Zusatzinfos

Nukleosid:

• Zucker und Base

  • Purine

    • Adenosine/ Deoxyadenosine (in Adenine)

    • Guanosine/ Deoxyguanosine (in Guanine)

  • Pyrimidin

    • Cytidine/ Deoxycytidine (in Cytosin)

    • Thymidine / Deoxythymidine (in Thymin)

    • Uridine

  • —> alles mit Deoxy davor ist in der DNA, das andere in der RNA

Nukleotid:

• Zucker Base und Phosphat

  • Purine

    • Andenylate/ Deoxyadenylate

    • Guanylate/ Deoxyguanylate

  • Pyrimidin

    • Cytidylate/ Deoxycytidylate

    • Thymidylare/ Deoxythymidylate

    • Uridylate

  • —> alles mit Deoxy davor ist in der DNA, das andere in der RNA

• Synthese: 5’—>3’ Richtung

• Whrend der Anlagerung an das 3’ ende wird Pyrophosphat von angelagerten Nukleotid abgespalten

• Die Bindung zwischen Phosphat und den jeweiligen Zuckern (hier Desoxyribose sind Phophordiesterbindungen)

• Ester:

  • allgemein: ein Alkohol

  • Hydroxygruppe und eine Säure

• 8 histonenmoleküle bilden Histonenkern (core)

• 146 Basenpaare (1,65 Drehungen) winden sich um den core

• 
  

Membranystem im Cytosol

• Funktionen:

  • u.a Lipidsynthese (glattes ER)

  • Materialtransport innerhalb. der Zelle

  • Calciumspeicher (komplexiertes Calcium z.B. mit Oxalat)

• Raues ER:

  • mit Ribosomen als ort der Proteinsynthese (Translation)

• zur verdauung von in den Körper gelangten Fremdkörpern

  • im Cytoplasma

  • sind Vesikel

• in tierischen Eukaryontischen Zellen

• = nicht in Bakterien oder Pflanzen

• enthalten Verdauungsenzyme (hydrolytische Enzyme, Lipasen, Proteasen, Nukleasen)

• Enzyme bei pH 4-5 aktiv

• eine Membran

• schnüren sich vom ER über den Golgi-Apparat ab

• auch anA poptose (programmierter Zelltod) beteiligt

• Isolierung von genomischer DNA: Zellaufschluss (siehe Proteinase K-Aufschlussmedium)

• Isolierung von DNA: Ethanolpräzipitation (Nukleinsäurefällung)

  • Alternative zur Präzipitation: Zugabe monovalenter Kationen, z.B. durch Natriumacetat (Nukleinsäuren werden entladen)

• Isolierung von DNA: Abtrennung von Proteinen (Proteinfällung)

Ziel:

• gigantisch lange Moleküle aufreinigern, ohne alles kaputt zu machen

• DNA erhalten

• DNAsen inaktivieren

• weitere Stoffe wie RNA, Proteine usw. entfernen

• neutralisiert den PH-Wert

• löst polare sachen

• zur DNA Stabilisierung

Zusammensetzung:

• 100 mM NaCl

  • NaCl um eine gewisse Ionenkonzentration vorzugeben

  • Einstellen einer bestimmten Osmolarität, Salzkonzentration, wirkt auch auf die Ladung der DNA

• 10 mM Tris HCl pH 8.0

  • Tris, Puffer, welcher den PH Wert stabilisiert, kann auch HEPES, MEs oder K-Phosphat sein; können verschiedene Stoffe sein, solange sie den PH bei einem gewissen wert halten

• 50 mM EDTA pH 8.0

  • ETA: Komplexfilter mit 2 wertigen Kationen Magnesium soll weggefischt werden

    DNase ist Magnesium abhängig und da wir die DNase hemmen wollen, wird eta eingesetzt um Mg wegzubekommen

• 0,5% SDS

  • SDS (Sodiumlaurylsulfat): um Proteine zu denaturieren

• 20 μg/ml RNase A

  • RNase A: RNA Abbau

• 0,1 mg/ml Proteinase K

  • denaturiert Proteine

  • Proteinase K: Proteinabbauendes Enzym; DNase soll abgebaut werden

  
  

• Abtrennung von Proteinen (Proteinfällung): unterschiedliche Löslichkeiten: Phenol, Chloroform = Proteine werden von Nukleinsäuren getrennt.

  • Wässrige Phase: Gewebe mit DNA und allem anderen

  • Zugabe organisches Lösungsmittel (Phenol = (relativ giftig) löst apolare Sachen)

  • Ist schwerer = unten

  • Alles wird gemischt; dann zentrifugieren: 3 Phasen entstehen

  • Wässrige Oberphase (mit D NA, Zucker usw. also alle lösliche Metabolite)

  • Interphase (denaturierte Proteine)

  • Organische Phase: Phenol (alle Lipophilen Stoffe gelöst, z.B. Lipide, Chlorphphyll)

• Proteine sind weniger hydrophil, gehen daher eher in die organ. Phase, während Nukleinsäuren (Phosphatgruppen) in der wässerigen Lösung bleiben.

  • Obere wässrige Phase wird abgenommen und mit etwas Chloroform (organisches Lösungsmittel) gemischt um Phenolreste zu entfernen

• 
  

1. a)  Zugabe von etwa 3-fache Volumen absoluten Ethanols

2. b)  Zentrifugation

3. c)  Nukleinsäuren präzipitieren

4. d)  Das Nukleinsäurepellet ist meist am Boden des E-cups sichtbar

5. e)  Danach mehrmals waschen des Pellets mit 70%igem Ethanol

6. f)  Nukleinsäure in Wasser lösen

Alternative zur Präzipitation: Zugabe monovalenter Kationen, z.B. durch Natriumacetat (Nukleinsäuren werden entladen)

• Entfernen von Proteinen in den unterschiedlicen Stifen der Reinigung

  • Proteinverdau (Proteinase K)

  •  durch Ausnutzen der unterschiedlichen Löslichkeit (Schichten)

    • Einsetzen von organ. Lösungsmitteln Phenol, Chloroform; verwendet, um Proteine von Nukleinsäuren zu trennen: Proteine sind weniger hydrophil, gehen daher eher in die organ. Phase, während Nukleinsäuren (Phosphatgruppen) in der wässerigen Lösung bleiben.

  • Verwendung von Säulen (bei den meisten Kits)

• Hemmen von DNA Abbau

  • Proteinabbau (siehe oben)

  • Mg 2+ wegfischen 2.3.

  • weitere Dnase-Inhibitoren

  • Scherkräfte bei der Isolierung von hochmolekularer DNA vermeiden!

    • Kann aber auch bei der Isolierung von Plasmid-DNA ein wichtiger Parameter sein!

    • abgeschnittenen Pipettenspitzen, NICHT vortexen, usw.

Beispiel: Ein 2kb-Fragment einer doppelsträngigen (ds) DNA ist in 500 μl Wasser gelöst

Aufgabenstellung: Berechnen Sie aus dem UV-Spektrum

1. die DNA-Menge

In eine Küvette (Schichtdicke d= 1 cm) wurden 5 μl Probe und 95 μl Wasser pipettiert Die Probe wurde vorher zusätzlich 1:5 verdünnt Gemessen wurde eine OD260 nm von 0.12

Demnach liegt in der Probe eine Konzentration von 600 μg/ml vor. (0.12 x 50 μg/ml x (100/5) x 5)

Die Gesamtmenge der DNA beträgt 300 μg ( die DNA war anfangs in 500 μl = 0,5 ml gelöst) .

Beispiel: Ein 2kb-Fragment einer doppelsträngigen (ds) DNA mit der Konzentration 600 μg/ml Aufgabenstellung: Berechnen Sie 2. die Stoffmengenkonzentration (mol L-1; „Molarität“ bzw. in μmol/l = μM).

Die Länge der DNA beträgt 2 kb.

