Molekulare Genetik

4.6 Mio Basenpaare (Mensch: 3,3 Mrd)

Sie assoziieren mit dem Chromosom und kompaktieren es

• HU bindet ds DNA ohne Spezifität, bildet helikale Filamente innerhalb der DNAhelix

• IHF(integration host factor) bindet an manche AT-reiche Sequenzen, erzeugt Biegung → wichtig für Regulation, Replikation und die Integration von λ-Phagen

• MukBEF (SMC Protein), gibt es auch in Eukaryonten. Nicht Sequenzspezifisch. Bindet DNA und vernetzt sie → stabile räumliche Organisation

topologically associated domain → funktionale Untereinheiten

gebildet durch SMC-Komplexe (structural maintenance of chromosomes)

Detektion durch Zerhackung und Wiederligierung → räumlich nahe DNA wird häufiger zusammenligiert

vermittelt die Fähigkeit zur Konjugation und Austausch von DNA

Das komplette Genom wird auf einen Empfänger übertragen, aber die Konjugation wird abgebrochen → wieviel wurde transferiert? Welche Funktionen kann das Bakterium noch benutzen?→ welche Gene liegen nah beeinander?

F- : kein Plasmid

F+ : Plasmid da

Hfr : Plasmid wurde ins Genom integriert

IS-Elemente sind Transposons und haben ein spezifisches Enzym für die Integration.

→ durch sequenzspezifische Integration kann man den Einbau extrachromosomaler DNA steuern

virulente Phagen führen zur lytischen Infektion → sofortige Replikation und Lyse (Freisetzung)

temperente Phagen können ihre DNA (eingebaut: Prophage) in das Wirtsgenom einbauen, sodass es mit dem Bakterium repliziert wird → lysogene Infektion

Sie stammt aus dem Bakteriophagen P1.

kann zwischen loxP (plasmid) und loxB (Chromosom) Und loxL (nach Einbauung linker Teil) und loxR (nach einbauung rechter Teil) Rekombination durchführen. Exision ist dabei effizienter als Integration, da die lox-Sequenzen nah zueinander sind.

Hitzeschock induziert cre, schneidet die funktionale Kopie von X aus dem Genom. Die Rückreaktion ist vernachlässigbar

Integrase und Excisionase sind zwei unterschiedliche Enzyme → Irreversible Reaktion. Hohe Effizienz in beide Richtungen.

Der lac-Repressor bindet an die Operatorsequenz hochspezifisch, wenn kein Laktose da ist, und blockiert Transkription der lac-Gene.

Durch die hochspezifische Bindung kann man den lac-Repressor und den tet-Repressor zur Kontrolle der Genexpression und Lokalisierung genutzt werden.

Eukaryontische Proteine sind oft toxisch für Bakterien → lasse den Stamm heranwachsen, und starte dann erst die Expression

fusioniere GFP mit dem lac-repressor, der hochspezifisch an DNA binden kann.

Bindet an die RNA-Struktur: Box B.

An das N-Protein kann man auch einen translationalen Repressor binden.

Sie erkennen kurze Sequenzabschnitte an beiden Enden des Transposons, schneiden dort, und setzen es woanders wieder ein. Normalerweise bleibt es bei einer Kopie die bewegt wird, aber durch Reparur des Ursprungs mit Rekombienation werden die Kopien vermehrt.

Ein autonomes Transposon stellt seine Transposase selber her.

Bei nicht-autonomen ist die Transposase defekt, aber das Transposon kann trotzdem bewegt werden, wenn es irgendwo eine funktionale Kopie gibt.

Durch Mutationen kann das Transposasegen neue funktionen wie Transkriptionsregulation gewinnen. So entstehen auf einen Schlag an viele neue Regulationsmöglichkeiten bei den anderen Transposonorten.

