Infektionsbiologie

Bakterien:

• Initiator tRNA: Formylmethionin

• Keine Sensitivität des Ribosoms für Diphtherietoxin

• Keine Transkriptionsfaktoren

Archaeen:

• Methanogenese

• Keine Photosynthese auf Chlorophyll Basis

• Wachstum über 100˚C

Lipopolysaccharid = Hitzebeständige Oberflächen-Struktur von gram-negativen Bakterien

Besteht aus:

3. Variabler Teil: O-Antigene: Polysaccharide

2. Konstanter Teil: Core Region (inneres und äußeres): Besteht aus KDO (Ketodesoxyoctonic acid), Heptose und Zucker

1. Lipid A: 2 Glucosamine verknüpft mit Fettsäureester -> Verankerung mit der äußeren Membran, Endotoxin (pathogener Teil)

1. Immunreaktion bzw. Entzündungen im Wirtsorganismus auslösen

Durch die Lyse der Bakterien wird LPS freigesetzt. Lipid A wirkt als Endotoxin -> Eindringen in den Blutkreislauf -> Komplexbildung von Serumprotein LPB und Lipid A -> Komplex bindet an Rezeptoren von Immunzellen (CD14 von Makrophagen)-> Ausschüttung von Zytokinen (IL-1, TNFα) -> Fieber und septischer Schock

2. Antiphagozytose LPS kann die Phagozytose hemmen, sodass gram-negative Bakterien länger im Wirtsorganismus überleben

-> 45°C und 80°C ——- über 80 °C: hyperthermophil

1. Denaturierung von Proteinen/Enzyme

   -> keine Proteinstbilität -> Verlust der dreidimensionalen Struktur -> Funktion beeinträchtig

2. Keine Membran- bzw. Lipid-stabilität -> keine Lipid monolayer

3. Keine DNA-Stabilität wie Archaea

4. Wachstumsrate und Stoffwechsel:

   Bei höheren T können enzymatische Reaktionen zu schnell ablaufen -> gestörter Stoffwechsel und unkontrollierte Zellteilung

• Proteinstabilität:

- Spezielle Faltung

- Viele Chaperone zur Rückfaltung denaturierter Proteine

• DNA-Stabilität und effiziente DNA-Reparaturmechanismen:

- Histone helfen, die DNA zu verpacken

- DNA-bindende Proteine erhöhen den Schmelzpunkt um 40°C

- Reverse DNA Gyrase führt positive Supercoils ein

• Lipidstabilität:

- Kovalente Bindung von Lipiden (Tetraether) führt zur Bildung einer Lipidmonoschicht -> wesentlich stabiler als Doppelschichten

• Thermostabile Enzyme: z.B. Taq-Polymerase

- behalten ihre strukturelle Integrität und Funktion

= sind normalerweise kommensale Bakterien, die unter besonderen Bedingungen (Immuninsuffizienz des Wirts, verstärkte Virulenz, lokale Faktoren) pathogen werden können

• Staphylococcus aureus -> kommt regulär auf Häuten und Schleimhäuten gesunder Menschen vor, kann bei Defekten des Immunsystems zu Infektionen und Erkrankungen führen

• E. coli -> gehört zur normalen Darmflora und verursacht dort keine Infektion. Erst wenn es diesen Besiedelungsort verlässt und bspw. in eine Wunde gelangt -> Infektion

• Streptococcus pneumoniae -> normalerweise harmlos in der Nasen- und Rachenregion. Kann bei Immuninsuffizienz oder verstärkte Virulenzfaktoren: Kapselbildung) -> Atemwegsinfektionen: Lungenentzündung

• Neisseria meningitidis -> existiert normalerweise harmlos in der Nasen-Rachen-Flora, kann aber Meningitis verursachen, wenn es in die Blutbahn gelangt

1. ETEC (Enterotoxische E. coli): Hitzestabiles Enterotoxin (ST) übertragen durch Transposons und Hitzelabiles Enterotoxin (LT) übertragen durch Plasmide

2. EPEC (Enteropathogene E. coli): Pathogenitätsfaktoren Intimin und Tir (Translocated Intimin Receptor) werden durch Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) in die Wirtszelle injiziert

-> Intimin bindet an den Tir-Rezeptor auf der Wirtszellmembran und ermöglicht die Adhäsion der Bakterien an die Darmepithelzellen

3. EHEC (enterohämorrhagische E.coli): Shiga-Toxin von Bakterien wird im Darm freigesetzt

-> LEE (Locus of Enterocyte Effacement) (= Pathogenitätsinsel im Bakteriengenom) ist verantwortlich für die Bildung von Anhaftungspedikeln und die Injektion von Proteinen in die Wirtszellen

• ETEC (Enterotoxische E.coli)

o Hitzestabiles Enterotoxin (ST), Hitzelabiles Enterotoxin (LT)

-> Reisediarrhoe (Cholera-like diarrhea)

• EHEC (enterohämorrhagische E.coli)

o Shigatoxin, LEE (Locus of Enterocyte Effacement)

o Hämolysin und Intimin

-> wässrig-blutige Diarrhoe

• EPEC (enteropathogene E.coli)

o EPEC-adhesions-factor (EAF) heftet an Epithelzellen des Dünndarms an, Intimin und Tir (Translocated Intimin Receptor) werden durch Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) in die Wirtszelle injiziert

-> Diarrhoe im Säuglingsalter

= Krankheit verursachende Bakterien

o unterscheiden sich von apathogenen Bakterien durch ihre Pathogenitätsfaktoren wie Adhäsine, Antiphagozytosefaktoren, Invasionsfaktoren, Endotoxine und Exotoxine

▪ Bordetella pertussis-> Lunge, Keuchhusten

▪ Vibro cholerae -> Darm, Cholera

▪ Neisseria meningitidis -> Nasen-Rachen-Raum, Meningitis

▪ Neisseria gonorrhoeae-> Urogenitaltrakt, Gonorrhoe

= Gesamtheit der Mikroorganismen, die auf der inneren und äußeren Körperoberfläche des Menschen (oder anderer Lebewesen) leben, normalerweise ohne in den Körper einzudringen

• Symbiosen zwischen Mensch und Mikroorganismen

o Schützen Darm vor Pathogenen

o Helfen bei Entwicklung des angeborenen und adaptiven Immunsystems

o Energiequelle

o Vitaminbiosynthese, Gallensalztransformation, Katabolismus von Nahrungsglycanen (z. B. Cellulose und Pektine)

o Barriere für die Kolonisierung mikrobieller Pathogenen

o Metabolismus von Fremdstoffen (Medikamenten)

1. Adipositas - Übergewicht

-> Verschiebung der Darmflora-Komponenten Bacteroideres und Firmicutes

-> Bei Adipösen dominiert Firmicutes (können unverdauliche Kohlenhydrate spalten)

-> Auswirkung auf Energiestoffwechsel -> höhere Energieaufnahme aus Nahrung

2. Colitis (chronische Darmentzündung)

-> Durch eine Ernährung mit vielen gesättigten Fettsäuren wird in der Leber viel Taurocholsäure produziert -> Microbiota im Darm wird verändert

-> Taurocholsäure stimuliert im Darm Wachstum des entzündungsfördernden Bakteriums Bilophila wadsworthia

-> Pathogene können leichter in Muscoschicht des Magens eindringen -> Chronische Darmentzündung

3. Darmkrebs

-> Chronische Darmentzündungen führen zu einer Fehlbesiedlung des Darms durch Fremdkeime und genotoxische Bakterien

-> Dazu gehören E.coli Stämme mit pks-Gen, die DNA Doppelstrangbrüche induzieren

-> DNA Schäden führen zur Krebsentwicklung

· Pseudomembranöse Colitis = Enzündung des Dickdarms

· andauernde Antibiotikatherapie -> physiologische Darmflora wird gestört

· Antibiotikaresistente Stämme (z.B. Clostridium difficile) können sich stark vermehren

· Clostridium difficile sondert Clostridium-difficile-Toxine A und B ab -> löst Enzündungsreaktionen aus

-> Toxin A: Entzündungen & Zellveränderungen im Darmepithel

-> Toxin B: Schädigung der Darmwand

-> Toxine erhöhen die Durchlässigkeit des Darmepithels und führen zur Bildung von Pseudomembranen (einer Ansammlung von abgestorbenen Zellen, Schleim und Fibrin) in der Darmschleimhaut

• Hygienehypothese

-> eine zu saubere Umgebung, insb. in industrialisierten Ländern, kann dazu führen, dass das Immunsystem (IL-10) nicht ausreichend stimuliert wird -> Immunsystem könnte nicht genügend Erfahrung mit verschiedenen Erregern sammeln -> fehlerhafte Immunantwort —> Autoimmunerkrankungen begünstigen

-> Eine verringerte frühe Exposition gegenüber Infektionserregern führt zu einer geschwächten Gegenregulation von Entzündungsreaktionen und zu einem Anstieg der Prävalenz von Allergien -> Autoimmunerkrankungen