MW 1bp ~ 650 Da (d.h. ein Basenpaar einer Nukleinsäure hat die durchschnittliche Formelmasse von 650 Dalton)

Das Molekulargewicht eines bp beträgt auch 650 g/mol 2000 bp x 650 g/mol = 1.3 x 106 g/mol bei einem Fragment von 2000 bp

= 1.3 x 106 μg/μmol bei 600 μg/ml (siehe vorherige Seite)

600 μg/ml / 1,3 * 106 μg/μmol = 0,00046 μmol/ml = 0,46 μmol/l = 0,46 μM 20

n= m/M Stoffmenge = Masse/Molmasse c = m/M*V Stoffmengenkonzentration = Masse/Molmasse * Volumen

ReineDNA-Lösung OD 260nm =1,8 280 nm

Reine RNA-Lösung OD 260 nm = 2,0 280 nm

Bei Proteinverunreinigungen ist der Wert niedriger

alkalische Lösung (pH 8-8,5) in Na2HPO4 (dinatriumhydrogenphosphat)

Ziel: Amplifizierung von Nukleinsäuren in einem zyklischen Prozess ( 1DNA Abschnitt —> 10^12)

• Ablauf

  • Isolierung von DNA (=Template)

  • wahl der passenden Primer

  • PCR- ABlauf

    • PCR Ansat im Ecup (Template, zwei Primer, dNTPs, thermostabile DNA-Polymerase, Mg2+ Ionen usw.)

    • Temperatur-Zeit Profil des PCR Gerätes

Ansatz im E-cup (ca. 20 μl gesamt):

a) Puffer

b) dNTP-Mix (200 μM) (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

c) MgCl2 (0,5-5 mM)

d) spez. Oligonukleotid-Primer Primer 1 und Primer 2 (= foward und reverse Primer) (je 10-100 pmol)

e) DNA (Template) (1 ng bei Plasmid DNA, 1 μg bei gDNA)

f) Enzym: thermostabile DNA-Polymerase, z.B. Taq (aus Thermus aquaticus, 1 Unit), Aktivität ca. 1000 Nukleotide pro min (1 kbmin)

1. Denaturierung der DNA (z.B. 94oC, 30 sec)

2. Primer-Annealing (Anlagerung) - Primer binden an Matrize (z.B. 58oC, 30 sec)

   - die Spezifität der Bindung abhängig von Primern, Salzkonzentration und Temperatur

3. Verlängerung bei der opt. Arbeitstemperatur der Polymerase (z.B. 72oC) die Länge dieses Schritts hängt von der Länge des Produkts ab (ca. Polymerase 1 min pro kb)

Am Ende noch ein längerer Verlängerungsschritt (z.B. 72°C, 5 min), damit alle noch unfertigen DNA-Stränge die volle Länge erreichen

Primer-Annealing-Temperatur abschätzen

• die Spezifität der Bindung hängt von der Salzkonzentration und von der Temperatur ab

• die Annealing-Temperatur abhängig vom Primer

• -Annealing-Temperatur = Schmelztemperatur – 3 °C (Tann ca. Tm – 3°C)

• die Schmelztemperatur aus der Länge und dem GC-Gehalt eines Primers berechnen Anzahl G und C * 4 Anzahl A und T * 2 Zahlen summieren = ungefähr Schmelztemperatur

Spezifische Primer:

• Primer = Oligonukleotide , welche komplementär zu einem Teil der zu vervielfältigen Nukleotidsequenz sind

• es geht um die Amplifikation einer bekannten Sequenz

• Primer sollten spezifisch sein!

• beide Primer sollten +/- dieselbe Schmelztemperatur haben • Primer sollten keine internen Strukturen bilden

• es kommt besonders auf die Bindung am 3'-Ende des Primers an

  • 50% GC bei den letzten 6 Nukleotiden

  • Primer sollten auf G oder C enden

• Oligonukleeotide = aus wenigen Nukleotiden (DNA oder RNA) aufgebaute Oligomere

• Messung bei 260nm am Photometer

• in Quarzküvetten (absorbieren kein UV-Licht)

• Absorptionswert vin 1 (optische Dichte OD=1) = ca. 50 Mikrogramm DNA/ml

• 1 OD bei 260nm :

  • dsDNA: 50 Mikrogramm DNA/ml

  • esDNA: 40 Mikrogramm DNA/ml

  • RNA (es): 33 Mikrogramm DNA/ml

• Absorption durch die aromatischen Ringe der Basen

  
  

1. Methodisch:

• Einbau von Funktionselementen (DNA-Abschnitte)

• Fusion von 2 DNA-Fragmenten

• Entfernen eines DNA-Abschnittes

• Einbau eines DNA-Abschnittes

• Amplifizierung von DNA-Abschnitten

Abb. Alberts Molecular Biology of the Cell

Abb. Quelle: Wikipedia

2. Anwesenheit bestimmter Gene bzw. Expressionsniveau

• Degenerierte Primer zur Suche nach Genen, die für die selbe Genfamilie kodieren

• Vervielfältigung RNA (RT-PCR): Genexpression, RNA-Nachweis

3. Medizin,Pflanzen-,Lebensmittel-Umweltanalytik

• Zusammenhang Funktion/Erscheinung und DNA-Sequenz

• Krankheitsbild und DNA-Sequenz

• Überprüfung von Material auf Anwesenheit transgener Pflanzen

• Überprüfung von Material auf Gegenwart infektiöser Keime

z.B. Blut vom Tatort und eines Verdächtigen

1. DNA wird isoliert

2. Proben-DNA wird mit verschiedenen

   Restriktionsenzymen verdaut

3. Auftrennung der Fragmente mit Gelelektrophorese

4. Transfer der Fragmente auf Membran

5. Hybridisierung mit geeigneter Sonde

6. Veränderungen im Bandenmuster zeigen Mutationen

Vorteil:

• komplexe DNA-Gemische (Blutproben) können direkt ohne Aufreinigung analysiert werden

Nachteil:

• nur relativ große Mutationen (Deletionen, Insertionen) werden nachgewiesen. Punktmutationen nur wenn Restriktionsenzym-Schnittstelle geschaffen oder zerstört wird

Anwendung:

• Diagnostik

  • Sichelzellenanämie:

    • Fragment mit 13 kbp bei 70% aller Kranken, nur bei 3% Gesunder zu finden

  • Mukoviszidose: 75 % aller Kranken zeigen gleiches Muster

• Forensik:

  • Mutterschafts- und Vaterschaftstest (DNA-Fingerprint Nachweis von Mutterschaft – für Einbürgerung in England) DNA-Fingerprints aus Spuren am Tatort

Heute eher PCR

• Klonierungsvektor, der u.a. einen wirtseigenen Promotor enthält. Dieser liegt meistens knapp oberhalb („stromaufwärts“) derRestriktionsschnittstelle, in die der kodierende Bereich eines Gens im richtigen Leserater eingesetzt werden kann.