Sie kodieren reverse Transkriptase und Nickase und nutzen nach der Integration den Primer der Integrationsstelle. die Nickase erzeugt für die Integration ein freues 3’-Ende

‘immunsystem’ von Bakterien. Typ 2 Restriktionsenzyme schneiden an spezifischen, palindromischen Stellen. I. d. R. unterscheiden sie das zu schneidende Genom vom eigenen durch Methylierung.

150-500 kbp

Erstellung von Genombibliotheken zur Sequenzierung und Mapping

Komplette DNA-Virengenome in Bakterien vermehren und damit erforschen

PCR ist zu fehleranfällig. Zur Klonierung braucht man Bakterien.

BAC (abgeleitet vom F-Plasmid, aber für große DNA-Fragmente): keine Insertionssequenzen, aber Selektionsmarker.

PAC (abgeleitet vom Phagen P1): kann in hoher Kopienzahl in der Zelle vorliegen.

Kodiert ein Enzym, das aus Saccharose Levan macht, das für Bakterien toxisch ist -> Selektionsmarker, wenn es durch den Einbau des Inserts deaktiviert wird.

DNA-Transposons werden zufällig ins Zielgenom verteilt. Kann auch große Fragmente einbauen.

RecE/RecT(exonukleasen) und Red⍺/Redβ(single strand binding protein). Sind Phagenproteine.

Genutzt um DNA zu integrieren.

Die ausgetauschte Sequenz kann in beide Richtungen eingebaut werden.

Kann durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Sequenzen links und rechts verhindert werden.

18-20 Nukleotide.

Teil des Gatewaysystemse der Firma Invitrogen

Der Entry clone ist ein Plasmid, der von einer Fabrik hergestellt wird und dessen Integrationssequenzen dort getestet werden können. Man kann sie mit einer gewünschten Sequenz kaufen, die dann von den Insertsequenzen flankiert wird.

Enthalten auch schon Selektionsmarker.

Baue die att-Stellen innerhalb des ccdB-Genes ein. Wenn das Gen ohne den Insert in die Zelle kommt, wird ein toxisches Protein exprimiert.

Hefe bilden haploide Sporen aus -> diese haben beim Keimen nur einen Mating Type. Durch die Zellteilung entsteht eine zweite Zelle mit demselben Mating Type. Die Mutterzelle geht macht einen Mating Type Switch. Somit kommen zwei Zellen mit unterschiedlichen Mating Types zusammen, und es kann eine diploide Zelle entstehen.

Für den Mating Type Switch zuständig. Die Hefe hat 3 Sequenzen: HML und HMR sind epigenetisch ausgeschalten, kodieren für jeweils einen mating type. mat a/⍺ ist für den tatsächlichen Mating Type zuständig.

Die Endonuklease schneidet in der mat-Sequenz, die dann durch Rekombination entweder mit HML oder HMR repariert wird und so mat zum anderen Mating Type umschaltet.

Nuklease mit einer hochspezifischen langen Erkennungssequenz -> gezielte Schnitte in DNA

Nukleasen mit einer frei wählbaren Erkennungssequenz.

Nukleasen, bei denen der “Zinkfinger” die Sequenz erkennt. durch Aneinanderreihung der Zinkfinger kann man Spezifität erhöhen.

-> nicht komplett frei wählbare Sequenz, aber man findet meistens eine geeignete Bindungsdomäne. Problem: Spezifität muss immer geprüft werden.

Von einem Pflanzenpathogen genutzt (Piratenmodell!)

Haben einen repetitiven Abschnitt. Jeder Repeat erkennt ein Nukleotid -> Nach Baukastensystem zusammenbauen, spezifischer als CRISPR-Cas, aber aufwendiger

Inaktivierung eines Gens (wenn korrekt repariert wird, ist die Sequenz wieder Substrat der Nuklease)

Reparierung durch homologe Rekombination mit Donor-Molekül

-> e.g. genomic tagging

1000 nt pro Reaktion

cas Gen -> leader Sequenz -> CRISPR Abfolge (repeat, spacer, repeat…)

protospacer associated motif

(Extrasequenz für CRISPR-cas, schneidet nur, wenn vorhanden)

Spacer -> Phagenresistenz

Einige cas-Gene bauen neue Spacer neben der Leadersequenz ein.