• Hypothese des Verschwindens von Mikrobiota

-> in moderner Zeit: Veränderungen/Mangel in der Zusammensetzung und Vielfalt der Mikrobiota im menschlichen Körper, insb. im Darm -> könnte Entstehung von Autoimmunerkrankungen beitragen

-> Mikroorganismen im Darm interagieren mit Immunzellen und beeinflussen die Entwicklung und Funktion des Immunsystems

-> Ein gestörtes Gleichgewicht in der Mikrobiota könnte zu einer fehlerhaften Immunregulation führen, was Autoimmunreaktionen begünstigen könnte

Extrazelluläre Bakterien: Adhäsine (bsp. Pap Pili), Exotoxine, Kapseln (Antiphagozytosefaktoren), Biofilmbildung

• Bordetella pertussis: Pertussis toxin

• Staphylococcus aureus

• enterotoxic E. coli (ETEC): Enterotoxine LT (Heat-labile) und ST (Heat-stable), Adhäsine, Typ-III-Sekretionssysteme, Hämolysine

Intrazelluläre Bakterien: Adhäsine, Invasine, Endotoxine, Faktoren zur Hemmung der Fusion von Phagosom und Lysosom (bsp. Mycobacterium tuberculosis), Eisentransporter, Lipopolysaccharid (LPS)

• Listeria monocytogens

• Mycobacterium tuberculosis

• Legionella pneumophila

1. Lysosom: Coxiella burnetii

2. Endosomen: Spätes Endosom: Salmonella thyphimurium

                          Frühes Endosom: Mycobacteria

3. ER (Vakuole mit ER, Ribosomen und Mitochondrien): Legionella pneumophila

4. Golgi (Vakuole mit Golgi-Lipiden): Chlamydia trachomatis

= Blutvergiftung = eine lebensbedrohliche fehlgesteuerte Immunreaktion des Körpers auf eine Infektion, die zu einem systemischen Entzündungszustand führt.

-> Entzündungsreaktion aktiviert die großen biologischen Kaskadensysteme und spezielle Zellsysteme und löst die Bildung und Freisetzung zellulärer Mediatoren aus

-> führt zu schweren Gewebeschäden, Organdysfunktion

• entsteht durch das Eindringen von pathogenen Erregern bzw. deren Toxinen in den Blutkreislauf. Körper reagiert auf die Infektion mit Entzündungsreaktion. In der Sepsis ist die Entzündungsantwort außer Kontrolle und wird übermäßig und dysfunktional

Entstehung: Endotoxin bindet Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4)

-> Zytokine werden abgegeben

-> Aktivierung des Komplementsystems, der Inflammations-Mediatoren und der Blutgerinnung

-> Endothel-Schaden (durch zu viel NO (Stickoxid), ROS (Reaktive Sauerstoffspezies), proteolytische Enzyme) führt letztendlich zu multiplen Organversagen, Kapillaren verstopfen durch Gerinnungsfaktoren (DIC), Nekrosen entstehen

-> Nekrotisches Gewebe begünstigt eine Infektion, da es nicht mehr durchblutet ist und Bakterien dort ungehindert wachsen können, da sie dort durch das Immunsystem nicht erkannt werden können

Mediatoren:

- Zytokine: Interferone INFα, g; Interleukine z.B. IL-1, IL-6, IL-12; TNFα; Chemokine

- Lipidmediatoren: Thromboxan, Prostaglandine, Leukotriene und Plättchen-agglutinierender Faktor (PAF)

- Endotoxine

- TLR4

- Komplementfaktoren

- Gerinnungsfaktoren

= Immun-stimulierender, hitzebeständige Oberflächen-Struktur der äußeren Zellmembran von (gramnegativen) Bakterien oder Cyanobakterien

Aufbau: chemisch überwiegend aus Lipopolysacchariden (LPS), die aus einem hydrophilen Polysaccharid- und einem lipophilen Lipidanteil aufgebaut sind.

- Variabler Teil: O-Antigene: Polysaccharide

- Konstanter Teil: Core Region (innereres und äußereres): Besteht aus KDO (Ketodesoxyoctonic acid), Heptose und Zucker

- Lipid A: 2 Glucosamine verknüpft mit Fettsäureester -> Verankerung mit der äußeren Membran, Endotoxin (Pathogenerteil)

Wirkung:

- bei Kontakt mit Schleimhäuten und bei Übertritt ins Blut kann es beim Menschen Fieber erzeugen, da sie die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen stimulieren, die die Körpertemperatur erhöhen

- Aktivierung von Signalwegen von immunkompetenten Zellen (TLR-4) bzw. Immunreaktion, die entweder zu einer Entzündung oder zu einem programmierten Zelltod (Apoptose) dieser Zellen führen können

- es könnte zum septischen Schock führen

1. Rezeptorbindung und rezeptorvermittelte Endozytose:

- z.B.: Anthratoxin aus Bacillus anthracis

-> Toxin gelangt durch Endocytose über das frühe Endosom ins Cytosol

2. Poren-bildende Toxine

- z.B.: α-Toxin aus Staphylococcus aureus

- lösliches Monomer mit gefalteter „stem“-Domäne bindet an Anthrax-Rezeptor auf der Zelloberfläche und bildet ein Porenkomplex

- Insertion des Prepore-Komplexes in die Lipiddoppelschicht der Membran -> gelangt ins Cytosol

3. Injektion in Zellen

• CagA aus Helicobacter pylori

- Wird über ein Typ IV- Sekretionssystem direkt in die Wirtszelle injiziert -> lokalisiert an der Zellmembran

• Shigatoxin aus Shigella dysenteriae

- induziert Endozytose und wird in Endosom eingeschlossen -> über ein Typ III- Sekretionssystem direkt ins Zytoplasma der Wirtszelle injiziert

Botulinum neurotoxin (BoNT) aus Clostridium botulinum

Tetanus neurotoxin (TeNT) aus Clostridium tetani

- Erkennung und Bindung an zelluläre Rezeptoren - Ganglioside in Lipid-Mikrodomänen -> Internalization

- Translokation der L-Ketten = Zink-Metallproteasen -> Spaltung der SNARE-Protein-Mitglieder

-> TeNT und BoNT/B, D, F, G greifen Synaptobrevin oder Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) an

-> BoNT/A und E spalten SNAP-25 und BoNT/C1 schneidet sowohl SNAP-25 als auch Syntaxin 1

-> SNARE-Komplex ist für synaptische Exozytose

—> Botulinum blockiert die Freisetzung von Achetylcholin, das für die Übertragung von Nervenimpulsen an die Muskeln veranwortlich ist —> Muskelkontraktion wird verhindert

—> Tetanus bindet an die inhibitorischen Interneurone und verhindert die Freisetzung von Glycin und GABA, die für die Hemmung der Nervenzellen-Aktivität veranwortlich ist --> Erschlaffung der Muskeln

• Choleratoxin von Vibrio Cholerae (Enterotoxin) -> Aktivierung der Adenylatcyklase und Erhöhung des zell. cAMP-Levels

-> hemmt die GTPase-Aktivität der Gsα-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins, indem es diese ADP-ribosyliert -> intrinsische GTPase-Aktivität blockiert -> permanente Aktivierung der Adenylatcyclase -> Überschuss des Second Messengers cAMP -> permanente Aktivierung von PKA führt zur Cl- Ausstrom durch CFTR -> Massiver Wasser-Ausstrom

• Shiga-Toxin von Shigella dysenteriae (Zytotoxin) -> Inhibition der Proteinbiosynthese

- Funktionsweise: N-Glykosidase, Struktur: A‐B5 Toxin, Rezeptor: Glycolipid Gb3

- spaltet die N‐glycosidische Bindung von Adenin an der Position 4324 am 5´‐Ende der 28S rRNA der 60S Untereinheit von eukaryotischen Ribosomen -> die Elongationsfaktor-abhängige Bindung der Aminoacyl-tRNA an die 60S ribosomale UE ist blockiert -> Proteinsynthese gestoppt

• Botulinumtoxin von Clostridium botulinum (Neurotoxin) -> Blockierung der Sekretion von Neurotransmittern

- besteht aus H- und L-Kette

- hemmt die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin -> H-Kette bindet an Ganglioside

- auf der präsynaptischen Nervenzellmembran -> induziert Aufnahme des Toxins in die Zelle über Endozytose -> SNARE-Protein-Mitglieder werden gespalten durch L-Kette -> Exozytose von Neurotransmittern, d.h. die Ausschüttung in den synaptischen Spalt gehemmt

Choleratoxin Wirkung: Choleratoxin bindet an GM1 -> Aufnahme in frühe Endosomen und retrograder Transport zum ER -> Toxin dissoziiert -> Inhibierung einer GTPase eines stimulierenden G-Proteins (ADP-Ribosylierung) führt zur permanenten Aktivierung der Wirts-Adenylatzyklase -> Erhöhung des cAMP-Spiegels -> permanente Aktivierung von PKA führt zur Cl- Ausstrom durch CFTR Chlorid-Kanal ins Lumen -> Massiver Wasserverlust, um Osmotische Balance aufrecht zu erhalten

