Unterschied Nucleosid und Nukleotid
Nukleosid:
Zucker und Base
Purine
Adenosine/ Deoxyadenosine (in Adenine)
Guanosine/ Deoxyguanosine (in Guanine)
Pyrimidin
Cytidine/ Deoxycytidine (in Cytosin)
Thymidine / Deoxythymidine (in Thymin)
Uridine
—> alles mit Deoxy davor ist in der DNA, das andere in der RNA
Nukleotid:
Zucker Base und Phosphat
Andenylate/ Deoxyadenylate
Guanylate/ Deoxyguanylate
Cytidylate/ Deoxycytidylate
Thymidylare/ Deoxythymidylate
Uridylate
Nukleotidanlagerung
Synthese: 5’—>3’ Richtung
Whrend der Anlagerung an das 3’ ende wird Pyrophosphat von angelagerten Nukleotid abgespalten
Die Bindung zwischen Phosphat und den jeweiligen Zuckern (hier Desoxyribose sind Phophordiesterbindungen)
Ester:
allgemein: ein Alkohol
Hydroxygruppe und eine Säure
Nucleosom
8 histonenmoleküle bilden Histonenkern (core)
146 Basenpaare (1,65 Drehungen) winden sich um den core
Zellaufbau Pilze, Pflanzen, Tiere Prokaryonten
Endoplasmatisches Retikulum
Membranystem im Cytosol
Funktionen:
u.a Lipidsynthese (glattes ER)
Materialtransport innerhalb. der Zelle
Calciumspeicher (komplexiertes Calcium z.B. mit Oxalat)
Raues ER:
mit Ribosomen als ort der Proteinsynthese (Translation)
Lysosome
zur verdauung von in den Körper gelangten Fremdkörpern
im Cytoplasma
sind Vesikel
in tierischen Eukaryontischen Zellen
= nicht in Bakterien oder Pflanzen
enthalten Verdauungsenzyme (hydrolytische Enzyme, Lipasen, Proteasen, Nukleasen)
Enzyme bei pH 4-5 aktiv
eine Membran
schnüren sich vom ER über den Golgi-Apparat ab
auch anA poptose (programmierter Zelltod) beteiligt
Bestandteile Zellwand
verschiedene Versionen um DNA zu isolieren
Isolierung von genomischer DNA: Zellaufschluss (siehe Proteinase K-Aufschlussmedium)
Isolierung von DNA: Ethanolpräzipitation (Nukleinsäurefällung)
Alternative zur Präzipitation: Zugabe monovalenter Kationen, z.B. durch Natriumacetat (Nukleinsäuren werden entladen)
Isolierung von DNA: Abtrennung von Proteinen (Proteinfällung)
Proteinase K-Aufschlussmedium = Puffer
Ziel:
gigantisch lange Moleküle aufreinigern, ohne alles kaputt zu machen
DNA erhalten
DNAsen inaktivieren
weitere Stoffe wie RNA, Proteine usw. entfernen
neutralisiert den PH-Wert
löst polare sachen
zur DNA Stabilisierung
Zusammensetzung:
100 mM NaCl
NaCl um eine gewisse Ionenkonzentration vorzugeben
Einstellen einer bestimmten Osmolarität, Salzkonzentration, wirkt auch auf die Ladung der DNA
10 mM Tris HCl pH 8.0
Tris, Puffer, welcher den PH Wert stabilisiert, kann auch HEPES, MEs oder K-Phosphat sein; können verschiedene Stoffe sein, solange sie den PH bei einem gewissen wert halten
50 mM EDTA pH 8.0
ETA: Komplexfilter mit 2 wertigen Kationen Magnesium soll weggefischt werden
DNase ist Magnesium abhängig und da wir die DNase hemmen wollen, wird eta eingesetzt um Mg wegzubekommen
0,5% SDS
SDS (Sodiumlaurylsulfat): um Proteine zu denaturieren
20 μg/ml RNase A
RNase A: RNA Abbau
0,1 mg/ml Proteinase K
denaturiert Proteine
Proteinase K: Proteinabbauendes Enzym; DNase soll abgebaut werden
Abtrennung von Proteinen (Proteinfällung): unterschiedliche Löslichkeiten: Phenol, Chloroform = Proteine werden von Nukleinsäuren getrennt.
Wässrige Phase: Gewebe mit DNA und allem anderen
Zugabe organisches Lösungsmittel (Phenol = (relativ giftig) löst apolare Sachen)
Ist schwerer = unten
Alles wird gemischt; dann zentrifugieren: 3 Phasen entstehen
Wässrige Oberphase (mit D NA, Zucker usw. also alle lösliche Metabolite)
Interphase (denaturierte Proteine)
Organische Phase: Phenol (alle Lipophilen Stoffe gelöst, z.B. Lipide, Chlorphphyll)
Proteine sind weniger hydrophil, gehen daher eher in die organ. Phase, während Nukleinsäuren (Phosphatgruppen) in der wässerigen Lösung bleiben.
Obere wässrige Phase wird abgenommen und mit etwas Chloroform (organisches Lösungsmittel) gemischt um Phenolreste zu entfernen
a) Zugabe von etwa 3-fache Volumen absoluten Ethanols
b) Zentrifugation
c) Nukleinsäuren präzipitieren
d) Das Nukleinsäurepellet ist meist am Boden des E-cups sichtbar
e) Danach mehrmals waschen des Pellets mit 70%igem Ethanol
f) Nukleinsäure in Wasser lösen
Ziele der DNA Reinigung
Entfernen von Proteinen in den unterschiedlicen Stifen der Reinigung
Proteinverdau (Proteinase K)
durch Ausnutzen der unterschiedlichen Löslichkeit (Schichten)
Einsetzen von organ. Lösungsmitteln Phenol, Chloroform; verwendet, um Proteine von Nukleinsäuren zu trennen: Proteine sind weniger hydrophil, gehen daher eher in die organ. Phase, während Nukleinsäuren (Phosphatgruppen) in der wässerigen Lösung bleiben.
Verwendung von Säulen (bei den meisten Kits)
Hemmen von DNA Abbau
Proteinabbau (siehe oben)
Mg 2+ wegfischen 2.3.
weitere Dnase-Inhibitoren
Scherkräfte bei der Isolierung von hochmolekularer DNA vermeiden!
Kann aber auch bei der Isolierung von Plasmid-DNA ein wichtiger Parameter sein!
abgeschnittenen Pipettenspitzen, NICHT vortexen, usw.
verschiedene Methoden DNA Isolation
BSP Rechnung
Beispiel: Ein 2kb-Fragment einer doppelsträngigen (ds) DNA ist in 500 μl Wasser gelöst
Aufgabenstellung: Berechnen Sie aus dem UV-Spektrum
1. die DNA-Menge
In eine Küvette (Schichtdicke d= 1 cm) wurden 5 μl Probe und 95 μl Wasser pipettiert Die Probe wurde vorher zusätzlich 1:5 verdünnt Gemessen wurde eine OD260 nm von 0.12
Demnach liegt in der Probe eine Konzentration von 600 μg/ml vor. (0.12 x 50 μg/ml x (100/5) x 5)
Die Gesamtmenge der DNA beträgt 300 μg ( die DNA war anfangs in 500 μl = 0,5 ml gelöst) .
BSP Rechnung 2:
Quantifizierung/ Stoffmengenkonzentration
Beispiel: Ein 2kb-Fragment einer doppelsträngigen (ds) DNA mit der Konzentration 600 μg/ml Aufgabenstellung: Berechnen Sie 2. die Stoffmengenkonzentration (mol L-1; „Molarität“ bzw. in μmol/l = μM).
Die Länge der DNA beträgt 2 kb.
MW 1bp ~ 650 Da (d.h. ein Basenpaar einer Nukleinsäure hat die durchschnittliche Formelmasse von 650 Dalton)
Das Molekulargewicht eines bp beträgt auch 650 g/mol 2000 bp x 650 g/mol = 1.3 x 106 g/mol bei einem Fragment von 2000 bp
= 1.3 x 106 μg/μmol bei 600 μg/ml (siehe vorherige Seite)
600 μg/ml / 1,3 * 106 μg/μmol = 0,00046 μmol/ml = 0,46 μmol/l = 0,46 μM 20
n= m/M Stoffmenge = Masse/Molmasse c = m/M*V Stoffmengenkonzentration = Masse/Molmasse * Volumen
reinheit dna
ReineDNA-Lösung OD 260nm =1,8 280 nm
Reine RNA-Lösung OD 260 nm = 2,0 280 nm
Bei Proteinverunreinigungen ist der Wert niedriger
alkalische Lösung (pH 8-8,5) in Na2HPO4 (dinatriumhydrogenphosphat)
PCR Allgemein
Ziel: Amplifizierung von Nukleinsäuren in einem zyklischen Prozess ( 1DNA Abschnitt —> 10^12)
Ablauf
Isolierung von DNA (=Template)
wahl der passenden Primer
PCR- ABlauf
PCR Ansat im Ecup (Template, zwei Primer, dNTPs, thermostabile DNA-Polymerase, Mg2+ Ionen usw.)