Langes Transkript über den gesamten Locus, in dem sich die Repeatsequenz zur Haarnadel faltet und durch andere cas Gene gespaltet wird.

Die eigene DNA wird nicht geschnitten, da sie zum Repeat komplementär ist, oder, weil sie keinen PAM hat.

=> Informationsaufzeichnungssystem

Class 1: Nuklease mit mehreren Proteinuntereinheiten e.g CASCADE

Class 2: Nuklease mit einem einzigen Protein e.g. cas9

class 1 System: CRISPR-Cas-target-Komplex produziert Molekül, dieses aktiviert die Nuklease, die dann unspezifisch RNA abbaut.

class 2 System: cas13 wird durch guideRNA-targetRNA Erkennung aktiviert

spacer ist 21 nt lang, aber nur 12 davon müssen BP formen. + PAM => 14 Nukleotide (gut für Prokaryonten, noch nicht so gut für Eukaryonten)

Kombinierung von 2 Bindemodulen

Schneiden von DNA -> Inaktivierung durch fehlerhafte Rekombination

Fusion von dcas9 mit Repressor/Aktivator -> Transkriptionsregulation

Fusion mit fluoreszentem Protein -> stellen im Genom betrachten

Fusion mit Methyltransferase -> Chromatinstruktur verändern

• einen in der Zelle aktiven Promotor

• eine 5’-UTR, die die Erkennung des Startcodons erleichtert

• möglichst min. 1 Intron vor dem Stoppcodon

• eine 3’-UTR, vielleicht mit regulatorischer Funktion

• Polyadenylierungs-Signal

=> In cis auf derselben DNA-Strecke

DNA ist stark negativ geladen und muss durch eine hydrophobe Membran geschläust werden.

• (Mikroinjektion)

• CaPO4- vermittelte Transfektion

• Komplexierung mit kationischen Lipiden

• Elektroporation

• Viraler Gentransfer

CaPO4- ist unlöslich => bildet Niederschlag mit der DNA

=> kann durch Endocytose aufgenommen werden.

Problem: nicht sehr effizient, aber dafür Sehr Günstig.

Die kationischen Lipide bilden Liposomen/Mizellen weil sie sich an die negative DNA anlagern. Die Struktur ist dann Membranähnlich und kann von der Zelle durch Endocytose aufgenommen werden.

Vorteil: bis zu 90% Effizienz

Nachteil: Lipid kann toxisch sein, ist teuer

Ein starker Stromschlag macht die Membran kurzzeitig permeabel.

Vorteil: einfach anzuwenden

Nachteil: für manche Zellen, die zum Wachsen Spezifische Strukturen brauchen (adherente Zellen), schwer auszuführen. Nicht skalierbar.

DNA Viren, die die DNA aber nicht einbauen (episomale Vektoren)

oder RNA Viren, die RNA mithilfe von reversen Transkriptase ins Genom einbauen. Die viralen Vektoren können sich nicht mehr vermehren.

Vorteil: gute Effizienz, auch ausdifferenzierte Zellen können manipuliert werden.

Nachteil: mehr Aufwand, da die Viren erst erstellt werden mussten. Je nach Virus höhere Sicherheitsstufe, bei Integration kann es Mutationen geben.

zwei Viruslinien:

Helfervirus : kann replizieren, aber nicht verpackt werden (hat reverse Transkriptase und envelope)

Gentransfer-Vektor: kann verpackt werden, aber nicht replizieren (hat Verrpackungssignal und zu transferierende Sequenz

=> 2-Komponenten-System

Während der Mitose wird die Kernmembran aufgelöst und die DNA kann in den Zellkern kommen.

=> bei sich stark teilenden Krebszelllinien sind viel leichter zu transfizieren.

Bei viralem Gentransfer und manchmal bei Liposomen nicht nötig

Der Plasmid wird nicht mitrepliziert -> mit der Zeit wird die PlasmidDNA verdünnt.