-> starke Durchfällen mit Wasserverlusten, ebenfalls zu massivem Ausstrom von Kalium- und Hydrogencarbonat-Ionen über den Darm

Pertussistoxin Wirkung: Pertussistoxin katalysiert die ADP-Ribosylierung der Giα-Untereinheit und blockiert somit den GDP‐GTP-Austausch durch den Austauschfaktor (GEF) -> Giα(-GDP) bleibt inaktiv -> Wirts-Adenylatzyklase konstitutiv aktiv -> Erhöhung des cAMP-Spiegels

-> Ausscheidung von Wasser und Schleim durch Epithelzellen des Atmungstraktes (Keuchhusten)

-> hoher cAMP-Spiegels führt zu einer erhöhten Insulinausschüttung, die zu Hypoglykämie führt und beeinflusst die angeborene Immunantwort, indem es die Rekrutierung von Neutrophilen und Makrophagen inhibiert

Gemeinsamkeiten:

- 5 B-UEs, die einen Ring um eine A-UE bilden (A-B5 Toxin)

- Aktivität des Toxins: ADP-Ribosyltransferase

- Ziel im Wirt: G-Proteine

-> unterschiedliche Ziele, aber denselben physiologischen Effekt:

- Beide sind A-B5-Toxine, Ribosyltransferasen und katalysieren beide die ADP-Ribosylierung der Gα-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins

- Pertussistoxin katalysiert die ADP-Ribosylierung eines inhibitorischen G-Proteins, das darauf hin im GDP-gebundenen, inaktiven Zustand verbleibt -> Adenylatzyclase dauerhaft aktiviert

- Choleratoxin katalysiert die ADP-Ribosylierung eines stimulatorischen G-Proteins, das dadurch im aktiven, GTP-gebundenen Zustand verbleibt -> Adenylatzyclase dauerhaft aktiviert

—> Beide Toxine rufen eine dauerhafte Aktivierung der Adenylatcyclase und dadurch eine erhöhte cAMP-Konzentration in der Zelle hervor

• Anthrax-Toxin (Letalitätsfaktor): wirkt als Metallprotease und katalysiert Hydrolyse von Peptidbindungen bei den N-Terminus der mitogenaktivierten Proteinkinase der Wirtszelle (MAPKK, MAP2K, MEK) -> zelltoxische Effekte

• Botulinum-Toxin (Neurotoxine A-G): wirkt als Zink-Metallprotease, kann verschiedene Proteine des Vesikelfusions-Apparates spalten und damit die Exozytose der Vesikel zu verhindern

-> Ziel im Wirt: SNARE-Protein-Mitglieder: Membranprotein Synaptobrevin (VAMP2), SNAP-25 Syntaxine

-> synaptische Vesikel können nicht mehr mit der Membran fusionieren und ihren Transmitter Acetylcholin nicht mehr in den synaptischen Spalt ausschütten -> Muskelkontraktion wird verhindert

• Tetanustoxin: wirkt als Metallprotease, verhindert durch proteolytische Spaltung des synaptischen CORE-Komplex-Proteins Synaptobrevin (VAMP) die Freisetzung inhibitorischer Neurotransmitter (Glycin und GABA) in inhibitorischen Interneuronen -> Ausfall der synaptischen Hemmung -> Erschlaffung der Muskeln

• Konjugation = horizontaler DNA-Transfer von einer Donorzelle zu einer Empfängerzelle der Bakterien. Bakterien, die ein F-Plasmid tragen, sind Donorzellen (F+-Zellen) und können Sexpili (F-Pili) zu einem Rezeptor-Bakterium (F(-)-Zellen) ausbilden

• Welche Bakterien: Konjugation-Ablauf bevorzugt zw. gram-negativen Bakterien einer Spezies

-> Konjugation zw. anderen Spezies ist auch möglich. Bspw. kann ein nicht-pathogener Keim seine Antibiotika-Resistenz an einen pathogenen Keim weitergeben

-> Bei gram-positiven Bakterien läuft die Konjugation nicht über den Sexpilus ab. Die potentiellen Empfänger scheiden Pheromone aus, die den Donor dazu anregen, ein Aggregationsprotein zu bilden, durch welches sich die Partner aneinander anheften können

Mechanismus: F+-Donorzelle, die ein F-Plasmid enthält, ist dazu fähig, den Sexpilus zu synthetisieren

1. Kontakt: Sexpilus kontaktiert die Empfänger F(-)-Zelle

2. Aktivierung der DNA zum Transfer: Plasmid wird zum Transfer aktiviert, wenn eine Endonuklease einen Strang der DNA am Origin of Transfer schneidet -> Der Relaxase-Dimer bindet den oriT und induziert den Einzelstrangbruch

3. Plasmid transfer: Sex-Pilus zieht sich zurück und zieht die Donor- und die Empfängerzelle zusammen. Das F-Plasmid wird als einzelsträngiges DNA-Molekül übertragen

-> Ein Relaxasemonomer ist kovalent ans 5‘-Ende des geschnittenen DNA-Stranges gebunden. Das andere Monomer agiert als Helikase

-> Am freien 3‘-OH-Ende des konjugativen Plasmids startet die „Rollig circle“ Replikation. Die Relaxase agiert als Pilot-Protein und leitet den DNA-Einzelstrang durch Interaktion mit dem Copuling Protein zur Mating-Pore. Das „Coupling“ Protein pumpt die DNA in die Mating-Pore

4. Synthese eines funktionellen Plasmids: Der komplementäre Strang beider F-Plasmidstränge wird in der Donor und der Empfängerzelle synthetisiert. Danach sind beide Zellen F+ und können den Sex-Pilus synthetisieren

• Rolle des Pilus: Damit Konjugation stattfinden kann, muss ein Bakterium ein F+-Plasmid besitzen, dieses befähigt das Bakterium, einen Sex-Pilus auszubilden

-> Durch Sex-Pilus wird der Kontakt zw. den Zellen hergestellt -> Pilus zieht sich zurück und bringt Empfänger und Donorzelle in die richtige Nähe

Natürliche Transformationskompetenz: Fähigkeit von bestimmten Bakterein, in der Umgebung frei vorhandene DNA durch Rekombination aufzunehmen und in das eigene Genom zu integrieren.

• Die DNA-Aufnahmen kann sequenzspezifisch (H. influenza, N. gonorrhoeae) oder -unspezifisch sein (B. subtilis)

• Die aufgenommene DNA wird durch homologe Rekombination stabilisiert

+Bacillus subtilis

+Streptococcus pneumoniae

+Haemophilus influenzae 

+Neisseria gonorrhoeae

+Helicobacter pylori

Biologische Bedeutung:

1.Durch die Aufnahme von fremder DNA können Bakterien neue Gene erwerben, die ihnen evolutionäre Vorteile verschaffen können -> Erhöhung des genetischen Vielfalts innerhalb der Bakterienpopulation und Anpassung an Umweltbedingungen

2.ermöglicht unter Stressbedingungen die Reparatur geschädigter Genomabschnitte durch möglichst homologe DNA

3.ermöglicht Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien verschiedener Arten oder Stämme. Dadurch können Resistenzgene gegen Antibiotika oder andere schädliche Substanzen übertragen werden, was zur Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen und zur Anpassung an neue Umweltbedingungen beiträgt

4.Die Transformation kann auch zur Übertragung von Virulenzfaktoren führen, die die Pathogenität von Bakterien erhöhen können

Chemische Transformation: Behandlung von Bakterienzellen mit Chemikalien wie CaCl2 oder Polyethylenglykol, um die Zellmembran vorübergehend zu destabilisieren. Dadurch können DNA-Moleküle in die Zellen eindringen —> Zellen werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um die transformierten Zellen zu selektieren

Elektroporation: Bakterienzellen werden in einer elektrischen Spannung ausgesetzt, die kurzzeitig die Zellmembran durchlässig macht. Dadurch können freie DNA-Moleküle in die Zellen eindringen. Danach folgt die Kultivierung der Zellen

Thermische Schockmethode: Bakterienzellen werden kurzzeitig in einer Temperaturänderung ausgesetzt, z. B. einem schnellen Wechsel zwischen heißen und kalten Temperaturen -> dadurch wird die Zellmembran vorübergehend durchlässiger und die DNA kann in die Zellen eindringen

= Übertragung von Bakterien-DNA mit Hilfe von virulenten Bakteriophagen oder anderen Viren als Vehikel

Unspezifische (allgemeine) Transduktion

- ein Bakteriophagen infiziert das Bakterium

- Der Phage injiziert seine DNA ins Bakterium -> DNA des Bakteriums abgebaut —> Rekombination

- Phagenverpackung: Wenn der Phage neue Phagenpartikel zusammenbaut, können Teile der bakteriellen DNA eingefangen und in die neuen Phagenkapseln verpackt werden, anstatt der viralen DNA