• Wirtszellen

  • a) Prokaryonten: Bakterien keine posttranslationale Modifikation der Proteine

    • wenn ein eukaryontisches Gen hier eingesetzt wird dann kann dieses transkribiert und translatiert werden, allerdings fehlt in den Bakterien oft das Spleißsystem, sodass das codierte Protein nicht generiert wird

    • große Polypeptidketten werden of nicht synthetisiert

    • Glykolisierung und Phosphorylierung der Proteine ist oft nicht entsprechend

    • —> aus den Gründen werden oft Hefezellen angewendet wenn eukaryontische DNA repliziert werden soll

  • b) Eukaryonten: Hefen (enthalten auch Plasmide!) „Shuttle“-Vektoren können sowohl in Bakterien wie in Hefen vermehrt werden. posttranslationale Modifikation der Proteine (jedoch anders als bei Tieren/Menschen und Pflanzen)

• Ereknnungssequenzen: sind Palindrome, hei0t sie können von vorne oder hinten gleichermaßen erkannt werden  

je größer die DNA, desto kleiner der Prozentanteil an Agarose

5-60kb DNA—> 0,2 Prozent Agarose

Häufig sekundarstrukturen:

• Hairpin

• loop

• Nukleotid besteht aus Ribose, Base und Phosphat

• Informationsträger zwischen DNA und Protein (

  • mRNA (von DNA zu RNA)

  • tRNA (mRNA zu Protein) —> AS Bildung

• Regulation (kleine regulatorische RNA-Moleküle, lange nicht-codierende RNAs)

• Strukturkomponente von Riboproteinen (rRNA, snRNA)

• Katalyse (Ribozyme, snRNA, rRNA)

• häufig sekundarstrukturen:

  • loop und hairpin

• Cis Elemente (sind Teil der DNA):

  • Enhancer (positive Regulation; Aktivatorproteine binden) wirken verstärkend auf Core Promotor (Kern Promotor) --> Gen wird stärker abgelesen

  • Silencer (negative Regulation; Repressorproteine binden) wirken abschwächend auf Core Promotor (Kern Promotor) --> Gen wird schwächer abgelesen

• Trans Elemente (Transkriptionsfaktoren) regulieren cis-Elemente: (meistens Proteine)

  • Transkriptionfaktoren: Proteine, die abschwächend oder aktivierend auf cis Elemente einwirken

• wenn Signalkette stattgefunden hat und

• Transkriptionsfaktoren

  • Protein, dass an Kontrollelemente bindet.

• Kontrollelemente in der DNA (cis- Elemente) können Tausende von Nukleotiden vom Gen entfernt sein oder aber direkt am Promotor sitzen.

• Enhancer and Silencer

• DNA wird von 3´ Richtung 5´abgelesen, sodass sich ein 5´ 3´ RNA Strang bildet

• RNA wird 5´Richtung 3´ abgelesen, wenn sie translatiert wird (AS bildung)

Chemisch erfolgt die RNA-Synthese wie die DNA-Synthese:

1. Die OH-Gruppe am C-Atom 3 der Ribose (bzw. Desoxyribose) greift die Bindung zwischen α− und β-Phosphat eines Nukleotid- Triphosphats an, das nun in einer Kondensationsreaktion angehängt wird

• RNA ist instabiler! (einsträngig, zusätzliche OH-Gruppe an Ribose)

• Prinzipiell kein Unterschied zwischen Isolation von RNA und DNA.

• Unterscheidung zwischen DNA und RNA erfolgt über den pH-Wert der verwendeten Puffer.

• RNA extrem anfällig für Degradierung, Grund: RNasen.

• RNasen sind sehr stabil und brauchen keine Mg2+- Ionen als Cofaktoren. Kommen praktisch überall vor. Autoklavieren hilft nicht immer.

• Handschuhe, Verwendung von RNase-Inhibitoren und speziellem Satz an Werkzeugen

• Verschiedene Methoden (CTAB, Phenol, Silicamembran).

z.B. RNA-Seq, auch „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“

• Isolation of mRNA

• “Long RNAs are converted into a library of cDNA fragments through either RNA fragmentation or DNA fragmentation.

• Sequencing adaptors (blue) are subsequently added to each cDNA fragment.

• A short sequence is obtained from each cDNA using high-throughput sequencing technology.

• The resulting sequence reads are aligned with the reference genome or transcriptome.”

a) Guanidinisothiocyanat =

• chaotropes Salz, dass Proteine denaturiert  (RNasen sind auch Proteine!)

b) SDS =

• anionisches Tensid (Tenside haben hydrophoben und hydrophilen Anteil; nach Abspaltung des Gegenions negativ geladen; sorgt für Zellaufschluss (denaturiert Membranen und Proteine)

c) Mercaptoethanol =

• Reduktionsmittel (reduzieren Stoffe, z.B. Proteine, lösen Disulfidbrücken); Reinigung von Enzymen, RNA und DNA; Ethanol mit Thiogruppe

d) EDTA =

• Komplexbildner für Zweiwertige Kationen; Mg2+ wegfischen

e) Phenol =

• Ausreinigung von Proteinen (Proteine ausfällen; Zellen von Proteinen reinigen)

• Der pH-Wert des Phenols zur RNA Isolierung muss im Sauren liegen.

• So werden kleinere DNA-Fragmente im Phenol gelöst und größere DNA sammelt sich in der Interphase. RNA bleibt im wässrigen Überstand.

f) Chloroform =

• Ausreinigung von Phenol (Teil des Phenols aus der wässrigen Phase (wo die Nukleinsäuren drin sind) entfernen); und Zellen von Proteinen reinigen

g) Ethanol =

• Ausfällen von Nukleinsäuren (wird versucht ins Pellet zu bekommen)

h) Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) =

• kationisches Tensid (nach Abspaltung des Gegenions positiv geladen) wird als Detergens verwendet (Pflanzen enthalten z.B. sehr viele Polysaccharide und Polyphenole , die die RNA Isolierung stören, daher Verwendung von CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid, welches Polysaccharide komplexiert.)

 N-Laurylsarcosin

• Das Natriumsalz des N-Lauroylsarcosins besitzt, im Gegensatz zu SDS, eine gute Löslichkeit in chaotropen Hochsalz-Lösungen und ist daher das Detergens der Wahl in guanidiniumhaltigen Zelllyse- Puffern.

• Als Salz anionisches Tensid

• 
  

• Merceptoethanol

• Dithiothreitol

• Glutathion

• Cystein

Erforschung von Genexpression

• in einzelnen Zellen

• Geweben oder Organismen

• im Vergleich unter unterschiedlichen Umweltbedingungen

• Isolierung von RNA

• Umschreibung der RNA in Erststrang-cDNA mit reverser Transkriptase (RT)

• Verwendung der cDNA als Matrize für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

• PCR mit spezifischen Primern

• Auftrennung der PCR-Produkte auf Agarosegel

• Complementary DNA: mRNA wird mit Hilfe von Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben

• Primer: ein Oligo(dT) (18-30 Thyminbasen). Primer ist komplementär zu Poly-A-Schwanz der mRNA.

• Reverse Transkriptase-Reaktion: Alle mRNA-Moleküle werden umgeschrieben. Summe aller in der Zelle vorkommenden RNA-Kopien für proteincodierende Gene: Transkriptom.

• cDNAs enthalten keine Introns

• Erfolg abhängig davon, ob das

  gewünschte Gen im Moment der RNA-Präparation exprimiert wurde

danach: PCR

• Matrizen-cDNA

• zwei spezifische Oligonukleotidprimer

• eine thermostabile DNA polymerase, z.B. Taq aus Thermus aquaticus

• Nukleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Eine Form der quantitativen RT-PCR

• Verfahren wie bei RT-PCR (Ausgangsmaterial mRNA und Reaktion mit Reverser Transkriptase → cDNA, dann PCR)

• Zusätzlich Quantifizierung des PCR-Produkts und damit Rückschlüsse (Quantifizierung) des Ausgangsprodukts (mRNA bzw. cDNA)

• Wichtig ist die Menge der eingesetzten RNA (cDNA), da dies der Bezug ist

• Beruht auf der Detektion und Quantifizierung eines fluoreszierenden Reporters, dessen Menge proportional zur Menge der PCR-Produkte in einer Reaktion ist

• dieser Reporter kann z.B. ein ds-DNA-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff sein (SYBR Green)

  • Nachteil: bindet auch an Primer-Dimere und unspezifische Produkte

- Einbringen des DNA-Abschnitts in z.B. Bakterien

- Vermehrung

- Isolierung der Plasmide/DNA

- Reinigung

- Sequenzierung

- Vermehrung durch PCR

- Auftrennung im Gel

- Isolierung und Reinigung

- Sequenzierung

• Maxam and Gilbert (1977)

  • basenspezifische Spaltung der DNA durch geeignete Reagenzien und anschließender Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese

• Sanger (1977)

  • Didesoxy- Nukleotid-Methode/ Kettenabbruch Methode

• Pyrosequenzierung

1. Hybridisierung von einzelsträngiger Template DNA und Primer

2. Dna Synthese

3. Detektion (bei passendem Nukleotid)

   1. ATP Sulfurylase Reaktion: PP + Adenosin- 5`-phosphosulfat—> ATP

   2. Luciferase Reaktion: ATP + Luciferin—> Oxyluciferin + Licht (Licht wird erkannt)

4. Abbau von nicht eingebauten Nucleotiden und ATP durch Apyrase, so dass die Reaktion mit einem anderen dNTP erneut durchgeführt werden kann

• enthält Kerngenom

  • 1,5 mal 10 hoch 8 Basenpaare in Arabidopsis

  • 3.2 mal 10 hoch 9 Basenpaare im Menschen

  • 2 mal 10 hoch 11 Basenpaare in Gymnospermen

• Funktion:

  • Regulation des Stoffwechsels des Wachstums der Zelldifferenzierung

  • Transkription

  • Replikation

• Kernhülle

  • 2 membranen, Kernporen

  • vermutlich kommen diese 2 Membranen aus dem ER

m/z Masse pro Ladung

Ionenerzeugung: Chemische Ionisation und MALDI (Matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation)

Ionentrennung: TOF (Time of flight) und Elektrische / Magnetische Ionenfallen

Elektronenmikroskop

5 bis 20 um

Lichtmikroskop geht bis 8 um = man kann es mit dem Mikroskop sehen

• Primär: AS Ketten

• sekundär Alpha Helix und Beta Faltblatt

• Tertiär Faltung der Polypeptitkette

• Quartär: Protein mit mehreren Untereinheitn Protein Oligomer

• räumliche Anordnung/ orientierung: Konformation

• Untereinheiten werden verbunden durch Wasserstoffbrückenbindungen oder ionische Bindungen oder Disulfidbrücken (s+s) oder van-der-waals Kräfte

Disulfidbrücken werden reduziert und aufgelöst, Haar wird verbogen und dann wieder oxiiert

dadurch gibt es neue Disulfidbrücken an stellen, wo vorher noch keine waren—> Locken

Prokaryonten: Formyl-Methionin

Eukaryonten: Methionin

Mitochondiren und Chloroplasten: Formyl-Methionin

• Zentrifugation separiertr Zellkomponenten auf der Basis von Größe und Dichte

  • wiederholte Zentrifgation bei immer höheren Geschwindigkeiten trennt Zellhomogenisate in bestimmte Bestandteile auf

    • 1. Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit

      —> Überstand + Pellet (ganze Zellen, Zellkerne, Cytoskelett)

    • 2. Zentrifugation bei mittlerer Geschwindigkeit

      —> Überstand + Pellet (Mitochondrien, Lysosomen, Peroxisomen)

    • 3. Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit

      —> Überstand + Pellet (Mikrosomen, andere kleine vesikel)

    • 4. Zentrifugation bei sehr hoher Geschwindigkeit

      —> Überstand + Pellet (Ribosomen, Viren, größere Makromoleküle )

• Trennung von löslichen Proteinen ist einfacher als von membrangebundenen Proteinen (schwieriger)

• Einsatz von Detergenzien z.B. Triton X-100, Tween 20

• Vorteil: Detergenzien lösen Proteine

• Nachteil: denaturieren die Proteine

• Zerreiben mit Al2O3

• Schütteln mit Glasperlen

• Ultraschall

• Druckexpansion (French press)

• Mixer

• Erster Aufreinigungsschritt: grob, aussalzen mit Ammoniumsulfat (einige Proteine entfernen)

• Manche Ionen initiieren hydrophobe Interaktionen und wirken präzipitierend, „antichaotrope Salze“ z.B. Ammonium-Kationen.

• Präzipitieren /Ausfällen/Pelletbildung

Hohe Konzentration = Löslichkeit der Proteine verändert sich im nächsten Schritt löst sich die Kernhülle der Proteine auf

• Aufreinigung bzw. Anreicherung eines Enzyms: z.B. Malat-Dehydrogenase d.h. spezifische Aktivität dieses Enzyms in der Lösung soll erhöht werden

• Aufreinigungsschritte, z.B.

  • 1. grob,aussalzenmitAmmoniumsulfat

  • 2. Ionenaustauschchromatographie

  • 3. Gelchromatographie

  • 4. Affinitätschromatographie

• Nach jedem Schritt

  • 1. Nachweis der Aktivität der Malatdedydrogenase (= gesuchtes Protein)

  • 2. Nachweis der Proteinmenge in der Probe bzw. der Fraktion

Daraus wird nach jedem Schritt die spezifische Aktivität, d.h. die Anreicherung und die Ausbeute (über die Gesamtenzymaktivität) bestimmt

• Die Aktivität eines Katalysators/Enzyms ist ein Maß dafür, wie schnell ein Katalysator Edukte zu Produkten umsetzt

• 
  

1 kat = 6·107 U 1 U = 16,67·10-9 kat = 16,67 nkat

Quantitative Bestimmung von (Gesamt-)Protein:

Reaktionen:

• 1. Biuretreaktion:

  • Bildung blau-violetter Komplexe zwischen Peptidbindungen und Cu(II)-Ionen im alkalischen

• 2. Cu(II) wird zu Cu(I) reduziert.

• 3. Cu(I) wiederum reduziert das gelbe Folin Reagenz zu Molybdänblau (Folin = Molybdän(VI)- und Wolfram(VI)-Heteropolysäuren).

• Messung: Photometrie bei 750, 650 oder 540 nm

• Nachweisgrenze: etwa 1 μg Protein/ml

• Nachteil: zeitaufwendig, störanfällig (EDTA, Triton X-100 oder Ammoniumsulfat)

• Prinzip:

  • Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 (CBBG) bildet in saurer Lösung mit kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen Komplexe.

  • Maximum des Absorptionsspektrum verschiebt sich von 470 nm auf 595 nm

• Messung: gegen freies Farbreagens photometrisch bei 595 nm

• Nachweisgrenze: ca.10 μg Protein/ml

• Vorteile: einfach und schnell

• Nachteile:

  • Kalibrierung nötig

  • Störanfällig (SDS, Harnstoff, DTT (Dithiothreitol)

  • nicht-lineare Standardkurve über einen großen Bereich

  • Farbreaktion kann für verschiedene Proteine unterschiedlich sein

• gelöste Substanzmischungen werden mit Hilfe einer mobile Phase (Gas- oder Flüssigkeit) über eine stationäre Phase geleitet

• Trennung der Substanzen durch chemische Reaktion mit Trennmedium

Stationäre Phase

• 1. Säulen

• 2. Dünnschichtchromatographie

für Proteine:

Moleküleigenschaft —> Trennmethode

• Ladung —> Ionenaustausch-Chromatographie

• Größe, Form —>Ausschluss - oder Gelfiltrations-Chromatographie

• Biospezifität —> Affinitäts-Chromatographie

• Hydrophobizität —> Hydrophobe Interaktion Reversed Phase

• Komplexierung —> Metallchelate

Synthetische Polymere

• Polyacrylamid ( Auftrennung von Proteinen)

Anorganische Polymere

• Kieselsäure ( Metalle?)

Biopolymere:

• Agarose ( Auftrennung von Nukleinsäuren (DNA))

• Cellulose

• Dextran

  • stark verzweigte Polysaccharide;

  • Reservestoffe in Hefen oder Bakterien;

  • Molekülgröße 10.000-50.000.000 kD;

  • bilden je nach Molekularmasse in Wasser hochviskose Flüssigkeiten

Anorganische Polymere

• Kieselsäure

5‘

• Hohe Salzgehalte in einer Lösung = Erhöhung der Oberflächenspannung.