Temperatur-Zeit Profil des PCR Gerätes
PCR Ansatz
Ansatz im E-cup (ca. 20 μl gesamt):
a) Puffer
b) dNTP-Mix (200 μM) (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
c) MgCl2 (0,5-5 mM)
d) spez. Oligonukleotid-Primer Primer 1 und Primer 2 (= foward und reverse Primer) (je 10-100 pmol)
e) DNA (Template) (1 ng bei Plasmid DNA, 1 μg bei gDNA)
f) Enzym: thermostabile DNA-Polymerase, z.B. Taq (aus Thermus aquaticus, 1 Unit), Aktivität ca. 1000 Nukleotide pro min (1 kbmin)
PCR Ablauf
Denaturierung der DNA (z.B. 94oC, 30 sec)
Primer-Annealing (Anlagerung) - Primer binden an Matrize (z.B. 58oC, 30 sec)
- die Spezifität der Bindung abhängig von Primern, Salzkonzentration und Temperatur
Verlängerung bei der opt. Arbeitstemperatur der Polymerase (z.B. 72oC) die Länge dieses Schritts hängt von der Länge des Produkts ab (ca. Polymerase 1 min pro kb)
Am Ende noch ein längerer Verlängerungsschritt (z.B. 72°C, 5 min), damit alle noch unfertigen DNA-Stränge die volle Länge erreichen
Primer Annealing
Primer-Annealing-Temperatur abschätzen
die Spezifität der Bindung hängt von der Salzkonzentration und von der Temperatur ab
die Annealing-Temperatur abhängig vom Primer
-Annealing-Temperatur = Schmelztemperatur – 3 °C (Tann ca. Tm – 3°C)
die Schmelztemperatur aus der Länge und dem GC-Gehalt eines Primers berechnen Anzahl G und C * 4 Anzahl A und T * 2 Zahlen summieren = ungefähr Schmelztemperatur
PCR: Primer Design, sozusagen das A und C
Spezifische Primer:
Primer = Oligonukleotide , welche komplementär zu einem Teil der zu vervielfältigen Nukleotidsequenz sind
es geht um die Amplifikation einer bekannten Sequenz
Primer sollten spezifisch sein!
beide Primer sollten +/- dieselbe Schmelztemperatur haben • Primer sollten keine internen Strukturen bilden
es kommt besonders auf die Bindung am 3'-Ende des Primers an
50% GC bei den letzten 6 Nukleotiden
Primer sollten auf G oder C enden
Oligonukleeotide = aus wenigen Nukleotiden (DNA oder RNA) aufgebaute Oligomere
spezifische Primer
design degenerierter Primer
Quantifizierung: alles wichtige zu UV-Spektoskopie
Messung bei 260nm am Photometer
in Quarzküvetten (absorbieren kein UV-Licht)
Absorptionswert vin 1 (optische Dichte OD=1) = ca. 50 Mikrogramm DNA/ml
1 OD bei 260nm :
dsDNA: 50 Mikrogramm DNA/ml
esDNA: 40 Mikrogramm DNA/ml
RNA (es): 33 Mikrogramm DNA/ml
Absorption durch die aromatischen Ringe der Basen
Genetischer Code
pcr anwendung
1. Methodisch:
Einbau von Funktionselementen (DNA-Abschnitte)
Fusion von 2 DNA-Fragmenten
Entfernen eines DNA-Abschnittes
Einbau eines DNA-Abschnittes
Amplifizierung von DNA-Abschnitten
Abb. Alberts Molecular Biology of the Cell
Abb. Quelle: Wikipedia
2. Anwesenheit bestimmter Gene bzw. Expressionsniveau
Degenerierte Primer zur Suche nach Genen, die für die selbe Genfamilie kodieren
Vervielfältigung RNA (RT-PCR): Genexpression, RNA-Nachweis
3. Medizin,Pflanzen-,Lebensmittel-Umweltanalytik
Zusammenhang Funktion/Erscheinung und DNA-Sequenz
Krankheitsbild und DNA-Sequenz
Überprüfung von Material auf Anwesenheit transgener Pflanzen
Überprüfung von Material auf Gegenwart infektiöser Keime
Restrictions Fragment Längen Polymorphismus (RFLP)
z.B. Blut vom Tatort und eines Verdächtigen
DNA wird isoliert
Proben-DNA wird mit verschiedenen
Restriktionsenzymen verdaut
Auftrennung der Fragmente mit Gelelektrophorese
Transfer der Fragmente auf Membran
Hybridisierung mit geeigneter Sonde
Veränderungen im Bandenmuster zeigen Mutationen
Vorteil:
komplexe DNA-Gemische (Blutproben) können direkt ohne Aufreinigung analysiert werden
Nachteil:
nur relativ große Mutationen (Deletionen, Insertionen) werden nachgewiesen. Punktmutationen nur wenn Restriktionsenzym-Schnittstelle geschaffen oder zerstört wird
Anwendung:
Diagnostik
Sichelzellenanämie:
Fragment mit 13 kbp bei 70% aller Kranken, nur bei 3% Gesunder zu finden
Mukoviszidose: 75 % aller Kranken zeigen gleiches Muster
Forensik:
Mutterschafts- und Vaterschaftstest (DNA-Fingerprint Nachweis von Mutterschaft – für Einbürgerung in England) DNA-Fingerprints aus Spuren am Tatort
Heute eher PCR
southern blot
1. Die DNA wird mit gleichen Restriktionsenzymen geschnitten. Dadurch entstehen unterschiedlich lange Fragmente – (Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP).
2. Die Fragmente werden elektrophoretisch auf einem Gel aufgetrennt
Die im Elektrophoresegel vorhandenen DNA-Fragmente werden durch eine alkalische Pufferlösung einsträngig gemacht.
3. Die DNA wird vom Gel auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran übertragen (geblottet) und durch Wärme fixiert.
4. Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte: Hybridisierung mit Sonden a) Radioaktive Methode:
Die auf der Membran fixierten Fragmente werden in eine Lösung mit radioaktiv markierten einsträngigen DNA-Sondenmolekülen, die einem gesuchten DNA-Abschnitt komplementär sind, gegeben. Die Sonden binden an die spezifischen Fragmente auf der Membran (falls vorhanden) und die ungebundenen Sondenmoleküle werden abgespült
Veraltete Nachweismethode: Die Membran wird auf einen Röntgenfilm gelegt. Nach der Filmentwicklung wird die markierte DNA als schwarze Bande erkennbar.
b) DIG-Markierungsmethode: Die auf der Membran fixierten Fragmente werden in eine Lösung mit DIG markierten einsträngigen DNA-Sondenmolekülen, die einem gesuchten DNA-Abschnitt komplementär sind, gegeben. Die Sonden binden an die spezifischen Fragmente auf der Membran (falls vorhanden) und die ungebundenen Sondenmoleküle werden abgespült Die Fragmente auf der Membran werden durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht
Vektortypen zur Klonierung
Expressionsvektoren
Klonierungsvektor, der u.a. einen wirtseigenen Promotor enthält. Dieser liegt meistens knapp oberhalb („stromaufwärts“) derRestriktionsschnittstelle, in die der kodierende Bereich eines Gens im richtigen Leserater eingesetzt werden kann.