- Phagen weden freigesetzt. Die neu entstandenen Phagenpartikel enthalten Fragmente der bakteriellen DNA anstelle der viralen DNA. Wenn diese Phagen andere Bakterien infizieren, können sie die eingeschleuste bakterielle DNA in das Genom des neuen Wirtsbakteriums einführen

Spezifische (spezielle) Transduktion

- Bakteriophagen infiziert ein Bakterium und injiziert seine DNA, welche in das bakterielle Genom integriert werden kann

- Die Phagen-DNA kann in das Bakteriengenom integriert bleiben und sich dort replizieren, ohne dass es zur Lyse des Wirts kommt -> lysogener Zyklus - lysogene Phage

- integrierte Phagen-DNA integriert mit dem Hauptchromosom des Wirtes. Es bildet sich eine Prophage = ringförmig vorliegende Phagen-DNA

- Wirtszelle repliziert sich und damit auch den Prophagen

- der Prophage kann aus dem Bakteriengenom freigesetzt werden, was zur Lyse des Wirts führt und neue Phagenpartikel freisetzt

- Während der Lyse können Teile des bakteriellen Genoms anstelle des Phagen-Genoms in die neu gebildeten Phagenpartikel verpackt werden

- neu gebildete Phagen können andere Bakterien infizieren und das eingefangene bakterielle Genom in das Genom des neuen Wirts einführen

• Methyl-directed Mismatch Repair (MMR)

—> MutS erkennt die Fehlpaarung, lagert sich als Dimer an diese Stelle an

—> MutS rekrutiert MutL → MutSL-Komplex bewegt sich ATP-abhängig entlang der DNA und bildet Schleife um die Fehlpaarung herum

—> Erkennung hemimethylierter Stelle. An dieser Stelle bindet MutH-Endonuklease an MutSL und die Endonukleaseaktivität wird durch MutS/MutL stimuliert —> DNA auf der 5´-Seite der Tochterstrang-GATC-Sequenz wird gespalten

—> Helikase UvrD und eine weitere Exonuklease lagern sich dort an, binden an MutSL und entfernen den eingeschnittenen Tochterstrang → Lücke

—> Lücke wird durch DNA-Pol und DNA-Ligase aufgefüllt

• Nucleotide Excision Repair (NER): UvrABC-Endonukleasen erkennen und spalten beschädigte DNA-Stränge mit 2 Schnitte (Abstand: 12 nt) auf beiden Seiten des beschädigten Stranges

—> UvrD-Helikase entfernt ausgeschnittene 12nt-DNA-Fragment —> DNA Pol I füllt die Lücke auf, DNA-Ligase verknüpft die Phosphodiester-Brücke

• Rekombinante Reparatur: defekte Stelle wird zuerst erkannt und durch Endonuklease entfernt

→ „Nicking“ des intakten Template-Strangs

→ RecA erleichtert die Hybridisierung des intakten Template-Strangs mit der Gap-Region —> Austausch von Schwesterständen (Crossing over)

→ Es entstehen Crossover-Zwischenprodukte, DNA-Replikation durch Pol I

→ Auflösung des Crossover-Zwischenprodukts durch Endonuklease-Aktivität —> schneidet am Kreuzungspunkt die beiden gegenüberliegenden Stränge —> Auffüllen der Lücke

• Base Excision Repair (BER): spezifische DNA-Glykosylase erkennt eine modifizierte Base und schneidet deren N-Glykosidbindung

→ Diese Stelle = Reaktionsprodukt = Apurin- oder Apyrimidin-Stelle (""AP-Site"") wird generiert

→ Reparatur der AP-Sites: AP-Endonuklease führt einen Einzelstrangbruch 5‘ zur „AP-Site“ ein

→ Die korrekte Base wird durch DNA Pol I und DNA-Ligase eingefügt → Lücke verschlossen

Photo-Reaktivierung —> lichtinduzierte Spaltung von Thymin-Dimeren

—> bestimmte Basenmodifikationen können direkt wieder rückgängig gemacht werden

—> mit Hilfe des sichtbaren Lichts (340-500 nm) und der DNA-Photolyase können Pyrimidin-Dimere in der DNA durch Spaltung des Cyclobutan-Rings wieder beseitigen

—> DNA-Photolyasen enthalten FADH2 und Folsäure als Cofaktoren, die sichtbares Licht absorbieren -> FADH2 liefert die Elektronen für die Spaltung des Cyclobutan-Ringes

SOS -> Schäden während der Replikation am Einzelstrang

—> An dei Stelle bindet RecA und fördert die Spaltung von 3 Proteinen: Lambda-cI-Repressor, LexA-Repressor, UmuD-Protein

—> Der LexA-Repressor blockiert über 20 Gene, die nach seiner Spaltung im Zuge der SOS-Antwort transkribiert werden. Zu diesen SOS-Genen gehören das sfiA-Gen, dessen Produkt die Zellteilung hemmt und so Zeit für die Reparaturen schafft, die Gene für die Komponenten der NER, das polB-Gen für die DNA-Polymerase II und das dinB-Gen für die DNA-Polymerase IV

—> Das UmuD-Protein wird als Vorläufer vom RecA-Protein in das funktionelle Protein UmuD’ überführt, von dem zwei Moleküle zusammen mit einem Molekül UmuC die aktive DNA-Polymerase V bilden.

—> Jede der drei SOS-induzierten DNA-Polymerasen kann sich (an für sie spezifischen Schäden) anstelle der replikativen DNA-Polymerase III setzen und im Gegensatz zu dieser die Replikation über die Schadstelle hin fortsetzen, bis diese nach einer gewissen Strecke die Arbeit wieder aufnehmen kann

= angeborene bakterielle Abwehr von fremder DNA

—> Bestehen aus einer Methyltransferase und einer Restriktionsendonuklease

—> Verhindern den DNA-Transfer durch Spaltung von nicht-modifizierter DNA

—> Benötigen Mg2+ und S-adenosylmethionin (SAM) als Methylgruppendonor

• TYP I

—> Hetero-oligomere Enzyme, benötigen ATP-Hydrolyse für die Spaltung

—> Duale, asymmetrische Erkennungssequenz N3-4-S6-8-N4-5

—> Schneiden DNA in weiter Entfernung von der Erkennungssequenz (1000 bp)

—> Typ I RM Enzym bindet an entfernt lokalisierte Erkennungssequenzen

—> ATP-abhängige DNA-Translokation: Bildung von DNA-Schleifen

—> Translokationsaktivität ist Teil von HsdR

—> Kollisoin von zwei RM Enzymemkomplexen aktiviert die Endonukleaseaktivität

• TYP II

—> Endonuklease und Methylase sind separate Enzyme

—> Symmetrische (palindromische) Erkennungssequenz (4-8 bp)

—> Schneiden innerhalb der Erkennungssequenz und nur unmethylierte DNA

• TYP III

—> Hetero-oligomere Enzyme, benötigen ATP-Hydrolyse für die Spaltung

—> Asymmetrische Erkennungssequenz (4-7 bp)

—> Schneiden DNA nahe der Erkennungssequenz (Entfernung 25-27 bp)

Bedeutung

• Immunabwehr: Abwehr von Infektionen durch Bakteriophagen

• Regulation der Genexpression: bestimmte Gene aktiviert oder inaktiviert -> Auswirkungen auf verschiedene Aspekte des Bakterienstoffwechsels und der Anpassung an Umweltbedingungen

• Genetische Diversität: horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien begrenzen -> Bakterienpopulationen aufrechtzuerhalten

Aufgabe: Schutz vor Bakteriophagen und konjugativen Plasmiden —> adaptive Immunantwort gegenüber fremder DNA

Funktionsweise

1. Adaptionsphase der CRISPR Immunität

—> eindringende Phagen- oder Plasmid-DNA wird erkannt, fragmentiert und integriert

—> Neue Spacer, die von der eindringenden DNA abgeleitet sind, werden und in CRISPR Loci eingebaut

2. Interferenz oder Abwehr Phase der CRISPR Immunität

—> Repeats und Spacer werden in eine lange Vorläufer-crRNA transkribiert

—> Vorläufer wird durch einen Komplex (CRISPR-associated complex for antiviral defence —> Cascade) prozessiert

—> Prozessierung tritt nahe des 3’ Endes der Repeat-Sequenz auf, hinterlässt eine kurze (ca. 8 nt) Repeat Sequenz 5‘ der crRNA Spacer —> Jede crRNA enthält eine Wiederholung und einen Spacer, der spezifisch für eine bestimmte fremde DNA-Sequenz ist

—> crRNAs haben einen heterogenen 3′-Terminus, der die palindromische Sequenz des Downstream-Repeats enthalten kann —> stem-loop Struktur

—> diese RNAs und dienen als Führer (guide) binden an den Effektorkomplex, der vermutlich aus Cas-Proteinen besteht und fremde DNA erkennt und Infektionen blockiert

CRISPR-System bei Bakterien:

• Aufgaben: adaptives Immunsystem zur Abwehr von Viren und Plasmiden

• Effektormechanismus: crRNA zielt auf fremde DNA

—> fremde DNA wird fragmentiert und integriert und und in CRISPR Loci eingebaut

—> Transkription und Prozessierung von crRNA (CRISPR RNA)

—> crRNA bindet an das Cas-Protein (crRNA-guide surveillance complex) und führt es zu komplementären Sequenzen in der fremden DNA

—> Cas-Protein schneidet die fremde DNA und verhindert die Infektion

RNA-Interferenz bei Eukaryoten: siRNA und miRNA zielen auf fremde RNA

• Aufgaben: Regulierung der Genexpression durch gezielte Zerstörung von mRNA oder Blockierung der Translation und Schutz vor Viren und Transposons durch Verhinderung der Vermehrung viraler RNA

• Effektormechanismus:

—> kleine RNA-Moleküle wie siRNA (small interfering RNA) und miRNA (microRNA) werden durch Dicer (siRNA) oder Drosha (miRNA) in kurze Fragmente geschnitten

—> RISC-Komplex (RNA induced silencing complex) trennt den RNA-Doppelstrang

—> RNA-Einzelstrang am RISC-Komplex fungiert als Leitstrang, bindet an die fremde komplementäre mRNA und führt zur Destabilisierung und Abbau der Ziel-mRNA oder zur Blockierung der Translation

Gemeinsamkeit: RNA-Synthese und RNA-guided-Inteferenz

1. Pilus Untereinheit im Cytoplasma synthetisiert und dringt ins Periplasma mit Hilfe der Sec-Maschinerie (SecYEG) ein.

2. In Abwesenheit der Chaperone kommt es zu einer Fehlfaltung und Aggregation der Untereinheiten -> sie werden degradiert

3. Ist das PapD Chaperon vorhanden, bindet es an naszierende Untereinheiten und ermöglicht ihre Faltung.

4. Die Untereinheit wird stabilisiert und seine interaktive Furche wird durch den G1 Strang des Chaperons abgedeckt (= Donor-Strang Komplementierung). Die Chaperon-Untereinheit Komplexe binden an PapC Usher an der äußeren Membran. Am schnellsten und am festesten binden der PapD‑PapG Chaperon-Adhesin Komplex an Usher.

5. Dadurch wird der Pilus Assembly initiiert und sichergestellt, dass das Adhesin an der Spitze des Pilus sitzt. Anfügung von weiteren Untereinheiten findet wahrscheinlich durch Donor-Strang-Austausch statt. Dabei ersetzt die N-terminale Erweiterung einer Untereinheit den Chaperon G1 Strang und besetzt so enbenfalls die Furche der Untereinheit.

6. Der Pilus bewegt sich wahrscheinlich linear durch die Usher-Pore und nimmt seine endgültige quartäre Struktur außerhalb der Zelle ein.

Pap-Pili

-> Untereinheiten im Cytoplasma synthetisiert

-> Chaperon für Faltung und Transport im Periplasma benötigt

-> Assemblierung beginnt im Periplasma an PapC Usher und wird außerhalb der Zelle durch Ausbildung der Quartärstruktur vollendet

-> Keine Prozessierung

Curli

-> Alle Proteine, die in den beiden csg Operons codiet sind haben Signalsequenzen für die Translokation ins Periplasma durch Sec-Transport

-> Die zwei strukturellen Untereinheiten CsgA und CsgB der Curli werden durch CsgG (Membranprotein in der äußeren Membran) sekretiert

-> CsgA wird außerhalb der Zelle durch CsgB zu einer Faser assembliert

-> Außerdem werden CsgE und CsgF für eine effiziente Curli Assemblierung benötigt. Sie interagieren mit CsgG

-> Untereinheiten im Cytoplasma sythetisiert

-> CsgE, CsgF und CsgG werden für Lokalisation von CsgA und CsgB benötigt

-> Assemblierung erst außerhalb der Zelle

-> Keine Prozessierung

Typ IV Pili

->Prä-Pilin Leader (PilA) Sequenzen werden durch PilD geschnitten

-> Das prozessierte PilA wird auf Basis von kleinen Pilins (PilE, V, W, X und FimU) und den cytoplasmatischen Membranproteinen PilC und dem NTP-bindenen Protein PilB assembliert

-> Pilus wird durch Pore in die äußeren Membran geschoben, die aus multimere PilQ besteht

-> Pilus kann auch wieder zurückgezogen werden (durch PilT, unterstützt durch PilU). Durch koodiniertes Assemblieren und Zurückziehen („Twichting Motility) können sich Bakterien auf soliden Oberflächen bewegen

-> Untereinheiten im Cytoplasma synthetisiert

-> Prozessierung von PilA durch PilD

-> Kein Chaperon für Faltung und Transport im Periplasma benötigt

-> Assemblierung im Periplasma

-> Pilus kann durch Pore in der äußeren Membran aus der Zelle rausgeschoben und wieder eingezogen werden

▪ Pilus Untereinheiten haben ein Signalpeptid am N-Terminus, das ihren Transport vom Cytoplasma zu der Bakterienzellwand durch das Typ II Sekretionssystem födert. Signalprotein wird dann entfernt

▪ Untereinheiten werden an der bakteriellen Membran durch ihr „cell wall sorting signal“ am C-terminalen Ende verankert

▪ Spaltung im LPXTG Motiv durch Sortase -> Thioester Enzym Intermediat (Sortase-Untereinheit Acyl Intermediat)

▪ SpaC ist die erste Untereinheit, die in den Pilus eingebaut wird

▪ Konservierte Lysin Reste am N-Terminus des SpaA attackieren das Sortase-SpaC Acyl Intermediat

▪ Das Filament assembliert sich durch eine Abfolge von ähnlichen Transpeptidasereaktionen

▪ Der reife Pilus ist an die Zellwandhülle angeheftet

Zipper Mechanismus -> Interaktion von Invasinen (Oberflächenexponierte Strukturen der Bakterien) mit zellulären Rezeptoren der Wirtszelle

• Bindung induziert Eintrittssignale

• Gebundene Bakterien und Rezeptoren werden von der Wirtszelle aufgenommen

o Kontakt und Adhärenz: Strukturen auf der Bakterienoberfläche (meist Proteine) binden an Transmembranrezeptoren der Wirtszelle. Unabhängig vom Aktinzytoskelett. Nur bakterieller Ligand und Wirts-Rezeptor benötigt -> führt zu Rezeptor clustering

o Eine phagozytotische Tasche wird geformt. Ausgelöst wird dies durch transiente Signale, die nach der Formung der ersten Ligand-Rezeptor Komplexe ausgelöst werden. Signale induzieren Aktinpolymerisation und Membran Erweiterung.

o Schließung der phagozytotischen Tasche und Actin Depolymerisation

-> Yersinia, Listeria

Trigger Mechanismus

• Bakterium injiziert einen Cocktail von Modulatoren in die Wirtszelle

• Die Membran kräuselt sich um das Bakterium

• Aufnahme des Bakteriums durch Membranausstülpung

• Viel schneller als Zipper Mechanismus

-> Salmonella, Shigella

= Proteine, die von Bakterien produziert werden und die Fähigkeit besitzen, sich selbst durch die bakterielle Zellmembran zu transportieren

Transportwege

▪ Autotransporter wird im Cytoplasma synthetisiert und besitzt eine spezielle Struktur aus 3 Domänen: Signalpeptid-, Passagier- und β-Barrel-Domäne

▪ Signalpeptid führt das Protein zum Sekretionsapparat der bakteriellen Zellmembran

▪ Passagier-Domäne wird durch β-Barrel-Domäne in die äußere Membran transportiert, während das Signalpeptid entfernt wird

Rolle bei der Pathogenität

▪ Adhäsion von Bakterien an Wirtszellen: Passagier-Domäne enthält Bindungsstellen, um an spezifische Rezeptoren auf den Wirtszellen zu binden —> Kolonisierung

▪ Transport von Toxinen oder Enzymen

▪ Biofilmbildung

▪ Typ III Sekretionssystem ist unabhängig vom Sec Transport

-> T3SS hat eine charakteristische Nadelstruktur, die homologe Bestandteile zum Flagellensystem von Bakterien aufweist. Durch die Nadel bzw. den Nadel Komplex (NC), können die bakteriellen Proteine, die sekretiert werden müssen, direkt vom bakteriellen Cytoplasma durch die Nadel in das Wirtszytoplasma gelangen

-> Drei Membrane separieren die beiden Zytoplasmas: Innere und äußere Membran des Bakteriums und die eukaryotische Membran

-> Der Nadelkomplex stellt einen Durchgang durch diese Membranen bereit

-> Der Teil, der in der Bakterienmembran verankert ist nennt sich Basis. Der extrazelluläre Teil ist die Nadel. Ein „innerer Stab“ (inner rod) verbindet Nadel mit Basis

-> Die Nadel besteht aus vielen Einheiten desselben Proteins

-> Die Basis besteht aus mehreren Ringen

-> T3SS brauchen spezifische Chaperone und sind im Cytoplasma lokalisiert

-> Als Energielieferant für das T3SS dient die an der inneren Membran lokalisierte ATPase