• —> Abtrennung der Wasserhülle des Proteins

• —> hydrophobe Bereiche werden dadurch präsent.

• —> Die hydrophoben Bereiche der Proteine „kleben“ aneinander und werden schließlich ausgefällt.

• Manche Ionen initiieren hydrophobe Interaktionen und wirken präzipitierend, „antichaotrope Salze“ z.B. Ammonium-Kationen.

• Andere können Wechselwirkungen unterbinden (chaotrope Salze)

Elution mit steigender Salzkonzentration

1. die Proteine binden unterschiedlich stark an die fixierten Ladungen der stationären Phase.

2. Veränderung und Elution der Proteine durch die steigende Salzkonzentration des Eluenten.

Beispiel: Eine Gelmatix trägt z.B. Carboxylat-Gruppen, an die bei pH 7,0 positiv geladene Proteine binden. Durch Zugabe von NaCl (oder anderes Salz) kann das Protein wieder von den Carboxylat-Gruppen abgelöst werden, da nun die Na+-Ionen mit den positiv geladenen Gruppen des Proteins um die Bindung am Ionenaustauscher konkurrieren. Proteine mit geringer positiver Nettoladung werden eher verdrängt als Proteine mit hoher positiver Ladung.

Natürliche: Laufgeschwindigkeit abhängig von Größe und elektrische Ladung

denaturierende: Laufgeschwindigkeit abhängig von Größe

1. Ionenaustauscher Chr.

2. Gelfiltration chr

3. Affinitätschr.

• von oben nach unten wird der Graph zu den Proteinen immer genauer

• es wird versucht die genaue Proteinaktivität in einer Lösung zu finden; pro Durchgang wird selektiert; da wo am meisten Aktivität drin ist, die werden für den nächsten Schritt durchlaufen

• 4. schritt: Überprüfung mit Polyacrylamidgel Elektrophorese; ungefähre Masse des gesuchten Proteins ist bekannt

Elution mit unterschiedlichen pH-Werten ist ebenfalls möglich

a) Im sauren pH-Bereich sind die Aminogruppen (hauptsächlich der basischen Aminosäuren; welche sind das?) protoniert und das Protein tritt als Kation auf.

b) Im basischen pH-Bereich überwiegen die negativen Ladungen an den Seitenketten der sauren Aminosäuren (welche sind das?) und das Protein tritt als Anion auf.

• Aufteilung nachb Größe

• Variablen:

  • Trenngel

  • Puffer

  • pH-Wert

  • Säulendimensionen

• Gelmaterial mit Poren in verschiedenen Größen

• danach wieder Einteilung in Fraktionen

Beispiel Antikörper gegen MDH Antigen = MDH

Beispiel Malat-Dehydrogenase (MDH):

1. Es wurden Antikörper ( ) gegen die MDH produziert.

2. Antikörper wurden an ein Trägermaterial gebunden.

3. Säule wird damit bestückt.

4. Vereinigte Fraktionen der Gelchromatographie (siehe Folie 55) werden auf die Säule aufgetragen.

   MDH ( ) bindet an Antikörper ( ). Alle anderen Proteine laufen durch die Säule durch.

5. Anschließend wird die gebundene MDH wieder von den Antikörper-Trägermaterial-Verbindungen gelöst. Dies erfolgt mit freiem Antikörper.

   
   

• Chromatographie: Analytik und Fraktionierung Trennung durch chemische Reaktion mit Trennmedium

• Elektrophorese: Analytik und Fraktionierung Trennung nach elektrischer Oberflächenladung und Größe (Wanderung durch ein elektrisches Feld), keine Reaktion mit Trennmedium

• Massenspektroskopie: Analytik Trennung nach Masse pro Ladung (m/z)

• Die Summe aller Ladungen eines Proteins ist bei einem bestimmten pH-Wert gleich null = isoelektrischen Punkt (pI) des Proteins.

• AS können sowohl Säuren als auch Basen fungieren und dementsprechend Proteine aufnehmen oder abgeben

  • chemische Verbindung die als Ampholyte bezeichnet wird

• pH- Gradient

  • pH 9, Überschuss an OH-, Proteine mit vielen basischen AS werden neutral und unbeweglich

  • pH 7, OH- und H+, Proteine mit vielen neutralen AS werden neutral und unbeweglich

  • pH 3, Überschuss an H+, Proteine mit vielen sauren AS werden erst hier neutral und unbeweglich

• denaturierende Page

• Detergenz: Natriumdodecylsulfat (SDS)

• Laufgeschwindigkeit abhängig von der Größe

• SDS PAGE ist negativ geladen, sodass dieses Gel die Eigenladung der Proteine überdeckt

• BILD

• Funktion:

  • schärfere Banden erzeugen

• Prinzip:

  • Auftragung auf ein weitporiges Sammelgel zwischen Chlorid-Ionen mit hoher Mobilität und Glycin-Ionen mit niedriger Mobilität

  • Zwischen diesen Ionen sammeln sich die Protein-Ionen.

  • Beim Eintritt in das kleinporigere Trenngel, werden die Protein-Ionen stark abgebremst, sodass sie von den Glycin-Ionen überholt werden, die durch höheren pH Wert ionisiert sind.

• Sammelgel: pH 6,8

  • Glycin (nur teilweise ionisiert, geringe Mobilität) Proteine Cl- (hohe Mobilität)

  • eng- maschiger

• Trenngel: pH 8,8

  • Proteine Glycin– (völligionisiert) Cl-

• Antikörper haben (hohe) Spezifität für Antigen

• Möglichkeit, um Antigene, meistens Protein, sichtbar zu machen

• Die Antikörper sind entweder direkt - mit einem Enzym (setzt ein Substrat in

  Farbe oder Chemolumineszenz um), - oder mit Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt

• oder werden mit einem Sekundärantikörper, der an den ersten (Primärantikörper) bindet und entsprechend markiert ist, nachgewiesen.

1. Immunohistochemie: Nachweis eines Antigens auf einer Zelloberfläche, in Zellen oder Organellen mittels Antikörpern auf Gewebsdünnschnitten (Cryo- oder Paraffinschnitte) und damit indirekter Nachweis von Zelltypen, Differenzierungsstadien etc.

   1. Veraltet, also muss man nur wissen, dass es das gab

2. Western Blot

3. ELISA

• Enzyme-linked Immunosorbent Assay

• Quantifizierung von Antigenen oder Antikörpern im Serum, Zellsuspensionen etc. mittels enzymgekoppelter Antikörper

• z.B. Schwangerschaftstest

• Nachweis von Hormonen oder Antigene

1. Erster Antikörper wird befestigt, welcher an spezifisches Antigen (gesuchtes Proteine) bindet

2. Probe mit entsprechendem Antigen wird zugegeben und Antigen bindet an Antikörper

3. Zweiter Antikörper mit Detektionsenzym wird zugegeben.

   Die durch das Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens.

   Das Enzym setzt ein Substrat um und das Reaktionsprodukt kann z.B. durch Farbumschlag nachgewiesen werden.

   Die Signalstärke ist im allgemeinen eine Funktion der Antigenkonzentration, so dass ELISA auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann. 25

1. Primärer Antikörper bindet an sein Antigen, welches auf einer Membran fixiert ist.

2. An diesen wiederum bindet der sekundäre Antikörper, der z. B. mit dem Enzym HRP (horseradish peroxidase, Meerrettich-Oxidase) gekoppelt ist.

3. HRP katalysiert die Umsetzung von Luminol in seine oxidierte Form, dessen Chemilumineszenz detektiert werden kann.

• immunologischer Test auf hCG-Hormon im Urin

  • kommt im Gewebe in der Plazenta vor

• 
  

• Epitop: die stelle, auf dem Antigen, welches vom Antikörper (Paratop) erkannt wird

• Paratop = Antigen- bindungs- stelle

• Immunglobulin Klassen: A, D, E, G, M

• Ig G ist der meist genutzte analytische Antikörper (kann induziert werden, 150 kDa, gut löslich usw.)