Wirtszellen
a) Prokaryonten: Bakterien keine posttranslationale Modifikation der Proteine
wenn ein eukaryontisches Gen hier eingesetzt wird dann kann dieses transkribiert und translatiert werden, allerdings fehlt in den Bakterien oft das Spleißsystem, sodass das codierte Protein nicht generiert wird
große Polypeptidketten werden of nicht synthetisiert
Glykolisierung und Phosphorylierung der Proteine ist oft nicht entsprechend
—> aus den Gründen werden oft Hefezellen angewendet wenn eukaryontische DNA repliziert werden soll
b) Eukaryonten: Hefen (enthalten auch Plasmide!) „Shuttle“-Vektoren können sowohl in Bakterien wie in Hefen vermehrt werden. posttranslationale Modifikation der Proteine (jedoch anders als bei Tieren/Menschen und Pflanzen)
DNA Enden nach Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
Ereknnungssequenzen: sind Palindrome, hei0t sie können von vorne oder hinten gleichermaßen erkannt werden
bezeichnung von Restriktionsnukleasen
Typen von Restriktionsendonukleasen
Selektion Antibiotika
Struktur des X-Gal und Reaktion
Selektion, da nur wenige Wirtszellen rekombinante DNA enthalten
Menge Agarosegel
je größer die DNA, desto kleiner der Prozentanteil an Agarose
5-60kb DNA—> 0,2 Prozent Agarose
wo kommmt welche RNA vor?
Aufbau RNA
Häufig sekundarstrukturen:
Hairpin
loop
Nukleotid besteht aus Ribose, Base und Phosphat
Funktionen von RNA
Informationsträger zwischen DNA und Protein (
mRNA (von DNA zu RNA)
tRNA (mRNA zu Protein) —> AS Bildung
Regulation (kleine regulatorische RNA-Moleküle, lange nicht-codierende RNAs)
Strukturkomponente von Riboproteinen (rRNA, snRNA)
Katalyse (Ribozyme, snRNA, rRNA)
häufig sekundarstrukturen:
loop und hairpin
Aufbau eukaryontisches gen
Cis Elemente (sind Teil der DNA):
Enhancer (positive Regulation; Aktivatorproteine binden) wirken verstärkend auf Core Promotor (Kern Promotor) --> Gen wird stärker abgelesen
Silencer (negative Regulation; Repressorproteine binden) wirken abschwächend auf Core Promotor (Kern Promotor) --> Gen wird schwächer abgelesen
Trans Elemente (Transkriptionsfaktoren) regulieren cis-Elemente: (meistens Proteine)
Transkriptionfaktoren: Proteine, die abschwächend oder aktivierend auf cis Elemente einwirken
wenn Signalkette stattgefunden hat und
Regulation über Transkriptionsfaktoren
Transkriptionsfaktoren
Protein, dass an Kontrollelemente bindet.
Kontrollelemente in der DNA (cis- Elemente) können Tausende von Nukleotiden vom Gen entfernt sein oder aber direkt am Promotor sitzen.
Enhancer and Silencer
Ablesen:
DNA wird von 3´ Richtung 5´abgelesen, sodass sich ein 5´ 3´ RNA Strang bildet
RNA wird 5´Richtung 3´ abgelesen, wenn sie translatiert wird (AS bildung)
Nicht in den neuen Folien
Replikation und Transkription im Kern
Transkription
Chemisch erfolgt die RNA-Synthese wie die DNA-Synthese:
Die OH-Gruppe am C-Atom 3 der Ribose (bzw. Desoxyribose) greift die Bindung zwischen α− und β-Phosphat eines Nukleotid- Triphosphats an, das nun in einer Kondensationsreaktion angehängt wird
Gen (-produkte) Eukaryonten und Prokaryonten
Isolierung RNA
RNA ist instabiler! (einsträngig, zusätzliche OH-Gruppe an Ribose)
Prinzipiell kein Unterschied zwischen Isolation von RNA und DNA.
Unterscheidung zwischen DNA und RNA erfolgt über den pH-Wert der verwendeten Puffer.
RNA extrem anfällig für Degradierung, Grund: RNasen.
RNasen sind sehr stabil und brauchen keine Mg2+- Ionen als Cofaktoren. Kommen praktisch überall vor. Autoklavieren hilft nicht immer.
Handschuhe, Verwendung von RNase-Inhibitoren und speziellem Satz an Werkzeugen
Verschiedene Methoden (CTAB, Phenol, Silicamembran).
Unterschied Microarray – Northern (Southern)-Blot
Transkriptionsanalyse
z.B. RNA-Seq, auch „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“
Isolation of mRNA
“Long RNAs are converted into a library of cDNA fragments through either RNA fragmentation or DNA fragmentation.
Sequencing adaptors (blue) are subsequently added to each cDNA fragment.
A short sequence is obtained from each cDNA using high-throughput sequencing technology.
The resulting sequence reads are aligned with the reference genome or transcriptome.”
Substanzen Nukleinsäure isolierung
a) Guanidinisothiocyanat =
chaotropes Salz, dass Proteine denaturiert (RNasen sind auch Proteine!)
b) SDS =
anionisches Tensid (Tenside haben hydrophoben und hydrophilen Anteil; nach Abspaltung des Gegenions negativ geladen; sorgt für Zellaufschluss (denaturiert Membranen und Proteine)
c) Mercaptoethanol =
Reduktionsmittel (reduzieren Stoffe, z.B. Proteine, lösen Disulfidbrücken); Reinigung von Enzymen, RNA und DNA; Ethanol mit Thiogruppe
d) EDTA =
Komplexbildner für Zweiwertige Kationen; Mg2+ wegfischen
e) Phenol =
Ausreinigung von Proteinen (Proteine ausfällen; Zellen von Proteinen reinigen)
Der pH-Wert des Phenols zur RNA Isolierung muss im Sauren liegen.
So werden kleinere DNA-Fragmente im Phenol gelöst und größere DNA sammelt sich in der Interphase. RNA bleibt im wässrigen Überstand.
f) Chloroform =
Ausreinigung von Phenol (Teil des Phenols aus der wässrigen Phase (wo die Nukleinsäuren drin sind) entfernen); und Zellen von Proteinen reinigen
g) Ethanol =
Ausfällen von Nukleinsäuren (wird versucht ins Pellet zu bekommen)
h) Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) =
kationisches Tensid (nach Abspaltung des Gegenions positiv geladen) wird als Detergens verwendet (Pflanzen enthalten z.B. sehr viele Polysaccharide und Polyphenole , die die RNA Isolierung stören, daher Verwendung von CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid, welches Polysaccharide komplexiert.)
N-Laurylsarcosin
Das Natriumsalz des N-Lauroylsarcosins besitzt, im Gegensatz zu SDS, eine gute Löslichkeit in chaotropen Hochsalz-Lösungen und ist daher das Detergens der Wahl in guanidiniumhaltigen Zelllyse- Puffern.
Als Salz anionisches Tensid
Im Labor genutzte Reduktionsmittel
Merceptoethanol
Dithiothreitol
Reduktionsmittel in Zellen von Organismen
Glutathion
Cystein
Warum Expressionsanalyse
Erforschung von Genexpression
in einzelnen Zellen
Geweben oder Organismen
im Vergleich unter unterschiedlichen Umweltbedingungen
Expressionsanaylse RT-PCR : reverse Transkriptase PCR
Isolierung von RNA
Umschreibung der RNA in Erststrang-cDNA mit reverser Transkriptase (RT)
Verwendung der cDNA als Matrize für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
PCR mit spezifischen Primern
Auftrennung der PCR-Produkte auf Agarosegel
RT-Reaktion: cDNA-Synthese
Complementary DNA: mRNA wird mit Hilfe von Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben
Primer: ein Oligo(dT) (18-30 Thyminbasen). Primer ist komplementär zu Poly-A-Schwanz der mRNA.
Reverse Transkriptase-Reaktion: Alle mRNA-Moleküle werden umgeschrieben. Summe aller in der Zelle vorkommenden RNA-Kopien für proteincodierende Gene: Transkriptom.
cDNAs enthalten keine Introns
Erfolg abhängig davon, ob das
gewünschte Gen im Moment der RNA-Präparation exprimiert wurde
danach: PCR
• Matrizen-cDNA
• zwei spezifische Oligonukleotidprimer
eine thermostabile DNA polymerase, z.B. Taq aus Thermus aquaticus
Nukleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
real time PCR
Eine Form der quantitativen RT-PCR
Verfahren wie bei RT-PCR (Ausgangsmaterial mRNA und Reaktion mit Reverser Transkriptase → cDNA, dann PCR)
Zusätzlich Quantifizierung des PCR-Produkts und damit Rückschlüsse (Quantifizierung) des Ausgangsprodukts (mRNA bzw. cDNA)
Wichtig ist die Menge der eingesetzten RNA (cDNA), da dies der Bezug ist
Beruht auf der Detektion und Quantifizierung eines fluoreszierenden Reporters, dessen Menge proportional zur Menge der PCR-Produkte in einer Reaktion ist
dieser Reporter kann z.B. ein ds-DNA-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff sein (SYBR Green)
Nachteil: bindet auch an Primer-Dimere und unspezifische Produkte
Unterschied rRNA/rDNA
prokaryonten vs eukaryonten
vervielfätigung einesspezifischenDNA-AbschnittsdurchKlonierung
- Einbringen des DNA-Abschnitts in z.B. Bakterien
- Vermehrung
- Isolierung der Plasmide/DNA
- Reinigung
- Sequenzierung
VervielfältigungeinesspezifischenDNA-AbschnittsdurchPCR
- Vermehrung durch PCR
- Auftrennung im Gel
- Isolierung und Reinigung
Welche Methoden der Sequenzierung gibt es?