▪ Funktionen

o Yersinia spp.: Inhibierung der Aufnahme durch Phagozyten (Substratproteine: Yop)

o Shigella flexneri: Invasion und Apoptose (Substratproteine: Ipa)

o Salmonella spp.: Invasion, Apoptose, Zytokin-Induktion (Effektorproteine: Sip, Sop, Spt), Proliferation in Wirtsorganen (Substratproteine Sse), Überleben in Makrophagen (Substratproteine: STE)

▪ Invasion (Bartonella henselae)

▪ Aufnahme von DNA (z.B. ComB-T4SS in Helicobacter pylori)

▪ Translokation von Proteinen (z.B. des Effektorproteins CagA in H. pylori)

▪ Weitergabe von Plasmid-DNA (z.B. von Bordetella pertussis: sekretiert das Pertussistoxin)

▪ Induktion Apoptose in der Wirtszelle (Dot/Icm Type IV Sekretionssystem von Legionella pneumophila)

Funktion: Toxine oder andere Effektormoleküle direkt in Zielzellen injizieren —> Abwehr anderer Bakterien

Unterschiede

▪ Injektionsmechanismus: Bei T3SS werden Moduline aus dem Cytosol des Bakteriums in den Wirt injiziert, bei T6SS wird VgrG/PAAR ("warhead") von der Spitze des T6 Pilus in eine konkurrierende Bakterie abgeworfen

▪ Struktur: T3SS sind strukturell den Flagellen ähnlich, T6SS den kontraktilen Phagen

▪ Funktion: T6SS: Interaktion zwischen Bakterien konkurrierenden Bakterien, T3SS: Invasion/Besiedelung der Wirtszelle

Aufbau

1. Basenplatten-Komplex wird gebildet

2. Effektorproteine werden an Komplex rekrutiert und fügen sich in Struktur ein

3.  Hcp Proteine bilden darüber einen stabilen Zylinder und VipA/VipB bilden darum einen Mantel

4. Bei Kontakt mit anderem Bakterium kontrahiert der Mantel und stößt den "warhead" in dieses, wo er abgeworfen wird.

5. ClpV reorganisiert VipA/VipB Mantel und Hcp Zylinder dissoziiert

Funktionsweise

-> T6SS funktioniert wie eine giftige Harpune, die über eine Schleuder (VipA/VipB Mantel), einen Speer (Hcp zylinder = Schaft, VgrG/PAAR = Spitze) und Effektoren, die auf ein konkurrierendes Bakterium wie Gift wirken

-> Bei Kontakt mit einem solchen Bakterium bzw. wenn dieses angreift wird das T6SS aktiviert

—> Clathrin wird für die Endozytose benötigt. Es interagiert einerseits mit Aktin und formt andererseits ein Netzwerk über der Membran

-> Normalerweise wird es bei der Endozytose von Vesikeln gebraucht, aber enteropathogene E. Coli (EPEC) und Listeria monocytogenes nutzen es um in die Zelle zu gelangen (Zipper Mechanismus)

Listeria monocytogenes: Sekretion von Lysteriolysin O (LLO).

-> LLO bildet Poren im Phagosom und verhindert Fusion mit Lysosom

-> Die Poren ermöglichen Listerien das Entkommen ins Cytosol. Werden sie duch Autophagie wieder eingeschlossen, blockiert LLO jedoch die Bildung von Autolysosomen, was zu Listerien enthaltenden Phagosomen (SLAP) führt

-> Hier überleben und replizieren Listerien in Makrophagen

Salmonella typhimurium:

-> Saure Umgebung im Makrophagen-Phagosom führt zu Expression eines T3SS (SPI 2 „Salmonella pathogenicity island 2“), das Effektorproteine durch die Vakuolenmembran ins Cytoplasma von Makrophagen sekretiert

-> Die Fusion von Phagosom und Lysosom wird verhindert, auch der Vesikeltransport im Makrophagen

-> PhoP/PhoQ-Zweikomponentensystem wird benötigt um Genexpression an Umgebung anzupassen (LPS-Modifikation, Mg-Transport)

-> Autophagosomen bilden sich um zelluläre Organellen, die recycelt werden sollen, aber auch um frei im Cytosol befindliche Bakterien. Durch rekrutieren von Lysosomen werden Autophagolysosomen gebildet, in denen die Bakterien abgetötet werden

-> Manche Bakterien, wie Listerien oder Staphylococcus aureus  können dem Autophagosom entkommen oder es so verändern, dass sie darin replizieren können

-> Einige internalisierte Bakterien (z. B. Brucella abortus) rekrutieren möglicherweise einen Teil der Autophagiemaschinerie und schaffen eine replikative Nische innerhalb einer autophagosomenähnlichen Vakuole. Diese Bakterien untergraben die Autophagiemaschinerie, um den Abbau in einem lysosomalen Kompartiment zu verhindern und die Bakterienreplikation zu unterstützen

-> Bakterien benötigen für Stoffwechsel und Vermehrung eine Eisenkonzentration von ca. 10‐7 M.

-> Im Wirt ist die Verfügbarkeit von Eisen stark herabgesetzt (10‐18 M), da es im Komplex mit Proteinen vorliegt (Ferritin, Lactoferrin, Transferrin)

=> Eisen als Stimulus reguliert die Virulenz über die Genexpression:

➔ Eisen reguliert die Virulenz von Bakterien z.B.: Iron-regulated gene A = irgA von Vibrio Cholerae

Vibrio cholerae: iron regulated gene A (irgA)

➔ verstärkte Expression von Proteinsystemen, die zu einer vermehrten Eisenaufnahme führen = Virulenzfaktoren (zu denen Eisenaufnahmeproteine zählen) z.B. Fur (ferric uptake regulator) in E.Coli: Derepression von Aufnahmegenen bei wenig Eisen

​ E. coli: Ferric-uptake Protein (Fur) ->α-Haemolysin

➔ ​Eisenmangel wird bei Bakterien als Signal für das Auslösen einer Infektion gewertet. Einige ​Toxine werden sogar nur bei Eisenmangel verstärkt exprimiert und bei ausreichender Eisenversorgung der Pathogene steigt dann die Virulenz

➔ Der Wirt limitiert die Eisenverfügbarkeit spezifisch als Teil der angeborenen Immunantwort gegen Mikroorganismen

a) Gram negative Bakterien können mithilfe von Siderophoren (Catechol, Hydroxamat & Carboxylat) Eisen aus den Eisenspeicherproteinen wegnehmen

b) Neisserien können Transferrin mit Hilfe von TBP1/TBP2 (transferrin-binding protein) rekrutieren und Eisen gewinnen.

-> FbpA transportiert das Eisen zwischen äußerer und innerer Membran und apo-Transferrin wird vom „Ton Complex“ aktiv entlassen

=> Ausnutzung des Eisentransportsystems des Wirts!

=> pH, Sauerstoff, Nährstoffe, Eisen, Temperatur, Osmolarität

▪ RNA-Thermometer bei Listerien

-> prfA mRNA-Sequenz wird durch erhöhte Temperatur (im Wirt) für Ribosomenbindung freigegeben -> „aufschmelzen“ eines Stem-loop -> dadurch wird die prfA-Virulenzgen-Expression stimuliert

-> bei niedriger T. kann das Ribosom nicht an dem Stem loop der prfA mRNA-Sequenz binden -> keine Transkription

▪ Osmolaritätsabhängige Kontrolle der Proteinexpression der Außenmembran

-> EnvZ ist eine membranständige Sensorkinase, die von Monovalenten Kationen (v.a. K+) aktiviert wird

-> OmpR ist ein Reaktionsregulator, der die Transkription der Porine OmpF und OmpC steuert

-> Je höher die Osmolarität, desto aktiver ist die Kinase und phosphoryliert OmpR (response regulator)

-> Bei niedriger Osmolarität wird nur wenig OmpR phosphoryliert, daher werden nur die Bindestellen mit hoher Affinität gebunden -> ompF-Promotor ist aktiv und ompC nicht => Transkriptionsaktivierung von ompF

-> Bei hoher Osmolarität liegt viel aktives OmpR vor und auch die wenig affinen Bindestellen werden gebunden. So wird ompF deaktiviert (durch miRNA, die ebenfalls Promotor für ompR hat) und ompC aktiviert => Transkriptionsaktivierung von ompC

-> BvgS/BvgA (Bordetella), EnvZ/OmpR (E. coli), PhoP/PhoQ (Salmonella typh.)