• Polyklonale Antiseren sind eine Mischung aus verschiedenen gegen diverse Epitope (antigene Determinante, Antikörper- Bindungsstelle) gerichteten Antikörpern.

• polyklonal: aus mehreren Zellen hervorgegangen (können ein Stück weit unterschiedlich sein)

• Nutzen von Polyklonalen Antikörpern

  • Antigen auswählen: Zunächst muss das Antigen, gegen das der Antikörper gerichtet sein soll, ausgewählt und produziert werden. Entweder wird das Protein isoliert oder ein Peptid aus einem Protein wird in vitro synthetisiert.

  • Immunisierung: Anschließend wird das Peptid einem Tier gespritzt, dessen Immunsystem dann Antikörper dagegen bildet. Als Antikörper-Produzenten werden besonders Kaninchen oder Mäuse verwendet, aber auch Ziegen oder Schafe verwendet.

  • Serumentnahme: Nach ein paar Wochen wird dem Tier Serum entnommen. Dies enthält gegen das Antigen gerichtete polyklonale Antikörper.

• Möglichkeit auf künstlichem Wege monoklonale Antikörper herzustellen (Köhler und Milstein, Nobelpreis 1984):

• Fusionierung von B-Zellen aus einer immunisierten Maus (produzieren Antikörper, können sich aber nicht teilen) mit Maus-Tumorzellen (sind unsterblich).

• Klon, der von einer einzelnen fusionierten Zelle abstammt, wird selektioniert und vermehrt.

• Diese Zellen produzieren einen identischen Antikörper.

• SDS-Gel oder 2D-Gel

• Bande/Spot ausschneiden

• Tryptischer Verdau der Proteine

• Massenspektrometrie: die Bestimmung der Masse des Proteins und aller seiner vorhersagbaren Peptidfragmente (Peptid-Fingerabdruck) Ionenquelle Massenanalysator Detektor

• Datenbanksuche Abgleich der Massen in Datenbanken mit bekannten Protein- und Peptidmassen

BILD

• frühere Methode zur Aminosäure Sequenzanalyse

• chemische Analyse zur Auftrennung

1. ein Kristall des zu untersuchenden Stoffes wird gezüchtet

2. der Kristall wird dann mit Röntgenstrahlen durchleuchtet

3. diese werden charakteristisch an den Atomen gebeugt.

4. aus der Ablenkung der Strahlen werden die räumliche Struktur und die Atompositionen errechnen.

5. heute werden hieraus am Computer Modelle erstellt.

• Oligonukleotide werden synthetisch hergestellt und in die Zelle eingeschleust.

• an einer bestimmten Stelle im Genom wird eine Mutation eingeführt

• verändert nur ein oder einige wenige Basenpaare verändert

  • Gene werden gezielt ausgeschaltet oder aktiviert

• Genome editing Verfahren

• Vorteil zur klassischen Mutagenese mit Hilfe von Strahlung oder chemischen Stoffen:

  • Mutationen können ganz gezielt an definierten Stellen der DNA hervorgerufen werden

  • weniger unbeabsichtigte Mutationen im Genom ausgelöst.

Es werden nicht mehr „fremde“ Gene von außen eingeführt, sondern einzelne, in einer Pflanze vorhandene DNA- Bausteine gezielt entfernt oder „umgeschrieben“

• Überexpressionen:

  • vermehrte Produktion eines Genprodukts (meist mit viralem Promotor)

• „knock-out“ Population:

  • verringerte Produktion eines Genprodukts („knock-down“)

    • Anwendung:

      • Funktionsanalyse für bestimmte Gene bzw. Proteine

      • Medizin: Unterdrückung der Aktivität bestimmter Gene, z.B. Onkogene

      • Nahrungsmittelindustrie: Produkte mit veränderten Eigenschaften

  • oder gar nicht mehr vorhanden („knock-out“)

• Organismen mit weiteren Fremdgenen:

  • Einbringen neuer Eigenschaften

• Plasmid DNA

• Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme)

• DNA-Ligase Rekombinante

• DNA Klonierungstechniken

• Transformationsmethoden

• Regeneration der Organismen

• Selektionsmarker

Organismen, die Gene aus anderen Organismen enthalten

1. Protoplastentransformation

1. a)  z.B. durch CaCl2 oder PEG kompetent gemachte Protoplasten von Mais oder Reis (typische Methode für Bakterien)

2. b)  Elektroporation: mit einem kurzen Stromstoß bei hoher Voltzahl werden kurzzeitig Löcher in die Plasmamembran der Zellen erzeugt (z.B. für Bakterien und Hefen)

3. c)  Mikroinjektion in Zellen direkt (eher bei Tierzellen)

Protoplast: Zelle ohne Zellwand

Partikelkanone

2. Partikelkanone

• Mikroprojektile aus Wolfram oder Gold (Durchmesser 1-4 μm) werden mit DNA überzogen und auf bzw. in Zellen geschossen.

• Beschossen werden embryonale Zellen, Kallus, Pollenschlauch oder Blätter

3. Agrobacterium tumefaciens

bei dikotylen Pflanzen (heute auch monokotyle Pflanzen)

• 1 und 2 beruhen auf einer anschließenden homologen Rekombination mit dem Genom des Zielorganismus.

• im Kerngenom von Pflanzen selten

• Daher wird bei Pflanzen häufig eine andere Methode verwendet. Trans- formation mittels Agrobakterium tumefaciens.

• führen dazu, dass Pflanzen Wurzelhalsgallen bilden (Tumorgewebe).

• Die befallenen Pflanzenzellen werden dazu veranlasst hohe Konzentrationen an Auxin und Cytokinin zu bilden, die dann das Tumorwachstum auslösen.

• Pflanzenzellen werden ebenfalls dazu veranlasst, aus Aminosäuren und Zucker sogenannte Opine (z.B. Octopin) zu produzieren (Nahrung fpr Agrobakterien)

• Zur Transformation der Pflanzenzellen benutzen die Agrobakterien die T-DNA des Ti-Plasmids#

• BILD

• Ti- Plasmid (200 kB) ermöglicht dem Agrobakterium die Übertragung und Integration spezieller Gene in das Genom von Pflanzen.

Die in die Pflanzenzelle übertragbare Transfer- oder t-DNA (= transferierte DNA = gelber Bereich in der Abb.)

1. LB (= left border) und RB (= right border) begrenzen t-DNA und signalisieren Beginn und Ende der t-DNA.

2. Opinsynthese-Gene (notwendig für die Synthese der Opine durch die Pflanzenzelle (Opine = Zucker-Aminosäure).

3. Tumorgenese-GenefürdieSynthesederPhytohormoneAuxin und Cytokinin, die gemeinsam für die Ausbildung des Tumors zuständig sind

Außerhalb der t-DNA liegen weitere Gene:

1. Gene für den Opinabbau, die den Bakterien erlauben, die von den Pflanzen ausgeschiedenen Opine zu nutzen,

2. der"originofreplication"(=ORI); Replikationsursprung, der die Verdopplung des Ti-Plasmids ermöglicht

3. VIR-Region: hier liegen die vir-Gene (VIR = Virulenz), ermöglichen es dem Bakterium infizierbare Pflanzen zu erkennen und codieren für Proteine, die die Übertragung der T-DNA auf die Pflanze katalysieren

4. der Bereich für die Konjugation, der Bakterien mit dem Ti-Plasmid erlaubt, das Plasmid auf Bakterien ohne das Ti-Plasmid zu übertragen

1. Die DNA, die in die Pflanzenzelle eingeschleust werden soll, wird nicht direkt in das Ti-Plasmid integriert, sondern wird – eingerahmt von RB- und LB-Sequenzen - in ein Plasmid eingebracht und in E. coli vermehrt.