Maxam and Gilbert (1977)
basenspezifische Spaltung der DNA durch geeignete Reagenzien und anschließender Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese
Sanger (1977)
Didesoxy- Nukleotid-Methode/ Kettenabbruch Methode
Pyrosequenzierung
Pyrosequenzierung Schritte
Hybridisierung von einzelsträngiger Template DNA und Primer
Dna Synthese
Detektion (bei passendem Nukleotid)
ATP Sulfurylase Reaktion: PP + Adenosin- 5`-phosphosulfat—> ATP
Luciferase Reaktion: ATP + Luciferin—> Oxyluciferin + Licht (Licht wird erkannt)
Abbau von nicht eingebauten Nucleotiden und ATP durch Apyrase, so dass die Reaktion mit einem anderen dNTP erneut durchgeführt werden kann
Nucleus
enthält Kerngenom
1,5 mal 10 hoch 8 Basenpaare in Arabidopsis
3.2 mal 10 hoch 9 Basenpaare im Menschen
2 mal 10 hoch 11 Basenpaare in Gymnospermen
Funktion:
Regulation des Stoffwechsels des Wachstums der Zelldifferenzierung
Replikation
Kernhülle
2 membranen, Kernporen
vermutlich kommen diese 2 Membranen aus dem ER
Welche Einheit haben die durch Massenspektrometrie erzeugten Daten/Werte?
ALT
m/z Masse pro Ladung
Nennen Sie je zwei Methoden der Ionenerzeugung und Ionentrennung in der Massenspektrometrie.
Ionenerzeugung: Chemische Ionisation und MALDI (Matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation)
Ionentrennung: TOF (Time of flight) und Elektrische / Magnetische Ionenfallen
119. Welches mikroskopische Verfahren müssten sie für die Erkennung von Ribosomen verwenden?
Elektronenmikroskop
118. Welchen Durchmesser haben Zellkerne in der Regel? Lassen sie sich im Lichtmikroskop erkennen?
5 bis 20 um
Lichtmikroskop geht bis 8 um = man kann es mit dem Mikroskop sehen
Raumstruktur Proteine
Primär: AS Ketten
sekundär Alpha Helix und Beta Faltblatt
Tertiär Faltung der Polypeptitkette
Quartär: Protein mit mehreren Untereinheitn Protein Oligomer
räumliche Anordnung/ orientierung: Konformation
Untereinheiten werden verbunden durch Wasserstoffbrückenbindungen oder ionische Bindungen oder Disulfidbrücken (s+s) oder van-der-waals Kräfte
Reduktion von disulfidbrücken
Dauerwelle
Disulfidbrücken werden reduziert und aufgelöst, Haar wird verbogen und dann wieder oxiiert
dadurch gibt es neue Disulfidbrücken an stellen, wo vorher noch keine waren—> Locken
Erste AS während der Translation
Prokaryonten: Formyl-Methionin
Eukaryonten: Methionin
Mitochondiren und Chloroplasten: Formyl-Methionin
Differentielle Zentrifugation
Zentrifugation separiertr Zellkomponenten auf der Basis von Größe und Dichte
wiederholte Zentrifgation bei immer höheren Geschwindigkeiten trennt Zellhomogenisate in bestimmte Bestandteile auf
1. Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit
—> Überstand + Pellet (ganze Zellen, Zellkerne, Cytoskelett)
2. Zentrifugation bei mittlerer Geschwindigkeit
—> Überstand + Pellet (Mitochondrien, Lysosomen, Peroxisomen)
3. Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit
—> Überstand + Pellet (Mikrosomen, andere kleine vesikel)
4. Zentrifugation bei sehr hoher Geschwindigkeit
—> Überstand + Pellet (Ribosomen, Viren, größere Makromoleküle )
Isopyknische Sedimentation
Detergenzien zum herauslösen von Membranproteinen
Trennung von löslichen Proteinen ist einfacher als von membrangebundenen Proteinen (schwieriger)
Einsatz von Detergenzien z.B. Triton X-100, Tween 20
Vorteil: Detergenzien lösen Proteine
Nachteil: denaturieren die Proteine
Rohextrakt zellaufschluss - Proteinaufreinigung/ Proteinanreicherung
Zerreiben mit Al2O3
Schütteln mit Glasperlen
Ultraschall
Druckexpansion (French press)
Mixer
96. Beschreiben Sie den Effekt, den unterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfationen auf Proteinlösungen haben.
Erster Aufreinigungsschritt: grob, aussalzen mit Ammoniumsulfat (einige Proteine entfernen)
Manche Ionen initiieren hydrophobe Interaktionen und wirken präzipitierend, „antichaotrope Salze“ z.B. Ammonium-Kationen.
Präzipitieren /Ausfällen/Pelletbildung
Hohe Konzentration = Löslichkeit der Proteine verändert sich im nächsten Schritt löst sich die Kernhülle der Proteine auf
proteinaufreinigung
Aufreinigung bzw. Anreicherung eines Enzyms: z.B. Malat-Dehydrogenase d.h. spezifische Aktivität dieses Enzyms in der Lösung soll erhöht werden
Aufreinigungsschritte, z.B.
1. grob,aussalzenmitAmmoniumsulfat
2. Ionenaustauschchromatographie
3. Gelchromatographie
4. Affinitätschromatographie
Nach jedem Schritt
1. Nachweis der Aktivität der Malatdedydrogenase (= gesuchtes Protein)
2. Nachweis der Proteinmenge in der Probe bzw. der Fraktion
Daraus wird nach jedem Schritt die spezifische Aktivität, d.h. die Anreicherung und die Ausbeute (über die Gesamtenzymaktivität) bestimmt
Enzymaktivitäten- Einheiten
Die Aktivität eines Katalysators/Enzyms ist ein Maß dafür, wie schnell ein Katalysator Edukte zu Produkten umsetzt
1 kat = 6·107 U 1 U = 16,67·10-9 kat = 16,67 nkat
Proteinbestimmung Lowry
Quantitative Bestimmung von (Gesamt-)Protein:
Reaktionen:
1. Biuretreaktion:
Bildung blau-violetter Komplexe zwischen Peptidbindungen und Cu(II)-Ionen im alkalischen
2. Cu(II) wird zu Cu(I) reduziert.
3. Cu(I) wiederum reduziert das gelbe Folin Reagenz zu Molybdänblau (Folin = Molybdän(VI)- und Wolfram(VI)-Heteropolysäuren).
Messung: Photometrie bei 750, 650 oder 540 nm
Nachweisgrenze: etwa 1 μg Protein/ml
Nachteil: zeitaufwendig, störanfällig (EDTA, Triton X-100 oder Ammoniumsulfat)
Proteinbestimmung Bradford
Prinzip:
Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 (CBBG) bildet in saurer Lösung mit kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen Komplexe.
Maximum des Absorptionsspektrum verschiebt sich von 470 nm auf 595 nm
Messung: gegen freies Farbreagens photometrisch bei 595 nm
Nachweisgrenze: ca.10 μg Protein/ml
Vorteile: einfach und schnell
Nachteile:
Kalibrierung nötig
Störanfällig (SDS, Harnstoff, DTT (Dithiothreitol)
nicht-lineare Standardkurve über einen großen Bereich
Farbreaktion kann für verschiedene Proteine unterschiedlich sein
Trennmethode Chromatographie
gelöste Substanzmischungen werden mit Hilfe einer mobile Phase (Gas- oder Flüssigkeit) über eine stationäre Phase geleitet
Trennung der Substanzen durch chemische Reaktion mit Trennmedium
Stationäre Phase
1. Säulen
2. Dünnschichtchromatographie
für Proteine:
Moleküleigenschaft —> Trennmethode
Ladung —> Ionenaustausch-Chromatographie
Größe, Form —>Ausschluss - oder Gelfiltrations-Chromatographie
Biospezifität —> Affinitäts-Chromatographie
Hydrophobizität —> Hydrophobe Interaktion Reversed Phase
Komplexierung —> Metallchelate
Chromatographie: Trägermaterial stationäre Phase
Synthetische Polymere
Polyacrylamid ( Auftrennung von Proteinen)
Anorganische Polymere
Kieselsäure ( Metalle?)