PhoP/PhoQ-System in Salmonellen

-> PhoQ (Sensorkinase) ist ein membranständiger Rezeptor, der in Abwesenheit von Mg2+ PhoP (response regulator) phosphoryliert (z.B. im Phagosom von Makrophagen)

-> aktiviertes PhoP reguliert die Transkription von Genen, die das Überleben in Makrophagen ermöglichen (Pags) und Mg2+-Transport antreiben

-> Außerdem wird die Expression des T3SS unterdrückt

▪ RNA-Thermometer bei Listerien

-> prfA mRNA-Sequenz wird durch erhöhte Temperatur (im Wirt) für Ribosomenbindung freigegeben -> „aufschmelzen“ eines Stem-loop -> dadurch wird die prfA-Virulenzgen-Expression stimuliert

-> bei niedriger T. kann das Ribosom nicht an dem Stem loop der prfA mRNA-Sequenz binden -> keine Transkription

▪ Protein-Thermometer bei Yersinien

-> Bei 25 °C binden zwei Homodimere des Transkriptionsregulatorproteins RovA an die DNA und rekrutieren die Transkriptionsmaschinerie an das inv-Gen

-> Bei 37 °C wird inv nicht mehr transkribiert, da die Konformation der RovA Dimere so verändert ist, dass sie nicht mehr an die DNA binden können

▪ Osmolaritätsabhängige Kontrolle der Proteinexpression der Außenmembran

-> EnvZ ist eine membranständige Sensorkinase, die von Monovalenten Kationen (v.a. K+) aktiviert wird

-> OmpR ist ein Reaktionsregulator, der die Transkription der Porine OmpF und OmpC steuert

-> Je höher die Osmolarität, desto aktiver ist die Kinase und phosphoryliert OmpR (response regulator)

-> Bei niedriger Osmolarität wird nur wenig OmpR phosphoryliert, daher werden nur die Bindestellen mit hoher Affinität gebunden -> ompF-Promotor ist aktiv und ompC nicht => Transkriptionsaktivierung von ompF

-> Bei hoher Osmolarität liegt viel aktives OmpR vor und auch die wenig affinen Bindestellen werden gebunden. So wird ompF deaktiviert (durch miRNA, die ebenfalls Promotor für ompR hat) und ompC aktiviert => Transkriptionsaktivierung von ompC

▪ Die Bakterienzelle reagiert durch die aktive Abgabe (bei hypoosmotischem Stress) oder Aufnahme (bei hyperosmotischem Stress) von osmotischen Substanzen durch Kanäle, die aktiviert werden, da somit der Wasserfluss ausgeglichen werden kann.

-> Aufnahme von Ionen oder „compatible solutes“ wie Prolin oder Trehalose durch mechanosensitive Kanäle in der Zellmembran führt zum Ausgleich des Osmotischen Drucks

-> Manche „compatible solutes“ wie Glycin-Betain können von vielen Bakterien, aber auch Pflanzen produziert werden

Genregulation: Kontrolle der Expression eines Gens

-Bestimmt die Konzentration eines Genproduktes zu bestimmtem Zeitpunkt in der Zelle

-Genregulation ist die Antwort auf Stimuli, durch die bestimmte Gene an- oder abgeschaltet werden

-homologe Population reagiert gleich auf Stimuli -> homologe Population mit einheitlicher Genexpression

-Anpassung an das Leben in einer bestimmten Nische bzw. an eine wechselnde Umgebung anpassen zu können (z.B. wechselndes Nährstoffangebot)

Genetische Variation: Auftreten von genetischen Varianten (Allele, Gene oder Genotypen) bei individuellen Lebewesen

-> In einer Population liegen immer in Folge von Mutationen verschiedene Varianten vor. Einzelne Individuen einer Population haben bei einer Änderung von Bedingungen einen Vorteil und werden selektiert

-> wichtig, um seltene Nischen oder um schnell neue Nischen besiedeln zu können

Die genetische Regulation erfolgt gerichtet, sodass die Expression von Proteinen an die Umweltbedingungen (z.B. Temperatur, Eisen-Angebot) angepasst werden kann. Genetische Variation hingegen erfolgt zufällig. Erst durch Selektion kann ein durch Mutation erlangter Vorteil in einer Population etabliert werden.

Vorteile:

-Regulation: Reaktion auf ein Umweltsignal in der Nische ist möglich

-Variation:

*Besiedlung verschiedener Nischen durch günstiges Selektionsgen möglich

*Veränderung kann zu besserer Anpassung an neue Nische führen

Beispiel: Veränderte Membranstrukturen um dem Immunsystem eines Wirts zu entkommen

Nachteile:

-Regulation: Evtl. kann kein Individuum der Population überleben, da die ganze Population mit der gleichen evtl. falschen Antwort auf ein Umweltsignal reagiert

- Variation: Nicht alle Individuen einer Population können in neuer Nische überleben

- Anpassung an eine neue Umgebung hängt stark vom Zufall ab

• DNA-Rekombination: Promotor-Inversion: Der vsa-Locus von Mycoplasma pulmonis

• DNA-Rekombination: Gen-Konversion: pilS-Locus in den pilE-Locus von Neisseria gonorrhoeae

• Slipped strand mispairing: Opa-Proteine aus Neisseria

• Homologe Rekombination: Borrelia hermsii, vmp-Gene

• DNA-Rekombination: Promotor-Inversion: FimA der Typ I Pili von UPEC

• DNA-Rekombination: Gen-Konversion: pilS-Locus in den pilE-Locus von Neisseria gonorrhoeae

• Slipped strand mispairing: Opa-Proteine aus Neisseria

• Epigenetische Regulation: regulatorische Region des E.coli Pap-Pilus

Ein- und Ausschalten

Neisserien besitzen bis zu 12 Kopien des Opa-Gens. Durch Slipped strand mispairing können kurze DNA-Repeatsequenzen in den Opa-Genen von der DNA-Polymerase bei der Replikation überlesen werden

-> ungepaarte Regionen entstehen, die Schleifen bilden und dann von Reparaturmechanismen ausgeschnitten werden

-> führt zu verkürztem Gen, bei dem die „coding-region“ im ORF liegt (On-state) oder die DNA-Polymerase rutscht bei der Replikation zurück und baut die repeats doppelt ein -> Verlängerung des Gens -> = Antigen Variation

-> Liest die Polymerase das ganze Gen ab ohne etwas zu überspringen, so liegt die codierende Region außerhalb des ORF (Off-State)

= Phasenvariation (ON, OFF)

Einfache (TypII) Transposons:

- Inverted Repeats liegen an beiden Enden

- zentral: Transposasegen und ein Repressor- bzw. Resolvasegen sowie Resistenzgene (z.B. β-Lactamase)

- Zusätzlich IRS (internal resolution site) zwischen Transposase und Repressor

Komplexe (TypI) Transposons:

- an den Enden liegt jeweils eine vollständige Kopie weitgehend identischer IS-Elemente (Insertions-Elemente) mit

1) gleicher Orientierung oder

2) entgegengesetzter Orientierung und flankiert von inverted repeats -> enthalten notwendige genetische Information für Transposition

-> zentraler Bereich: mehrere Resistenzgene gegen Antibiotika oder Schwermetalle

Reorganisation von Genomen:

1. Cut and Paste-mechanismus (nicht replikativ)

-> Transposase schneidet Transposon nahe der IR-Elemente aus und erzeugt dabei Doppelstrangbrüche

-> Transposase fügt Transposon in die verschobene Zielstelle der Empfänger-DNA ein und die entstanden Lücken (durch Transposase-Schnitt) werden durch DNA Reparaturmechanismen aufgefüllt

2. Replikative Transposition

-Repeats und Target motif werden von Transposase geschnitten und die 5‘-Enden der Empfänger-DNA werden mit 3‘-Enden der Donor-DNA verknüpft

-An freien 3‘-OH-Enden beginnt die Synthese des fehlenden Stranges und Resolvase löst die fertigen Strukturen

-Transposon, welches an Zielstelle eingebaut wird, wird also während der Transposition kopiert und bleibt auf Donor-DNA erhalten

3. Konjugative Transposition

-Transposon-DNA wird ausgeschnitten und zirkularisiert (dsDNA-Ring)

-dsDNA wird konjugativ transferiert, wobei die „Rolling-circle“-Replikation verwendet wird

-Die für den Transfer notwendigen Proteine können erst nach der Ringbildung exprimiert werden

-Sowohl in der Donor- als auch in der Empfängerzelle wird der komplementäre DNA-Strang des zirkulären Intermediates nachsynthetisiert und die kreisförmige dsDNA reintegriert in das Genom

Insertions-(IS)-Elemente: Kleine transponierbare DNA-Elemente 600-1500bp

Transposons: Einfache und komplexere Elemente, die neben dem Transposasegen noch andere Gene wie z.B. Antibiotika-Resistenzgene tragen

-> Transponierbare Elemente tragen zur Umorganisation im Genomen durch Genduplikation, Insertionen, Deletionen und Inversionen bei

-> Diese Umorganisationen im Genom können zu neuen Mutationen führen

-> Beispielsweise ist es möglich, dass durch Insertionen der Leserahmen eines Gens verändert wird. Auch horizontaler Gentransfer ist durch mobile genetische Elemente möglich (konjugative Transposition)

—> Einige Bakteriophagen tragen wichtige Virulenz-Faktoren für pathogene Bakterien

3 Infektionskrankheiten: Cholera, Diphtherie, Scharlach (scarlet fever)

= sämtliche Gene, die für Resistenzen gegen potentiell schädigende Einflüsse der Umwelt schützen. 4 Gruppen von Resistenzgenen:

1. Selbsterhaltungs-Gene von Antibiotika Produzenten -> Zellwandmodifikationen

2. kryptisch eingefügte Resistenz-Gene -> Ausfluss-Pumpen (Schutz intrazellulärer Ziele)

3. Vorläufer-Gene -> können zu Resistenz-Gene evolvieren

4. pathogene Resistenz-Maschinerie -> effektive Antibiotika-Resistenz

-Horizontaler Gentransfer: Konjugation, Transformation und Transduktion

-Plasmide: enthalten Gene, die Antibiotikaresistenzen verleihen und können zwischen Bakterien übertragen werden

-Integrons: genetische Elemente, die Gene in ihre Struktur aufnehmen und übertragen können

-Mutationen

Aufgaben im ursprünglichen Host: Teilen integrierter regulatorischer und metabolischer Netzwerke

Aufgaben nach Verbreitung: Resistenz!