=> Antibiotika-Resistenz-Selektion

Matrix Attachment Regionen aus DNA-Viren (dafür sind aber virale Protein nötig)

Retroviren bauen DNA direkt ein.

Sequenzspezifische Rekombinasen -> effiziente, gezielte Integration

Möglichkeit, eingebrachtes Gen gezielt zu regulieren

e.g. durch einen Hitzeschockpromotor

Am besten kommt es bei dem Regulator zu keinen anderen Veränderungen.

Wenn Tetracyclin da ist, werden Abwehrgene exprimiert, indem ein Protein an die tetO-Sequenz bindet.

-> das Protein, das an der DNA bindet (rtTA/tTA), konnte identifiziert werden. Es bindet nur an DNA, wenn Tetracyclin in der Zelle ist.

In Eukaryonten ist Tetracyclin nicht toxisch.

Tet-off:

Wenn Tetracyclin präsent ist, kann tTA nicht an tetO binden, und Transkription wird inhibiert.

Tet-on:

Wenn Tetracyclin präsent ist, kann rTA an tetO binden, und das Target Gen wird exprimiert.

Hormone (steroid-hormone) wirken durch Bindung an einen Kernrezeptor, dadurch Dissoziieren Chaperone, die die Interaktion mit der DNA verhinderten.

=> species-hopping für die Hormone, oder Fusion mit neuen DNA-bindenden Domänen

wird kaum noch verwendet

Stammt aus der Bäckerhefe

Kreuze Tier mit gewebespezifischem Promotor gefolgt von Gal4 mit einem mit UAS gefolgt vom Targetgen

=> gewebespezifische Expression

Ziel-DNA in das Genom von Keimbahnzellen (germ line) einbauen

2-Komponentensystem:

• Zielgen mit Transposaseerkennungsstellen

• Transposasegen

Integration mit kurzer Sequenzhomologie.

Alternative: sequenzspezifische Rekombinase statt der Transposase, und eine landing site (attP) im Genom (muss erstmal eingebaut werden) ->gezielte Integration

DNA wird in den Pronukleus einer befruchteten Eizelle injektiert -> Integration mit vielen Kopien, aber an zufälliger Stelle.

Retroviren werden in/an die Eizelle injiziert. Hohe Effizienz, niedrige Kopienzahl, aber zufällig.

modifizierter Zellkern wird in eine entkernte Eizelle injiziert.

Untersuchung von gewebespezifischer Expression, oder Genfunktion durch Misexpression, oder gain-of-function Phänotypen

Einem Gen eine Funktion zuordnen.

Indem man zufällig Sachen kaputt macht, schaut, was nicht mehr geht, und rausfinden, was man kaputt gemacht hat wenn’s interessant war.

Manche Gene sind zur Proliferierung nötig, und wenn sie kaputt sind, können sich keine neue Zellen entwickeln -> sehr wenig Volumen für Experimente

-> Lösung: Konditionelle Mutation wird nur nach Stimulus angeschaltet

Durch Meiose bilden sich haploide Zellen, die dann immer den Genotyp exprimieren (nichts mit hetero/homozygot)

Der Arrest an einer bestimmten Stufe des Zellzykluses kann man durch Morphologie erkennen (i.e. wenn Zellen mit einer Mutation auf einmal alle in der S-Phase bleiben ist was bei der DNA-Synthese falsch gelaufen)

HIS4 kodiert für ein Enzym (His4p). Wenn His4p mit einer Signalsequenz fusioniert wird, wird es in Organellen gespeichert -> Zelle kann ohne His4p’s Produkt (Histidin) nicht mehr produzieren und wächst nur auf einem Medium mit Histidin.

-> Mutagenese, Screening, wenn Zellen plötzlich ohne zusätzliches Histidin wachsen können, ist was im Membrantransport passiert, weil His4p nicht in die membranumhüllten Organelle gekommen ist.