Biopolymere:
Agarose ( Auftrennung von Nukleinsäuren (DNA))
Cellulose
Dextran
stark verzweigte Polysaccharide;
Reservestoffe in Hefen oder Bakterien;
Molekülgröße 10.000-50.000.000 kD;
bilden je nach Molekularmasse in Wasser hochviskose Flüssigkeiten
Kieselsäure
Alte Frage:
79. Wenn Sie eine mRNA (mit bekannter Sequenz) in cDNA umschreiben und anschließend eine PCR durchführen, welchen Primer können Sie direkt aus der mRNA (entsprechend U gegen T getauscht) ablesen? Den 5‘ oder den 3‘ Primer?
5‘
Aminosäuren
Posttranslationale Proteinmodifikationen
Aussalzen
Hohe Salzgehalte in einer Lösung = Erhöhung der Oberflächenspannung.
—> Abtrennung der Wasserhülle des Proteins
—> hydrophobe Bereiche werden dadurch präsent.
—> Die hydrophoben Bereiche der Proteine „kleben“ aneinander und werden schließlich ausgefällt.
Andere können Wechselwirkungen unterbinden (chaotrope Salze)
Chromatographie: 1. Ionenaustausch-Chromatographie
Salzkonzentration
Elution mit steigender Salzkonzentration
die Proteine binden unterschiedlich stark an die fixierten Ladungen der stationären Phase.
Veränderung und Elution der Proteine durch die steigende Salzkonzentration des Eluenten.
Beispiel: Eine Gelmatix trägt z.B. Carboxylat-Gruppen, an die bei pH 7,0 positiv geladene Proteine binden. Durch Zugabe von NaCl (oder anderes Salz) kann das Protein wieder von den Carboxylat-Gruppen abgelöst werden, da nun die Na+-Ionen mit den positiv geladenen Gruppen des Proteins um die Bindung am Ionenaustauscher konkurrieren. Proteine mit geringer positiver Nettoladung werden eher verdrängt als Proteine mit hoher positiver Ladung.
Unterschied denaturierende und naturelle Gelelektrophorese
Natürliche: Laufgeschwindigkeit abhängig von Größe und elektrische Ladung
denaturierende: Laufgeschwindigkeit abhängig von Größe
Abfolge von Chromatographien:
Ionenaustauscher Chr.
Gelfiltration chr
Affinitätschr.
von oben nach unten wird der Graph zu den Proteinen immer genauer
es wird versucht die genaue Proteinaktivität in einer Lösung zu finden; pro Durchgang wird selektiert; da wo am meisten Aktivität drin ist, die werden für den nächsten Schritt durchlaufen
4. schritt: Überprüfung mit Polyacrylamidgel Elektrophorese; ungefähre Masse des gesuchten Proteins ist bekannt
pH-Werte
Elution mit unterschiedlichen pH-Werten ist ebenfalls möglich
a) Im sauren pH-Bereich sind die Aminogruppen (hauptsächlich der basischen Aminosäuren; welche sind das?) protoniert und das Protein tritt als Kation auf.
b) Im basischen pH-Bereich überwiegen die negativen Ladungen an den Seitenketten der sauren Aminosäuren (welche sind das?) und das Protein tritt als Anion auf.
2.Gelfiltrationschromatographie
Aufteilung nachb Größe
Variablen:
Trenngel
Puffer
pH-Wert
Säulendimensionen
Gelmaterial mit Poren in verschiedenen Größen
danach wieder Einteilung in Fraktionen
3.Affinitäts Chromatographie
Ligand
Bindender Stoff auf Säulenmaterial
- Glucose bindende Proteine
Glucose
- ProteinA
IgG
- Calmodulin
Ca2+-bindende Proteine
- Antikörper
Antigen
Beispiel Antikörper gegen MDH Antigen = MDH
Beispiel Malat-Dehydrogenase (MDH):
Es wurden Antikörper ( ) gegen die MDH produziert.
Antikörper wurden an ein Trägermaterial gebunden.
Säule wird damit bestückt.
Vereinigte Fraktionen der Gelchromatographie (siehe Folie 55) werden auf die Säule aufgetragen.
MDH ( ) bindet an Antikörper ( ). Alle anderen Proteine laufen durch die Säule durch.
Anschließend wird die gebundene MDH wieder von den Antikörper-Trägermaterial-Verbindungen gelöst. Dies erfolgt mit freiem Antikörper.
Trennung von Molekülen
Unterschiede und Gemeinsamkeiten der Trennverfahren
Chromatographie: Analytik und Fraktionierung Trennung durch chemische Reaktion mit Trennmedium
Elektrophorese: Analytik und Fraktionierung Trennung nach elektrischer Oberflächenladung und Größe (Wanderung durch ein elektrisches Feld), keine Reaktion mit Trennmedium
Massenspektroskopie: Analytik Trennung nach Masse pro Ladung (m/z)
Elektrophorese: Herstellung eines Polyacrylamidgels
isoelektrischer Punkt
Die Summe aller Ladungen eines Proteins ist bei einem bestimmten pH-Wert gleich null = isoelektrischen Punkt (pI) des Proteins.
AS können sowohl Säuren als auch Basen fungieren und dementsprechend Proteine aufnehmen oder abgeben
chemische Verbindung die als Ampholyte bezeichnet wird
pH- Gradient
pH 9, Überschuss an OH-, Proteine mit vielen basischen AS werden neutral und unbeweglich
pH 7, OH- und H+, Proteine mit vielen neutralen AS werden neutral und unbeweglich
pH 3, Überschuss an H+, Proteine mit vielen sauren AS werden erst hier neutral und unbeweglich
SDS Page
denaturierende Page
Detergenz: Natriumdodecylsulfat (SDS)
Laufgeschwindigkeit abhängig von der Größe
SDS PAGE ist negativ geladen, sodass dieses Gel die Eigenladung der Proteine überdeckt
BILD
Elektrophorese: Diskontinierliche Elektrophorese
schärfere Banden erzeugen
Auftragung auf ein weitporiges Sammelgel zwischen Chlorid-Ionen mit hoher Mobilität und Glycin-Ionen mit niedriger Mobilität
Zwischen diesen Ionen sammeln sich die Protein-Ionen.
Beim Eintritt in das kleinporigere Trenngel, werden die Protein-Ionen stark abgebremst, sodass sie von den Glycin-Ionen überholt werden, die durch höheren pH Wert ionisiert sind.
Sammelgel: pH 6,8
Glycin (nur teilweise ionisiert, geringe Mobilität) Proteine Cl- (hohe Mobilität)
eng- maschiger
Trenngel: pH 8,8
Proteine Glycin– (völligionisiert) Cl-
Spezifische Proteinnachweise mit Antikörpern
Antikörper haben (hohe) Spezifität für Antigen
Möglichkeit, um Antigene, meistens Protein, sichtbar zu machen
Die Antikörper sind entweder direkt - mit einem Enzym (setzt ein Substrat in
Farbe oder Chemolumineszenz um), - oder mit Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt
oder werden mit einem Sekundärantikörper, der an den ersten (Primärantikörper) bindet und entsprechend markiert ist, nachgewiesen.
Immunohistochemie: Nachweis eines Antigens auf einer Zelloberfläche, in Zellen oder Organellen mittels Antikörpern auf Gewebsdünnschnitten (Cryo- oder Paraffinschnitte) und damit indirekter Nachweis von Zelltypen, Differenzierungsstadien etc.
Veraltet, also muss man nur wissen, dass es das gab
Western Blot
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Quantifizierung von Antigenen oder Antikörpern im Serum, Zellsuspensionen etc. mittels enzymgekoppelter Antikörper
z.B. Schwangerschaftstest
Nachweis von Hormonen oder Antigene
Erster Antikörper wird befestigt, welcher an spezifisches Antigen (gesuchtes Proteine) bindet
Probe mit entsprechendem Antigen wird zugegeben und Antigen bindet an Antikörper
Zweiter Antikörper mit Detektionsenzym wird zugegeben.
Die durch das Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens.
Das Enzym setzt ein Substrat um und das Reaktionsprodukt kann z.B. durch Farbumschlag nachgewiesen werden.
Die Signalstärke ist im allgemeinen eine Funktion der Antigenkonzentration, so dass ELISA auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann. 25
western Blot
Primärer Antikörper bindet an sein Antigen, welches auf einer Membran fixiert ist.
