterien verstanden.

Die Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren basiert auf dem Absorptionsmaximum der Nukleinsäuren bei 260nm. Die Absorption beruht hierbei auf den aromatischen Ring der Basen. Eine Lösung, die 50mg/ml doppelsträngige DNA enthält, besitzt einen Absorptionswert (OD-Wert/optische Dichte) von 1, bei einer Schichtdicke der Küvette von 1cm. Mit Hilfe dieser Vorgabewerte kann die Konzentration aus dem OD-Wert berechnet werden.

Verhältnis der OD260nm und der OD280nm (280nm Absorptionsmaximum von Proteinen) ist ein Maß für die Reinheit der DNA. Es geht daraus hervor, wie groß die Proteinkontamination ist. Eine proteinfreie Nukleinsäurelösung weist ein Verhältnis von 1,8-2,0 auf. Ist der Wert signifikant kleiner, könnte die Nukleinsäurelösung mit Proteinen kontaminiert sein.

1. Restriktionsverdau von Klonierungsvektor und Insert, 2. Ligation, 3. Transformation, 4. Selektion

Restriktionsenzyme sind molekulare Werkzeuge und stammen ursprünglich aus Bakterien. Sie schneiden DNA an spezifischen Schnittstellen. Dies sind meist Palindrome, d.h. Abschnitte des DNA-Doppelstrangs, die jeweils vom 5´ zum 3´ Ende jedes Einzelstranges gelesen, die gleiche Basensequenz haben. Jedes Enzym erkennt eine spezifische Sequenz. Dabei erzeugt es je nach Enzym entweder überhängende (kohäsiv, sticky), oder gerade Enden (blunt) mit chrakteristischer Sequenz.

Unter Transformation versteht man die Aufnahme von DNA in Bakterienzellen. Dazu müssen die Bakterien so behandelt werden, dass sie die Plasmide möglichst gut aufnehmen können, d.h. sie müssen „kompetent“ sein. In diesem Praktikum werden die Zellen durch Behandlung mit Calciumchlorid chemokompetent gemacht. Die kompetenten Bakterien werden dann mit dem Ligationsprodukt vermischt und einem Hitzeschock ausgesetzt, wodurch sie die DNA aufnehmen.

Bakterien ohne solch ein Plasmid können sich aufgrund der Zugabe von Ampicillin nicht vermehren. Kolonien von Bakterien, welche ein Plasmid aufgenommen haben, färben sich je nach Plasmid entweder weiß oder blau. Wurde das pUC19-Plasmid nicht verändert, werden die Kolonien blau. Das lacZ-Gen wird exprimiert und das zu den Platten gegebene X-Gal zu einem blauen Farbstoff abgebaut. Wird das lacZ-Gen durch eine erfolgreiche Ligation des Inserts zerstört, kann X-Gal nicht abgebaut werden und die Zellen bleiben weiß.

Mit dieser Methode können DNA-Fragmente von 0,5-25kb Länge voneinander getrennt und identifiziert werden. Die Auftrennung von Nukleinsäuren erfolgt innerhalb eines festen Trägermaterials in einem elektrischen Feld. Aufgrund der negativen Ladung wandern Nukleinsäuren in einem elektrischen Feld zu Anode.

  Zusammensetzung des Agarosegels: Agarose, Ethidiumbromid (Färbemittel für DNA), Ladepuffer

Diese Puffer werden verwendet, um die Dichte der DNA-Lösung durch die Zugabe von z.B. Glycerin zu erhöhen, damit die Lösung beim Auftragen in die Geltaschen absinkt und nicht in den Laufpuffer diffundiert

Die Größenbestimmung der DNA-Fragmente erfolgt über sogenannte Längenstandards (Marker), die Fragmente mit genau definierten Größen enthalten. Dieser Marker wird zusätzlich zu den Proben im Agarosegel aufgetrennt.

Eine Methode zur Transformation ist die Verwendung chemisch kompetenter Zellen.

Eine weitere Methode ist die sogenannte Elektroporation.

In diesem Praktikum werden die Zellen durch Behandlung mit Calciumchlorid chemokompetent gemacht. Die kompetenten Bakterien werden dann mit dem Ligationsprodukt vermischt und ein Hitzeschock ausgesetzt, wodurch sie die DNA aufnehmen.

Bei der PCR handelt es sich um eine komplexe Methode, bei der ein ausgewählter Abschnitt einer doppelsträngigen DNA-Vorlage (DNA-Template) vervielfältigt (amplifiziert) wird.