1) Kreuzen mit dem Wildtyp.

2) Sporuliere heretozygote Diploide Zellen. Wenn nur ein relevantes Gen mutiert ist, sollte der Phänotyp 2:2 verteilt sein.

Kreuze rezessive Mutanten untereinander zu heterozygoten Diploiden. Wenn es keine Komplementation gibt, betreffen beide das gleiche Gen

Wenn Komplementation stattfindet, dann sind beide Mutationen für verschiedene Gene

Transformiere mit Plasmiden mit unterschiedlichen Genomfragmenten -> welches Plasmid komplementiert?

Zufällig Genom schneiden und mit shuttle vektoren ligieren. Screen, ob etwas eingebaut wurde.

Durch 1) ein temperatursensitives dominantes lethales gen und 2) ein homozygot lethales gen, das einen dominanten Marker trägt.

weibchen mit 1,2 x männchen WT

=> nur tiere ohne 1, also mit 2 überleben, mutagenisiere diese.

x weibchen mit 1,2

=> nur tiere mit der WT Mutation und 2 überleben

x geschwister

=> aussortieren der heterozygoten Tiere durch Marker

=> => sterben Embryos, die homozygot sind? Dann war das Gen für die Entwicklung wichtig

• High copy suppression: es ist genug B da, damit trotzdem oft genug interagiert wird

• Extragene Suppression: B mutiert auch

Nur eine Mutation von sowohl A als auch B tödlich. Mit nur einer Mutation von A oder B überleben Zellen

• A und B sind redundant

• A und B interagieren

• A und B sind Teil desselben Pathways

X fusioniert mit DNA-bindende Domäne

Y fusioniert mit Transkriptionsaktivierender Domäne

Y-X bindet -> Transkription eines Reportergens

Die beiden untersuchten Proteine müssen im Zellkern interagieren. Die interagierenden Proteine dürfen alleine nicht Transkription aktivieren oder an DNA binden.

binden an RNA und stoppen Translation -> RNA wird abgebaut

Führen zur Spaltung der RNA, an die sie binden.

Zellen müsssen nicht transgen verrändert werden.

Reparation eines Doppelstrangbruches mit dem homologen Chromosom

+ in Meiose

Kann für den gezielten Einbau von Sequenzen im Genom genutzt werden, indem ein Plasmid mit Homologiearmen un der einzubauenden Sequenz eingeführt werden.

linker Homologie-arm | selektionsmarker, sequenz | rechter homologiearm | antiselektionsmarker

-> sicherstellen, dass sequenz auch wirklich eingebaut wurde, und, dass nicht der gesamte Vektor eingebaut wurde.

In einem Exon, das essentiell ist, und auch nicht durch alternatives Splicing weggespleißt werden kann, wird ein Stoppcodon eingefügt. Sollte möglichst weit vorne in der Sequenz sein. Das Stoppcodon sollte in allen 3 Reading frames eingefügt werden.

füge zusätzlich zum selektionsmarker und zum funktionierenden exon loxP-Sequenzen ein + gewebespezifischer Promotor für cre-Rekombinase

-> wenn cre-Rekombinase exprimiert wird, wird das gesamte Exon ausgeschnitten.

• Definiert, wo mutiert wird, aber nicht wie

• exakte Mutagenese nicht reproduzierbar

• Nur Funktionsverlust möglich

• Manchmal findet kein Frameshift error statt -> funktioniert trotzdem

• bei noncoding RNA-Genen sind kleine Mutationen nicht wichtig

• Je nach Effizienz überleben Tiere in der ersten Generation nicht

cas9-CRISPR auf erste Zellen für mehrere Gene

-> F0: Mosaiktiere

-> F1: Selektiere Tiere mit Mutationen in allen gewünschte Genen

-> F2: Bruder x Schwester -> homozygot mutante Allele von multiplen Genen

Designernuklease spaltet spezifisch

+ HR Donor Konstrukt

-> einbau der gewünschten Sequenz mittels flankierender Homologie

Spezifität sehr wichtig -> Problem bei repetitiven Sequenzen

Beeinflusst Chromatinstruktur

Effizienz nicht immer ausreichend um alle loci zu verändern.