An diesen wiederum bindet der sekundäre Antikörper, der z. B. mit dem Enzym HRP (horseradish peroxidase, Meerrettich-Oxidase) gekoppelt ist.
HRP katalysiert die Umsetzung von Luminol in seine oxidierte Form, dessen Chemilumineszenz detektiert werden kann.
schwangerschaftstest
immunologischer Test auf hCG-Hormon im Urin
kommt im Gewebe in der Plazenta vor
Antikörper
Epitop: die stelle, auf dem Antigen, welches vom Antikörper (Paratop) erkannt wird
Paratop = Antigen- bindungs- stelle
Immunglobulin Klassen: A, D, E, G, M
Ig G ist der meist genutzte analytische Antikörper (kann induziert werden, 150 kDa, gut löslich usw.)
Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antiseren sind eine Mischung aus verschiedenen gegen diverse Epitope (antigene Determinante, Antikörper- Bindungsstelle) gerichteten Antikörpern.
polyklonal: aus mehreren Zellen hervorgegangen (können ein Stück weit unterschiedlich sein)
Nutzen von Polyklonalen Antikörpern
Antigen auswählen: Zunächst muss das Antigen, gegen das der Antikörper gerichtet sein soll, ausgewählt und produziert werden. Entweder wird das Protein isoliert oder ein Peptid aus einem Protein wird in vitro synthetisiert.
Immunisierung: Anschließend wird das Peptid einem Tier gespritzt, dessen Immunsystem dann Antikörper dagegen bildet. Als Antikörper-Produzenten werden besonders Kaninchen oder Mäuse verwendet, aber auch Ziegen oder Schafe verwendet.
Serumentnahme: Nach ein paar Wochen wird dem Tier Serum entnommen. Dies enthält gegen das Antigen gerichtete polyklonale Antikörper.
Monoklonale Antikörper
Möglichkeit auf künstlichem Wege monoklonale Antikörper herzustellen (Köhler und Milstein, Nobelpreis 1984):
Fusionierung von B-Zellen aus einer immunisierten Maus (produzieren Antikörper, können sich aber nicht teilen) mit Maus-Tumorzellen (sind unsterblich).
Klon, der von einer einzelnen fusionierten Zelle abstammt, wird selektioniert und vermehrt.
Diese Zellen produzieren einen identischen Antikörper.
Massenspektrometrie zur Identifizierung unbekannter Proteine
SDS-Gel oder 2D-Gel
Bande/Spot ausschneiden
Tryptischer Verdau der Proteine
Massenspektrometrie: die Bestimmung der Masse des Proteins und aller seiner vorhersagbaren Peptidfragmente (Peptid-Fingerabdruck) Ionenquelle Massenanalysator Detektor
Datenbanksuche Abgleich der Massen in Datenbanken mit bekannten Protein- und Peptidmassen
edman-Abbau
frühere Methode zur Aminosäure Sequenzanalyse
chemische Analyse zur Auftrennung
Röntgenstrukturanalyse
ein Kristall des zu untersuchenden Stoffes wird gezüchtet
der Kristall wird dann mit Röntgenstrahlen durchleuchtet
diese werden charakteristisch an den Atomen gebeugt.
aus der Ablenkung der Strahlen werden die räumliche Struktur und die Atompositionen errechnen.
heute werden hieraus am Computer Modelle erstellt.
Zufalls mutagenese
Physikalische Mutagenese
Energiereiche Strahlung, Röntgenstrahlung
z.B. Pyrimidin-Dimere durch UV-Licht
Chemische Mutagenese
ENU (Ethylnitroisoharnstoff)
löst Punktmutationen aus durch Alkylierung (GC zu AT)
5-Brom-Uracil
wird mit Cytosin verwechselt, so dass Guanin anstelle von Adenin in die DNA eingebaut wird
Oligonukleotid basierende Mutagenese z.B. bei Pflanzen
Oligonukleotide werden synthetisch hergestellt und in die Zelle eingeschleust.
an einer bestimmten Stelle im Genom wird eine Mutation eingeführt
verändert nur ein oder einige wenige Basenpaare verändert
Gene werden gezielt ausgeschaltet oder aktiviert
Genome editing Verfahren
Vorteil zur klassischen Mutagenese mit Hilfe von Strahlung oder chemischen Stoffen:
Mutationen können ganz gezielt an definierten Stellen der DNA hervorgerufen werden
weniger unbeabsichtigte Mutationen im Genom ausgelöst.
genome editing
Es werden nicht mehr „fremde“ Gene von außen eingeführt, sondern einzelne, in einer Pflanze vorhandene DNA- Bausteine gezielt entfernt oder „umgeschrieben“
Gezielte Erzeugung von Genveränderungen
Überexpressionen:
vermehrte Produktion eines Genprodukts (meist mit viralem Promotor)
„knock-out“ Population:
verringerte Produktion eines Genprodukts („knock-down“)
Funktionsanalyse für bestimmte Gene bzw. Proteine
Medizin: Unterdrückung der Aktivität bestimmter Gene, z.B. Onkogene
Nahrungsmittelindustrie: Produkte mit veränderten Eigenschaften
oder gar nicht mehr vorhanden („knock-out“)
Organismen mit weiteren Fremdgenen:
Einbringen neuer Eigenschaften
Werkzeuge zur Erzeugung rekombinanter DNA/Organismen
Plasmid DNA
Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme)
DNA-Ligase Rekombinante
DNA Klonierungstechniken
Transformationsmethoden
Regeneration der Organismen
Selektionsmarker
Transformation von Bakterien
transgene Organismen
Organismen, die Gene aus anderen Organismen enthalten
Wie kommt die fremde/rekombinante DNA in die Pflanze?
1. Protoplastentransformation
a) z.B. durch CaCl2 oder PEG kompetent gemachte Protoplasten von Mais oder Reis (typische Methode für Bakterien)
b) Elektroporation: mit einem kurzen Stromstoß bei hoher Voltzahl werden kurzzeitig Löcher in die Plasmamembran der Zellen erzeugt (z.B. für Bakterien und Hefen)
c) Mikroinjektion in Zellen direkt (eher bei Tierzellen)
Protoplast: Zelle ohne Zellwand
Partikelkanone
2. Partikelkanone
Mikroprojektile aus Wolfram oder Gold (Durchmesser 1-4 μm) werden mit DNA überzogen und auf bzw. in Zellen geschossen.
Beschossen werden embryonale Zellen, Kallus, Pollenschlauch oder Blätter
3. Agrobacterium tumefaciens
bei dikotylen Pflanzen (heute auch monokotyle Pflanzen)
1 und 2 beruhen auf einer anschließenden homologen Rekombination mit dem Genom des Zielorganismus.
im Kerngenom von Pflanzen selten
Daher wird bei Pflanzen häufig eine andere Methode verwendet. Trans- formation mittels Agrobakterium tumefaciens.
Bodenbakterium als Genfähre
Agrobacterium tumefaciens
führen dazu, dass Pflanzen Wurzelhalsgallen bilden (Tumorgewebe).
Die befallenen Pflanzenzellen werden dazu veranlasst hohe Konzentrationen an Auxin und Cytokinin zu bilden, die dann das Tumorwachstum auslösen.
Pflanzenzellen werden ebenfalls dazu veranlasst, aus Aminosäuren und Zucker sogenannte Opine (z.B. Octopin) zu produzieren (Nahrung fpr Agrobakterien)
Zur Transformation der Pflanzenzellen benutzen die Agrobakterien die T-DNA des Ti-Plasmids#
Tumor induzierendes Plasmid von A. tumefaciens
Normales Ti Plasmid
Ti- Plasmid (200 kB) ermöglicht dem Agrobakterium die Übertragung und Integration spezieller Gene in das Genom von Pflanzen.
Die in die Pflanzenzelle übertragbare Transfer- oder t-DNA (= transferierte DNA = gelber Bereich in der Abb.)
LB (= left border) und RB (= right border) begrenzen t-DNA und signalisieren Beginn und Ende der t-DNA.
Opinsynthese-Gene (notwendig für die Synthese der Opine durch die Pflanzenzelle (Opine = Zucker-Aminosäure).