1. Denaturierung,  2. Annealing,  3. Elongation

Millipore-Wasser, Thermo-Pol-Puffer, dNTPs, Vorwärtsprimer, Rückwärtsprimer, Tag-DNA-Polymerase, DNA-Template

1.     Die SDS-Ployacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist eine Methode, mit der Proteine nach ihrer molekularen Masse aufgetrennt werden können. Ohne entsprechende Vorbehandlung weisen Proteine allerdings keine einheitliche Ladung auf, wodurch eine elektrophoretische Auftrennung nicht nur nach der Größe, sondern auch nach der Ladung stattfindet. Aus diesem Grund verwendet man das anionische Detergenz SDS, das Proteine mit einer negativen Ladung überdeckt. Außer SDS wird den Proteinproben b-Mercaptoethanol zugegeben, um Schwefelbrücken zwischen Cysteinen aufzuspalten. Nach dieser Vorbehandlung werden die negativ geladenen SDS-Protein-Komplexe nur noch in Abhängigkeit ihrer Molekülgröße im elektrischen Feld aufgetrennt. Durch Vergleich mit entsprechenden Molekulargewicht-Standards kann die Größe der einzelnen Proteinbanden bestimmt werden.

Coomassie-Brilliant-Blau ist ein Triphenylmethanstoff, der z.B. zum Anfärben von Proteinen verwendet wird. Er lagert sich an die basischen Seitenketten der Aminosäuren an und färbt damit Proteine unspezifisch an.

Im Praktikum werden Proteine geblottet, es wird also ein Western Blot durchgeführt. Dazu werden die durch eine SDS-Page der Größe nach aufgetrennten Proteine mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf eine Membran übertragen. Nachdem die Proteine übertragen sind, können spezifische Proteinbanden auf der Membran mittels Immundetektion sichtbar gemacht werden.

Um zu überprüfen, ob der Transfer der Proteine auf die Membran erfolgreich war, wird eine Ponceau-Färbung der Membran durchgeführt. Hierdurch können Proteine unspezifisch und reversibel angefärbt werden

1.     Um eine bestimmtes Protein auf der Membran spezifisch nachzuweisen, werden Antikörper gegen genau dieses Protein verwendet. Der Primärantikörper bindet spezifisch an das gewünschte Protein auf der Membran (1. Inkubationsschritt). Anschließend werden alle ungebundenen Antikörper abgewaschen. Daraufhin wird mit einem zweiten Antikörper inkubiert, dem sog. Sekundärantikörper (2. Inkubationsschritt). Dieser ist gegen das konstante Ende des Primärantikörpers gerichtet und bindet alle freien Enden, was zu einer Verstärkung der anschließenden Substratreaktion führt. An den Sekundärantikörpern ist ein Enzym gekoppelt, welches eine Substratreaktion katalysiert, die den Antikörperkomplex sichtbar macht. Im Praktikum wurden dafür Alkalische Phosphate verwendet. Bei der Substratreaktion wird entweder Licht frei oder es entsteht ein Farbniederschlag auf der Membran. Eine spezifische Bande wird genau an der Stelle sichtbar, an der sich das gewünschte Protein auf der Membran befindet.

Tris-Glycin-Puffer (Laemmli-Puffer) ist ein Elektrophoresepuffer, der in der Molekularbiologie im Zuge einer SDS-PAGE zur Trennung von Proteinen verwendet wird.

• Forschung

• Produktion

• Analytik/Sicherheit

• Tissue Engineering

Temperatur von 37°C,

eine bestimmte Luftfeuchtigkeit, um das Verdunsten des Mediums zu vermeiden (meist 70-100%).

komplexe Mischung von Glucose (Energiequelle), Vitaminen, Aminosäuren, Glutamin, Pyruvat, Nukleotiden, Spurenelementen usw.

Primärkultur: Stammt direkt aus Gewebe vom Organismus Zelllinie: Kontinuierliche, weitergeführte und verdünnte Kultur

HaCaT-Zellen (Human Adult, low Calcium, elevated Temperature), eine spontan immoralisierte, adhärent wachsende Keratinozyten-Zelllinie

eine aus humanen Leukämiezellen isolierte Suspensionszelllinie

Die Zellsuspension wird mit Trypanblau vermischt, wodurch tote Zellen angefärbt werden und so von den lebenden unterschieden werden können. Die Zählkammer besitzt ein Zählgitter, welches unter dem Mikroskop zu sehen ist. Das Zählgitter besteht aus 3 auf 3 Großquadraten, die jeweils eine Kantenlänge von 1mm, eine Fläche von 1mm2, und eine Höhe von 0,1mm aufweisen. Im Praktikum werden die äußeren vier Eckquadranten ausgezählt.