Klonierung durch somatic cell nuclear transfer (e.g. Dolly)=

Wie kann man neue Funktionalitäten erkennen?

Viele neue Sequenzen in silico generieren, struktur vorhersagen, und prüfen

mit Proteinfamilie abgleichen, was die beste Bindungstasche hat, systematisch erweitern und faltung vorhersagen

Seitenkettenorientierungen simulieren -> was stabilisiert den übergangszustand am besten?

-> Tuning auf stabilität, massives screening

-> nochmal optimieren

-> biologische Tests und validierung

Stoffwechselwege mit ähnlichen Produkte betrachten. Abbau vom Produkt inhibieren(leicht), produktion erhöhen (schwer)

Bei bestimmten Allelkombinationen sterben Geschlechtszellen ab.

Nukleasen, die zu einem homozygoten allel führen

Von der Generationszeit, denn es werden keine erwachsenen Organismen verändert.

Es werden nur bestimmte Allele vererbt (e.g. durch homing-nukleasen oder meiotic drive). Das geht besonders gut mit CRISiPR-cas9

Ein einziges entkommtes Allel kann sich auf die ganze Population übertragen

Eine Spezies ausrotten, abschwächen, oder mit neuenFähigkeiten ausstatten

wenn die Nuklease und die guideRNA an unterschiedlichen Stellen auftauchen, verlieren sie nach einigen Generationen ihre Wirkung.

Genetisch hetergene Individuen sequenzieren

Polymorphismen identifizieren

Ordnung der Individuen nach der quantifizierten Eigenschaft

Elternindividuen sequenzieren und kreuzen

Nachkommen nach eigenschaft sortieren

sequenzierung der selektierten Population (+ kontrolle)

Analyse: welche Polymorphismen wurden angereichert?

Sie irgendwie auf ein Genom bringen (durch zufällige Meiotische Rekombinatin oder durch induzieren von Brüchen)

Per Durchflusscytometer Zellen sortieren. Man kann auch sequenzieren, um Zelltypen zu identifizieren. Dazu muss man nur einige Zelltypmarkierende Marker kennen.

Erfindung von Datenpunkten zur besseren statistischen Analyse. Insbesondere gut für single cell sequencing.

Wenn ein Gen sich expressionsmäßig so verhält wie ein bestimmter Zelltypmarker, ist es vielleicht insbesondere in diesem Zelltyp wichtig.

Fluorescence activated cell sorting

Heterogenität führt zu streuung von Messwerten, dadurch kann man experimentell provozierte Unterschiede nicht mehr messen.

Synchronisierung durch Zugabe von messengern, Zentrifugale Trennung durch Gewicht

Bei einem Durchfluss von Zellen werden Unterschiede im Streulicht und in der Fluoreszenz gemessen. Zellen können dann durch ein Magnetfeld getrennt werden, manchmal reicht aber auch nur die Quantifizierung der Zellarten.

Alle Zellen machen Streulicht -> Sortierung nach Größe

Mit GFP Fluoreszenz markierte Zellen sortieren, die dann auch entlang einer anderen Eigenschaft sortiert werden können. -> Multidimensionaler Phänotyp

17 Gb

Sie haben viele repetitiven Sequenzen.