Tumorgenese-GenefürdieSynthesederPhytohormoneAuxin und Cytokinin, die gemeinsam für die Ausbildung des Tumors zuständig sind
Außerhalb der t-DNA liegen weitere Gene:
Gene für den Opinabbau, die den Bakterien erlauben, die von den Pflanzen ausgeschiedenen Opine zu nutzen,
der"originofreplication"(=ORI); Replikationsursprung, der die Verdopplung des Ti-Plasmids ermöglicht
VIR-Region: hier liegen die vir-Gene (VIR = Virulenz), ermöglichen es dem Bakterium infizierbare Pflanzen zu erkennen und codieren für Proteine, die die Übertragung der T-DNA auf die Pflanze katalysieren
der Bereich für die Konjugation, der Bakterien mit dem Ti-Plasmid erlaubt, das Plasmid auf Bakterien ohne das Ti-Plasmid zu übertragen
binärer T-DNA-Klonierungsvektor für gentechnische Veränderungen basiert auf Ti-Plasmid
Die DNA, die in die Pflanzenzelle eingeschleust werden soll, wird nicht direkt in das Ti-Plasmid integriert, sondern wird – eingerahmt von RB- und LB-Sequenzen - in ein Plasmid eingebracht und in E. coli vermehrt.
Bei einem Helferplasmid wird die T-DNA- Region mitsamt rechter und linker Border entfernt, es behält aber die so genannten Virulenzgene (vir-Gene), deren Aktivität für die Übertragung der T-DNA in das Pflanzengenom erforderlich ist.
Beide Plasmide werden in einem Agrobakterien-Stamm zusammengeführt, mit dem anschließend eine Pflanze infiziert wird.
Gemeinsame Kultivierung von Agrobakterien und Pflanzen-Blattstückchen. Das eine Plasmid überträgt die „fremde“ T- DNA, das andere hilft durch die Aktivität seiner vir-Gene bei der Transformation. Die nicht transformierten Zellen werden mit Hilfe des Markergens selektiert. Aus den Blatt- stückchen werden wieder Pflanzen regeneriert.
RNAi = RNA Interferenz
RNAi = natürlicher Regulationsmechanismus der Genexpression in fast allen Organismen
z.B. auch zur Abwehr von Viren
Kurze doppel-strängige (ds) RNA-Fragmente (siRNA, small interfering RNA, etwa 20 Nukleotide lang), die in ihrer Sequenz dem Zielgen entsprechen, führen zum Abbau der entsprechenden mRNA .
die ds-siRNAs lassen sich synthetisch herstellen und in die Zelle injizieren
Gen silencing
Das Enzym Dicer (= RNAse) schneidet doppel-strängige RNA in kürzere Stücke (small interfering RNA siRNA; ca. 21 Nukleotide)
siRNA-Duplex wird in einen Protein-Komplex eingebaut, den RNA-induced silencing complex (RISC), mit Argonauten-like Proteins als Komponente
RISC entfernt einen der beiden RNA-Stränge und RISC begleitet den verbleibenden kurzen RNA Strang zur komplementären Ziel-mRNA ( )
RISC enthält Endonuclease, die die mRNA an einer definierten Stelle schneidet
durchtrennte mRNA ist nicht mehr durch cap oder poly-T Schwanz geschützt und wird von zellulären RNasen abgebaut, d.h. keine Translation
RNAs: codierende und nicht-codierende (regulatorische)
Antisense-RNA-Technik (auch RNA-Interferenz?!)
Antisense RNA (einzelsträngig) wird eingebracht und heftet sich an die mRNA. Doppelsträngige RNA wird nicht translatiert, sondern abgebaut.
Nativ: Beim Menschen sind ca. 1600 antisense-Gene vorhanden. Bei manchen Genen ist ein zweiter Promotor am 3‘ Ende des Gens aktiv
Kommerziell: Flavr-Savr-Tomate (Polygalaturonase unterdrückt); 32 Kartoffel „Amflora (Amylose-Produktion unterdrückt“)
CRISPR/cas
CRISPR/cas-System im Genom vieler Bakterien und Archaeen gefunden
verschafft Resistenz gegen bestimmte Viren oder Plasmide
(bakterielle „Immunantwort“)
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
sind Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats)
cas: Gruppe von Genen nahe CRISPR (cas-Gene - CRISPR-associated),
codieren für Endonukleasen Wikipedia
System bildet die Grundlage der gentechnischen CRISPR/Cas-Methode zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen
CRISPR/cas verschafft Bakterien Resistenz gegen Phagen/Viren
Vereinfachtes Diagramm des CRISPR-Genlocus. Grauen Boxen = Repeats Bunten Striche = Spacer
Bei einer Infektion spalten die Cas-Proteine die DNA der eingedrungenen Viren in kleine Fragmente auf.
Diese werden dann in den CRISPR-Abschnitt des Bakteriums eingefügt, welche aus kurzen, sich wieder- holenden DNA-Sequenzen bestehen
Bei einem erneuten Virenbefall werden diese CRISPR- Abschnitte in RNA umge- schrieben: Diese „prüft“ die Viren-DNA.
Stimmt diese mit dem gespeicherten Abschnitt überein, wird sie durch die Cas- Proteine zerschnitten.
CRISPR/cas Funktionsweise
cas9 (CRISPR-associated) kodiert für eine Endonuklease
cas9 kann eine bestimmte RNA-Sequenz (RNA repeat) binden, wodurch sie aktiviert wird
neben der RNA repeat-Sequenz befindet sich eine weitere RNA-Sequenz (RNA spacer), die an die Ziel-DNA bindet
crRNA (repeat und spacer) sorgt für die räumliche Nähe von cas9 (bzw. Endonukleaseaktivität) und Ziel-DNA
cr-sequence = GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG) Weitere Voraussetzungen
- z.B. PAM Motive in der Ziel-DNA
Ziel-DNA wird geschnitten
Der Doppelstrangbruch der DNA wird repariert (es gibt jedoch keine Matrize), so dass es zur Deletion oder anderen Fehlern kommt.
CRISPR/cas Methode zur Erzeugung genetisch veränderter Organismen
Durch cas9 mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können.
RNA spacer-Sequenz wird ausgetauscht (zur DNA-Zielsequenz komplementäre RNA)
RNA repeat ist vorhanden
cas9 schneidet die DNA nahe der geänderten Zielsequenz.
Knock down Mutaten
a) RNA-Interferenz(RNAi) (Antisense-RNA)
b) CRISPR/casMethode
c) Insertionsmutanten
Medizin:
Unterdrückung der Aktivität bestimmter Gene, z.B. Onkogene
Nahrungsmittelindustrie:
Produkte mit veränderten Eigenschaften
Knock-out T-DNA-Insertionsmutanten = Funktionsverlust-Mutanten
= Knock-out Mutanten (homolog oder heterolog) = Funktionsverlust-Mutanten
Das Projekt mit dem Namen GABI-KAT (Kölner Arabidopsis T-DNA-Linien) umfasst 80.000 mutagenisierte und charakterisierte Arabidopsis thaliana K.-O.-Linien, die per Katalog bestellt werden können. Auch große Sammlung beim Salk-Institute.
Um eine sog. T-DNA-induzierte Insertionsmutante zu erzeugen, wird ein in seiner Sequenz bekanntes und somit wieder auffindbares Fremdgen (T-DNA) in das Arabidopsis-Genom eingeschleust.
Immer dann, wenn sich das Fremdgen zufälligerweise innerhalb eines Arabidopsis-Gens „einklinkt“ (inseriert), kann das betroffene Pflanzengen seine Funktion nicht mehr erfüllen – und gibt sich somit zu erkennen.
verschiedene Licht Mikroskopien
Dunkelfeld
Feinere Strukturen ohne Eigenfärbung werden sichtbar
Hellfeld
Licht dringt durch die Probe, gefärbte Proben
Phasenkontrast
Konturen im Objekt treten plastisch hervor
Polarisation
Strukturdetails können besser dargestellt werden
Fluoreszenz-Mikroskopie
Fluoreszenz:
Spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedriger Energie.
Das emittierte Licht ist in der Regel energieärmer als das vorher absorbierte (20-50 nm Unterschied)
Fluoreszenzmikroskopie:
Ein fluoreszierender Farb- stoff wird durch einen Fluoreszenzstrahl angeregt. Beobachtet wird das vom Farbstoff emittierte länger- wellige Fluoreszenzlicht.
Entweder zeigen die Proben Eigenfluoreszenz oder sie müssen mit Fluoreszenz- farbstoffen markiert werden.
Endothelzellen im Fluoreszenzmikroskop.
Die Mikrotubuli sind mit Fluoreszens- farbstoff grün markiert, Aktinfilamente sind rot markiert worden. Die DNA im Zellkern mit DAPI angefärbt.