2. Bei einem Helferplasmid wird die T-DNA- Region mitsamt rechter und linker Border entfernt, es behält aber die so genannten Virulenzgene (vir-Gene), deren Aktivität für die Übertragung der T-DNA in das Pflanzengenom erforderlich ist.

3. Beide Plasmide werden in einem Agrobakterien-Stamm zusammengeführt, mit dem anschließend eine Pflanze infiziert wird.

4. Gemeinsame Kultivierung von Agrobakterien und Pflanzen-Blattstückchen. Das eine Plasmid überträgt die „fremde“ T- DNA, das andere hilft durch die Aktivität seiner vir-Gene bei der Transformation. Die nicht transformierten Zellen werden mit Hilfe des Markergens selektiert. Aus den Blatt- stückchen werden wieder Pflanzen regeneriert.

• RNAi = natürlicher Regulationsmechanismus der Genexpression in fast allen Organismen

• z.B. auch zur Abwehr von Viren

• Kurze doppel-strängige (ds) RNA-Fragmente (siRNA, small interfering RNA, etwa 20 Nukleotide lang), die in ihrer Sequenz dem Zielgen entsprechen, führen zum Abbau der entsprechenden mRNA .

• die ds-siRNAs lassen sich synthetisch herstellen und in die Zelle injizieren

• Gen silencing

  • Das Enzym Dicer (= RNAse) schneidet doppel-strängige RNA in kürzere Stücke (small interfering RNA siRNA; ca. 21 Nukleotide)

  • siRNA-Duplex wird in einen Protein-Komplex eingebaut, den RNA-induced silencing complex (RISC), mit Argonauten-like Proteins als Komponente

  • RISC entfernt einen der beiden RNA-Stränge und RISC begleitet den verbleibenden kurzen RNA Strang zur komplementären Ziel-mRNA ( )

  • RISC enthält Endonuclease, die die mRNA an einer definierten Stelle schneidet

  • durchtrennte mRNA ist nicht mehr durch cap oder poly-T Schwanz geschützt und wird von zellulären RNasen abgebaut, d.h. keine Translation

    
    

    

• Antisense RNA (einzelsträngig) wird eingebracht und heftet sich an die mRNA. Doppelsträngige RNA wird nicht translatiert, sondern abgebaut.

• Nativ: Beim Menschen sind ca. 1600 antisense-Gene vorhanden. Bei manchen Genen ist ein zweiter Promotor am 3‘ Ende des Gens aktiv

• Kommerziell: Flavr-Savr-Tomate (Polygalaturonase unterdrückt); 32 Kartoffel „Amflora (Amylose-Produktion unterdrückt“)

• 
  

  

• CRISPR/cas-System im Genom vieler Bakterien und Archaeen gefunden

• verschafft Resistenz gegen bestimmte Viren oder Plasmide

  (bakterielle „Immunantwort“)

• CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

  sind Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats)

• cas: Gruppe von Genen nahe CRISPR (cas-Gene - CRISPR-associated),

  codieren für Endonukleasen Wikipedia

• System bildet die Grundlage der gentechnischen CRISPR/Cas-Methode zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen

• CRISPR/cas verschafft Bakterien Resistenz gegen Phagen/Viren

• Vereinfachtes Diagramm des CRISPR-Genlocus. Grauen Boxen = Repeats Bunten Striche = Spacer

• Bei einer Infektion spalten die Cas-Proteine die DNA der eingedrungenen Viren in kleine Fragmente auf.

• Diese werden dann in den CRISPR-Abschnitt des Bakteriums eingefügt, welche aus kurzen, sich wieder- holenden DNA-Sequenzen bestehen

• Bei einem erneuten Virenbefall werden diese CRISPR- Abschnitte in RNA umge- schrieben: Diese „prüft“ die Viren-DNA.

• Stimmt diese mit dem gespeicherten Abschnitt überein, wird sie durch die Cas- Proteine zerschnitten.

• cas9 (CRISPR-associated) kodiert für eine Endonuklease

• cas9 kann eine bestimmte RNA-Sequenz (RNA repeat) binden, wodurch sie aktiviert wird

• neben der RNA repeat-Sequenz befindet sich eine weitere RNA-Sequenz (RNA spacer), die an die Ziel-DNA bindet

• crRNA (repeat und spacer) sorgt für die räumliche Nähe von cas9 (bzw. Endonukleaseaktivität) und Ziel-DNA

  cr-sequence = GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG) Weitere Voraussetzungen

- z.B. PAM Motive in der Ziel-DNA

Ziel-DNA wird geschnitten

Der Doppelstrangbruch der DNA wird repariert (es gibt jedoch keine Matrize), so dass es zur Deletion oder anderen Fehlern kommt.

Durch cas9 mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können.

• RNA spacer-Sequenz wird ausgetauscht (zur DNA-Zielsequenz komplementäre RNA)

• RNA repeat ist vorhanden

• cas9 schneidet die DNA nahe der geänderten Zielsequenz.

• a) RNA-Interferenz(RNAi) (Antisense-RNA)

• b) CRISPR/casMethode

• c) Insertionsmutanten

• Anwendung:

  • Funktionsanalyse für bestimmte Gene bzw. Proteine

• Medizin:

  • Unterdrückung der Aktivität bestimmter Gene, z.B. Onkogene

• Nahrungsmittelindustrie:

  • Produkte mit veränderten Eigenschaften

• = Knock-out Mutanten (homolog oder heterolog) = Funktionsverlust-Mutanten

• Das Projekt mit dem Namen GABI-KAT (Kölner Arabidopsis T-DNA-Linien) umfasst 80.000 mutagenisierte und charakterisierte Arabidopsis thaliana K.-O.-Linien, die per Katalog bestellt werden können. Auch große Sammlung beim Salk-Institute.

• Um eine sog. T-DNA-induzierte Insertionsmutante zu erzeugen, wird ein in seiner Sequenz bekanntes und somit wieder auffindbares Fremdgen (T-DNA) in das Arabidopsis-Genom eingeschleust.

• Immer dann, wenn sich das Fremdgen zufälligerweise innerhalb eines Arabidopsis-Gens „einklinkt“ (inseriert), kann das betroffene Pflanzengen seine Funktion nicht mehr erfüllen – und gibt sich somit zu erkennen.

• Dunkelfeld

  • Feinere Strukturen ohne Eigenfärbung werden sichtbar

• Hellfeld

  • Licht dringt durch die Probe, gefärbte Proben

• Phasenkontrast

  • Konturen im Objekt treten plastisch hervor

• Polarisation

  • Strukturdetails können besser dargestellt werden

Fluoreszenz:

• Spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedriger Energie.

• Das emittierte Licht ist in der Regel energieärmer als das vorher absorbierte (20-50 nm Unterschied)

Fluoreszenzmikroskopie:

• Ein fluoreszierender Farb- stoff wird durch einen Fluoreszenzstrahl angeregt. Beobachtet wird das vom Farbstoff emittierte länger- wellige Fluoreszenzlicht.

• Entweder zeigen die Proben Eigenfluoreszenz oder sie müssen mit Fluoreszenz- farbstoffen markiert werden.

Endothelzellen im Fluoreszenzmikroskop.

• Die Mikrotubuli sind mit Fluoreszens- farbstoff grün markiert, Aktinfilamente sind rot markiert worden. Die DNA im Zellkern mit DAPI angefärbt.

• Gene für fluoreszierende Proteine werden als Reportergene verwendet

• Promotor eines zu untersuchenden Gens wird vorgeschaltet

• Genexpression wird lokalisiert z.B.

  • zellspezifisch

  • entwicklungsspezifisch

  • Umwelt-spezifisch

• Probleme:

  • Transkiptionskontrolle nicht nur über Promotor

  • transformierbare Organismen (Pflanzen) notwendig

  
  

• Promotor des zu untersuchenden Genes (gene of interest, GOI) isolieren

• dahinter kodierende Region des Reportergens anknüpfen

• Promotor-Reportergen-Konstrukt in einen Organismus einbringen

  • a) transiente Expression: nicht transgen, keine Integration in das Genom

  • b) stabile Expression: transgen, Integration ins Genom

• Aktivität des Reportergens messen, im lebenden Organismus

• Cis-Elemente

  • Teil eines Gens.