Modell für viele Pflanzen, inklusive Brassicaceen (Kreuzblütler, die viel kultiviert werden)

Einfach Kultur (wächst nur 20-30 cm, lässt sich im Regal kultivieren)

Kurze Generationszeit (2 Monate)

einfache Genetik (diploid, selbstbefruchtend)

sehr kleines Genom (5 Chromosomen, 157 Mbp)

genetisch transformierbar (floral dip)

Genduplikationen (homologe Bereiche) über alle 5 Chromosomen

Brotweizen enthält eine Fusion von 3 Vorläufergenomen: A B und D

Genom-spezifische Expression dominiert das Clustering von Gruppierungen nach Zelltyp und Stadium, i.e. Gene die in denselben Situationen exprimiert werden, werden auch von demselben Genom exprimiert

Physikalisch: Ballistisch, DNA Präzipitation

Biologisch: durch Agrobacteriuim tumefacies -> DNA wird in Zellkern eingebaut. Vererbung nur durch Einbau in Vorläuferzellen für Gameten

Die Blüte wird in eine Suspension von Agrobacterium tumefacies getaucht. Das Bakterium infiziert die Blüte durch Mikroverletzungen, insbesondere die Gameten -> Vererbung des transgenen Genoms auf Nachkommen. Es werden nur die Eizellen/Ovulen transformiert.

Resistenz gegenüber Herbizid

GFP in der Samenschale durch Samenschalenspezifischen Promotor. Wenn die Samen alle denselben Phänotyp haben, hat man homozygote Samen. Wenn 3:1 unterschiedliche Phänotypen da sind, sind die Samen hemizygot.

Forward: Phänotyp -> erzeugt von welchem Genotyp?

Reverse: Genotyp -> erzeugt welchen Phänotyp?

Inverse PCR kann identifizieren, wo DNA eingefügt wurde. Man kennt die Sequenz des insertierten Stückes, nicht die der Flankierenden Region -> Wir brauchen Sequenzierung in beide Richtungen, aber das geht mit nur PCR nicht, da wir nicht wissen, wie die Sequenzen links und rechts der Insertion aussehen, d.h. man kann keine Primer dafür entwickeln.

1. Verdau mit Restriktionsenzymen, das in einer bekannten Sequenz in der Insertion schneidet

2. Verdünnung und Zyklisierung mit Ligase

3. PCR Amplifizierung

4. Jetzt haben wir DNA flankiert mit Stücken aus der Insertierten Sequenz

5. Vergleich mit Genomsequenz.

Man kann Mehrfach und Doppelmutanten erzeugen, z.B. bei benachbarten homologen Genen

Mit CRISPR kann man spezifisch eins ausknocken.

Das MLO Membranprotein ist scheinbar ein negativer Regulator gegen den Pilz -> Pflanzenlinie mit dieser Mutation -> Pflanze ist gegen Mehltau resistenter.

Weizen hat wegen seiner Hexoploidität 3 Kopien von MLO. Diese kann man nicht zufällig alle ausschalten. ->e.g. Genomeditieren durch Nukleasen

ein Endogenes Signalmolekül, das pflanzliche Pathogenaktivität aktiviert.

Biotrophe Pathogene brauchen lebende Pflanzenzellen, um zu überleben -> Töte Zellen um die Infektion

-> Salicylatabhängige Abwehr

Necrotrophe Pathogene ernähren sich von totem Gewebe

-> e.g. Verstärkung der Zellwand

Jasmonat-abhängige Abwehr

Merken, dass ein Molekül oft unter einer Bedingung auftritt -> Knockout oder konstitutive Überexpression.

-> Welcher Phänotyp?

-> Welche Substrate hat das Enzym?

-> Metabolische Veränderung in der Zelle mit Massenspektrometrie messen

-> Welches sieht man im KO nicht, aber in der ÜE schon?

Das Gen wird permanent angeschaltet.

Massen (m/z Werte) mit ultra-hohen Genauigkeiten -> durch die Nachkommastellen kann man herausfinden, wie die Summenformel des Moleküls aussehen muss

Nicht immer, denn man kann vielleicht im Modell ein spezifisches Enzym aus einer Familie mit einer wichtigen Funktion identifizieren, aber in Weizen kann man nur Vertreter der Famile finden, nicht aber ein gleich aussehendes Enzym.

Vergleich von Modernen und Herbariumgenomen

In etwa eine Mutation per haploidem Genom & per Generation

Durch das große Weizengenom: etwa 200 Mutation/Generation

10^(-8) pro Basenpaare * Generation