Promotor – Reportergen – Konstrukte zur Analyse der Genexpression
Gene für fluoreszierende Proteine werden als Reportergene verwendet
Promotor eines zu untersuchenden Gens wird vorgeschaltet
Genexpression wird lokalisiert z.B.
zellspezifisch
entwicklungsspezifisch
Umwelt-spezifisch
Probleme:
Transkiptionskontrolle nicht nur über Promotor
transformierbare Organismen (Pflanzen) notwendig
Promotor des zu untersuchenden Genes (gene of interest, GOI) isolieren
dahinter kodierende Region des Reportergens anknüpfen
Promotor-Reportergen-Konstrukt in einen Organismus einbringen
a) transiente Expression: nicht transgen, keine Integration in das Genom
b) stabile Expression: transgen, Integration ins Genom
Aktivität des Reportergens messen, im lebenden Organismus
Regulation der Genexpression bei Eukaryoten
Cis-Elemente
Teil eines Gens.
sowohl im Promotor als auch weiter strom- aufwärts zu finden.
Enhancer- oder Silcencer-Sequenzen.
Trans-Elemente
Transkriptionsfaktoren und meistens Proteine.
Trans-Elemente binden an cis-Elemente.
Weitere Aktivator- oder Repressorproteine wirken ebenfalls regulierend.
Die Gesamtheit der cis-/trans- Aktivitäten im Promoter bestimmt die Intensität, mit der die RNA- Polymerase die Transkription durchführt und damit die Regulation der Transkription.
Die Basalfaktoren TATA- bindendes Protein und die Proteine A-H sind für die Transkription zwingend notwendig.
Die Basalfaktoren können die Transkription aber weder beschleunigen noch verlangsamen.
Diese Aufgabe erfüllen die Regulatormoleküle (trans-Elemente), Aktivatoren oder Repressoren, deren Kombination für jedes Gen anders ist.
Promotor (300-3.000 bp)
ermöglicht die regulierte Expression eines Gens • Bindungsstelle für RNA-Polymerase
Der Promotor ist Teil der „Gen-regulatorischen Bereiche“. (= Core-Promotor und weiter vom Gen entfernte Nukleotid-Sequenzen)
Cis-Elemente sind im (und vor dem) Promotor eingelagert - kurze, variable Sequenzen
allgemeine (Core-)-Promotorelemente z.B. TATA Box bei Archaeen und Eukaryonten
Transkriptionsfaktoren binden an cis-Elemente (6-10 nt)
weitere Regulationselemente (Aktivatoren, Repressoren) binden an weiter stromaufwärts liegende Regionen und unterstützen die Bindung der Transkriptionsfaktoren
Reportergen
Eigenschaften
leicht nachweisbar, z.B. durch enzymatische Reaktion
keine schädigenden Einflüsse auf die Zelle
Menge an Produkt bzw. Proteinaktivität zeigt Aktivität des Promotors an
Abhängig vom biologischen System • qualitativer und/oder quantitativer Nachweis
Reportergene, die zu den entsprechenden Reporterproteinen exprimiert werden
GFP (green fluorescence proteine) und Varianten-
ß-Galactosidase (lacZ-Gen) (siehe Blau-weiß-Selektion in Vorlesung „DNA“)
ß-Glucuronidase
Luciferase
Fluoreszenz „selbst“ produziert
Grün fluoreszierende Proteine (GFP green fluorenscent protein)
aus der Qualle Aequorea victoria
fluoresziert grün bei Anregung (intrinsische Fluoreszenz)
GFP: 238 Aminosäuren, 27 kDa,
1992 bereits cDNA von GFP kloniert
Untersuchung der Promotoraktivität mit GFP
Herstellung von Promotor, GOI und GFP-DNA Fusionen
Einbringen in Vektor, der von Zellen aufgenommen werden kann
Fusionsprotein wird in Zellen hergestellt
Das zu untersuchende Protein wird an die „richtige“ Stelle transportiert
GFP wird über Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen
Promotor-Reportergen (= ß-Glucuronidase) -Fusionen
Zellspezifische Analyse von Expressionsmuster
Enzym aus Escherichia coli
Anwendbar bei Organismen mit sehr geringer ß-Glucuronidase Aktivität - höhere Pflanzen, Moose
Nachweissystem z.B. histochemisch mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronid (X-Gluc); nach Spaltung Blaufärbung
Promotor-Reportergen (= Luciferase) -Fusionen
Zellspezifische Analyse von Expressionsmustern über Nachweis
• Enzym aus Escherichia coli
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Laserlicht wird genutzt, um Fluoreszenzfarbstoffe anzuregen.
Durch eine Lochblende kommt nur das Fluoreszenzlicht eines winzigen Teils der Probe in den Detektor (Mikroskop).
Bis zu einem Femoliter (1*1015 l) aktuelle Teilprobengröße???
„Anregungslicht nur in der aktuellen Fokusebene wirksam“
Das Objekt wird Schicht für Schicht durchscannt.
Rekonstruktion 3-dimensionaler Bilder.
STED Mikroskopie
Stimulated Emission Depletion Mikroskopie
umgeht die bisherige Auflösungsgrenze
Bisherige Grenze der Licht-, Fluoreszenz-, Laser-Raster-Mikroskopie
In einem Lichtmikroskop können zwei Objekte nicht mehr voneinander unterschieden werden, sobald ihr Abstand kleiner ist als die halbe Lichtwellenlänge ist (ca. 200 nm).
1873 von Ernst Abbe entdeckt
Schuld ist die Beugung des Lichts an den beiden Objekten, wodurch sie im Auge des Beobachters (bzw. Mikroskops) zu einem Objekt verschwimmen.
Bei der STED-Mikroskopie werden Fluoreszenzfarbstoffe zum Markieren einzelner Bereiche eines Präparats eingesetzt. Solche Farbstoffe können durch Licht bestimmter Wellenlängen „angeregt“ werden: Sie absorbieren ein Photon und gehen in einen energiereicheren Zustand über. Aus diesem Zustand können sie nach kurzer Zeit spontan durch Aussenden eines Photons größerer Wellenlänge wieder in den Grundzustand zurückkehren. Diese spontane Abstrahlung von Licht nennt man Fluoreszenz.
Ein angeregtes Farbstoffmolekül kann außer durch Fluoreszenz auch durch stimulierte Emission wieder in den Grundzustand zurückkehren. Dies passiert, wenn das angeregte Farbstoffmolekül mit Licht von ungefähr der gleichen Wellenlänge wie der des Fluoreszenzlichts bestrahlt wird. Das angeregte Farbstoffmolekül kann so zum sofortigen Übergang in den Grundzustand durch Aussenden eines Photons exakt derselben Wellenlänge stimuliert werden. Spontanes Fluoreszenzlicht kann dann nicht mehr ausgesandt werden, das Molekül ist ja nicht mehr im angeregten Zustand.
Fluoreszenzmoleküle können also durch stimulierte Emission ausgeschaltet werden: Wenn sie zur Emission des Lichtes stimuliert werden, können sie danach kein spontanes Fluoreszenzlicht mehr abgeben. Spontanes Fluoreszenzlicht und Licht von der Stimulierten Emission können z. B. durch Farbfilter voneinander getrennt werden.
2. Raster-Elektronen-Mikroskopie REM
zur Oberflächendarstellung
Proben werden mit Gold, Platin oder Graphit bedampft
Beschleunigung der Elektronen mit 8-30 kV
im Hochvakuum (Probe muss das aushalten)
Elektronenstrahl wird in einem bestimmten Muster über das Objekt geführt
3. Transmissions-Elektronen-Mikroskopie TEM
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Elektronenstrahl wird durch Magneten auf das zuvor fixierte und kontrastierte Objekt fokussiert.
Strukturen erscheinen dunkler, wenn sie die Elektronen absorbieren.
Wenn die Elektronen durch das Objekt treten, werden sie auf einem fluoreszierenden Schirm detektiert.
1. Probenvorbereitung:
a) Fixierung der Proteine (Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid) (alternativ Cyrofixiering, -135°C)
b) Dehydratisierung (Ethanolreihen)
c) Einbettung: Acrylharze
d) Schneiden (Dünnschnitte z.B. 50 nm)
e) Kontrastieren: Uranylacetat, Bleicitrat
Die Elektronen durchstrahlen das Objekt
Beschleunigung der Elektronen (80-120 kV bei biol. Proben)
Durch die Probe durchtretenden Elektronen werden auf Schirm detektiert
Last changed7 months ago