  • sowohl im Promotor als auch weiter strom- aufwärts zu finden.

    • Enhancer- oder Silcencer-Sequenzen.

• Trans-Elemente

  • Transkriptionsfaktoren und meistens Proteine.

  • Trans-Elemente binden an cis-Elemente.

  • Weitere Aktivator- oder Repressorproteine wirken ebenfalls regulierend.

• Die Gesamtheit der cis-/trans- Aktivitäten im Promoter bestimmt die Intensität, mit der die RNA- Polymerase die Transkription durchführt und damit die Regulation der Transkription.

• Die Basalfaktoren TATA- bindendes Protein und die Proteine A-H sind für die Transkription zwingend notwendig.

• Die Basalfaktoren können die Transkription aber weder beschleunigen noch verlangsamen.

• Diese Aufgabe erfüllen die Regulatormoleküle (trans-Elemente), Aktivatoren oder Repressoren, deren Kombination für jedes Gen anders ist.

• ermöglicht die regulierte Expression eines Gens • Bindungsstelle für RNA-Polymerase

• Der Promotor ist Teil der „Gen-regulatorischen Bereiche“. (= Core-Promotor und weiter vom Gen entfernte Nukleotid-Sequenzen)

• Cis-Elemente sind im (und vor dem) Promotor eingelagert - kurze, variable Sequenzen

• allgemeine (Core-)-Promotorelemente z.B. TATA Box bei Archaeen und Eukaryonten

• Transkriptionsfaktoren binden an cis-Elemente (6-10 nt)

• weitere Regulationselemente (Aktivatoren, Repressoren) binden an weiter stromaufwärts liegende Regionen und unterstützen die Bindung der Transkriptionsfaktoren

• Eigenschaften

  • leicht nachweisbar, z.B. durch enzymatische Reaktion

  • keine schädigenden Einflüsse auf die Zelle

  • Menge an Produkt bzw. Proteinaktivität zeigt Aktivität des Promotors an

• Abhängig vom biologischen System • qualitativer und/oder quantitativer Nachweis

• Reportergene, die zu den entsprechenden Reporterproteinen exprimiert werden

  • GFP (green fluorescence proteine) und Varianten-

  • ß-Galactosidase (lacZ-Gen) (siehe Blau-weiß-Selektion in Vorlesung „DNA“)

  • ß-Glucuronidase

  • Luciferase

Grün fluoreszierende Proteine (GFP green fluorenscent protein)

• aus der Qualle Aequorea victoria

•  fluoresziert grün bei Anregung (intrinsische Fluoreszenz)

• GFP: 238 Aminosäuren, 27 kDa,

• 1992 bereits cDNA von GFP kloniert

BILD

• Herstellung von Promotor, GOI und GFP-DNA Fusionen

• Einbringen in Vektor, der von Zellen aufgenommen werden kann

• Fusionsprotein wird in Zellen hergestellt

• Das zu untersuchende Protein wird an die „richtige“ Stelle transportiert

• GFP wird über Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen

Zellspezifische Analyse von Expressionsmuster

Enzym aus Escherichia coli

• Anwendbar bei Organismen mit sehr geringer ß-Glucuronidase Aktivität - höhere Pflanzen, Moose

• Nachweissystem z.B. histochemisch mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronid (X-Gluc); nach Spaltung Blaufärbung

Zellspezifische Analyse von Expressionsmustern über Nachweis

• Enzym aus Escherichia coli

• Anwendbar bei Organismen mit sehr geringer ß-Glucuronidase Aktivität - höhere Pflanzen, Moose

• Nachweissystem z.B. histochemisch mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronid (X-Gluc); nach Spaltung Blaufärbung

1. Laserlicht wird genutzt, um Fluoreszenzfarbstoffe anzuregen.

2. Durch eine Lochblende kommt nur das Fluoreszenzlicht eines winzigen Teils der Probe in den Detektor (Mikroskop).

3. Bis zu einem Femoliter (1*1015 l) aktuelle Teilprobengröße???

4. „Anregungslicht nur in der aktuellen Fokusebene wirksam“

5. Das Objekt wird Schicht für Schicht durchscannt.

6. Rekonstruktion 3-dimensionaler Bilder.

• Stimulated Emission Depletion Mikroskopie

• umgeht die bisherige Auflösungsgrenze

• Bisherige Grenze der Licht-, Fluoreszenz-, Laser-Raster-Mikroskopie

  • In einem Lichtmikroskop können zwei Objekte nicht mehr voneinander unterschieden werden, sobald ihr Abstand kleiner ist als die halbe Lichtwellenlänge ist (ca. 200 nm).

  • 1873 von Ernst Abbe entdeckt

  • Schuld ist die Beugung des Lichts an den beiden Objekten, wodurch sie im Auge des Beobachters (bzw. Mikroskops) zu einem Objekt verschwimmen.

Bei der STED-Mikroskopie werden Fluoreszenzfarbstoffe zum Markieren einzelner Bereiche eines Präparats eingesetzt. Solche Farbstoffe können durch Licht bestimmter Wellenlängen „angeregt“ werden: Sie absorbieren ein Photon und gehen in einen energiereicheren Zustand über. Aus diesem Zustand können sie nach kurzer Zeit spontan durch Aussenden eines Photons größerer Wellenlänge wieder in den Grundzustand zurückkehren. Diese spontane Abstrahlung von Licht nennt man Fluoreszenz.

Ein angeregtes Farbstoffmolekül kann außer durch Fluoreszenz auch durch stimulierte Emission wieder in den Grundzustand zurückkehren. Dies passiert, wenn das angeregte Farbstoffmolekül mit Licht von ungefähr der gleichen Wellenlänge wie der des Fluoreszenzlichts bestrahlt wird. Das angeregte Farbstoffmolekül kann so zum sofortigen Übergang in den Grundzustand durch Aussenden eines Photons exakt derselben Wellenlänge stimuliert werden. Spontanes Fluoreszenzlicht kann dann nicht mehr ausgesandt werden, das Molekül ist ja nicht mehr im angeregten Zustand.

Fluoreszenzmoleküle können also durch stimulierte Emission ausgeschaltet werden: Wenn sie zur Emission des Lichtes stimuliert werden, können sie danach kein spontanes Fluoreszenzlicht mehr abgeben. Spontanes Fluoreszenzlicht und Licht von der Stimulierten Emission können z. B. durch Farbfilter voneinander getrennt werden.

• zur Oberflächendarstellung

• Proben werden mit Gold, Platin oder Graphit bedampft

• Beschleunigung der Elektronen mit 8-30 kV

• im Hochvakuum (Probe muss das aushalten)

• Elektronenstrahl wird in einem bestimmten Muster über das Objekt geführt

• 
  

  

• Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

• Elektronenstrahl wird durch Magneten auf das zuvor fixierte und kontrastierte Objekt fokussiert.

• Strukturen erscheinen dunkler, wenn sie die Elektronen absorbieren.

• Wenn die Elektronen durch das Objekt treten, werden sie auf einem fluoreszierenden Schirm detektiert.

1. Probenvorbereitung:

a) Fixierung der Proteine (Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid) (alternativ Cyrofixiering, -135°C)

b) Dehydratisierung (Ethanolreihen)

c) Einbettung: Acrylharze

d) Schneiden (Dünnschnitte z.B. 50 nm)

e) Kontrastieren: Uranylacetat, Bleicitrat

1. Die Elektronen durchstrahlen das Objekt

2. Beschleunigung der Elektronen (80-120 kV bei biol. Proben)

3. Durch die Probe durchtretenden Elektronen werden auf Schirm detektiert