Wirkmechanismus:

- Peptide heften sich an die mikrobielle Membran an und aggregieren

- Die Aggregate fügen sich in die Membran-Doppelschicht ein und bilden Poren

- Hydrophobe Region aligniert dabei mit der Lipid-Core-Region, der Hydrophile Teil bildet das Innere der Pore. Die Peptide können so in die Zelle/Bakterium eindringen und ihre Wirkung entfalten (bauen sich ihren Eingang in die Zelle also sozusagen selbst)

Beispiele:

- Inhibition der Zellwandsynthese (Mersacidin)

- Aktivierung von Autolysin (N-acetylmuramcyl-L-alanine amidase)

- Bindung an DNA (Buforin II, Tachyplesin)

- Inhibierung der DNA, RNA und Protein-Synthese (Pleurocidin, dermaseptin, PR-39…)

- Inhibierung der Enzymaktivität (Histatin, drosocin…)

- Veränderung der Cytoplasmamembran (PR-39, PR-26, indolicidin…)

Pro und Contra als mikrobielle Therapeutika:

Pro:

-> keine bekannten Resistenze

-> primär physikalische Wirkungsweise

-> in den Zellen „verborgen“ oder nur kurz extrazellulär vorhanden

-> Konzentration und Zeitraum sind nicht ausreichend eine Resistenz zu induzieren

-> indirektes Abtöten von Bakterien durch hohe Affinitäten zu wichtigen Elementen wie Zink oder Eisen

-> vielversprechende Methode zum Beschichten von Implantatoberflächen

Contra:

->ständige non-lethale Exposition führt zu Resistenz -> wichtig für z.B. Kosmetik, Implantate, anfällig für Proteolyse, Salz- Serum- und pH-Wert-Sensitiv

Voraussetzungen:

-Identifizierung geeigneter Phagen: um Zielbakterien effektiv abzutöten -> Auswahl geeigneter Phagen mit hoher Wirksamkeit

-Phagenisolierung und -reinigung

-Klinische Studien: Sicherheit und Wirksamkeit

Vorteile:

-Spezifität: Phagen sind hochspezifisch für ihre Zielbakterien und können andere nützliche Bakterien im Körper des Patienten schonen, im Gegensatz zu Breitbandantibiotika, die oft auch nützliche Bakterien angreifen.

-Hohe Wirksamkeit: Phagen können potenziell jeden multiresistenten Erreger bekämpfen und können eine zielgerichtete Eliminierung bestimmter Bakterienstämme ermöglichen, ohne die Begleitflora zu stören

-Potenziell breite Anwendbarkeit, Ergänzung zu Antibiotika: Da Phagen aufgrund ihrer Spezifität nur bestimmte Bakterien angreifen, können sie möglicherweise auch gegen multiresistente Bakterienstämme wirksam sein

Nachteile:

-Resistenzentwicklung von Bakterien im Laufe der Zeit gegenüber verwendeten Phagen

-Komplexität der Therapie: Die Identifizierung geeigneter Phagen, die Isolierung und Reinigung sowie die Anpassung der Therapie an individuelle Patienten können zeitaufwändig und kostspielig sein

-Unzureichende Forschung: es gibt noch begrenzte Forschung und klinische Erfahrung mit der Phagentherapie im Vergleich zu traditionellen Antibiotika

Aufbau:

-> 2 identische leichte und 2 identische schwere Ketten mit „Scharnier“-Region, sie sind verbunden über Disulfidbrücken

-> 2 Antigenbindestellen.

-> Leichte und schwere Ketten haben jeweils eine konstante (cL bzw. cH) und variable Region (vL bzw. vH für Antigen Bindestelle)

-> Konstante Region: Leichte Kette: 2 Formen: κ λ

                                    Schwere Kette: 5 Formen: α γ δ ε μ

Kodierung:

- Kodierungsloci für schwere und leichte Ketten auf verschiedenen Chromosomen

- Variable Regionen der Ketten in mehreren Gensegmenten kodiert. V = Variabel, D = Diversity (nur schwere Kette), J = Joining, C = Konstant

- Viele verschiedene Kopien aller Segmente. Bei der Lymphozytenentwicklung wird zufällig eine der Kopien ausgewählt (somatische Rekombination) und in die Sequenz eingebaut (Genumlagerung -> große Diversität)

- Dabei wichtige Enzyme: Rag1/2

- Leichte Kette: Zufälliges V Segment verbindet mit zufälligem J Segment (-> VJ Segment). Dazwischen liegende DNA wird herausgeschnitten. Nach Transkription wird gespleißt und ein C-Segment an das VJ Segment gebunden -> Translation

- Schwere Kette: Bindung eines zufälligen D an J-Segments. Dann Bindung an zufälliges V-Segment -> der Rest wie bei leichter Kette (Transkription, Spleißen…)

= Zellen des adaptiven Immunsystems

Bildung:

B-Zelle: Differenzierung aus hämatopoetischen Stammzellen (über Vorläuferzellen) im Knochenmark. B Lymphozyten verlassen das Knochenmark noch „unreif“ (immature) und reifen vollständig in den sekundären lymphatischen Organen.

T-Zelle: Differenzierung aus hämatopoetischen Stammzellen im Thymus

Cytotoxischer T-Lymphozyt (CTL, CD8+ Rezeptor):

- Immunantwort gegen intrazelluläre Erreger, erkennen über MHCI präsentierte Antigen

- Bei Aktivierung: Tötung der AG-präsentierenden Zelle über Fas Ligand, cytotoxische Granula oder durch Induktion von Apoptose über Granzym B und Perforin

TH1 T-Zelle (CD4+ Rezeptor):

- Immunantwort gegen extrazelluläre Erreger

- Erkennung von AG auf MHCII

- Induzieren Eliminierung von Pathogenen in Phagozyten, Aktivierung von Makrophagen und CTL

- sekretieren Interferon Gamma und erhöhen damit die Expression von MHCII

- Aktivieren von B-Zell-Klassenwechsel zu IgG

TH2 T-Zelle (CD4+ Rezeptor):

- aktiv bei Wurminfektionen

- Erkennung von AG auf MHCII

- sekretieren IL-4, IL-5, IL-13

- Aktivierung von Granulozyten, Mastzellen, B-Zellen -> Differenzierung zu Plasma- und Gedächtniszellen, Klassenwechsel der Antikörper

- alternative Makrophagenaktivierung, Reparatur von Gewebeschäden und antiinflammatorische Wirkung

Th17 T-Zelle (CD4+ Rezeptor):

- bei Pilzinfektionen

- Erkennung von AG auf MHCII

- sekretieren IL-17

- aktivieren Neutrophile

Regulatorische T-Zelle Treg (CD4+ Rezeptor):

- Deaktivierung oder Tötung von autoreaktiven T-Zellen

- erkennt körpereigene Partikel, die über MHC präsentiert werden -> Wichtig für die Unterscheidung zwischen Körpereigen und Körperfremd

Gedächtnis T-Zellen:

- Wichtig für CTL und Helferzellen bei Sekundärinfektion -> schnellere und stärkere Immunreaktion

Entstehung im Thymus aus allgemeinen lymphoiden Vorläufer-Zellen -> Pro-T-Zelle -> Prä-T-Zelle

-> Diese T-Zell-Vorläufer besitzen sowohl CD4 als auch CD8 CoRezeptoren (-> „doppelt positiv“). Durch zufällige Auswahl eines Rezeptors und positive Selektion bzw. Signale reifen sie zu CD4+ oder CD8+ Zellen heran

-> Zellen, die zu stark auf körpereigene Antigene im Thymus reagieren, werden eliminiert.

-> Die reife (naive) CD8+ Zelle kann dann von einer APC (Antigen-presenting-cell, meist dendritische Zelle) aktiviert werden und zu einer CTL differenzieren. Diese verlässt den Thymus und wird nun von jeder infizierten Zelle, die das entsprechende Antigen auf MHCI präsentiert aktiviert und veranlasst die Apoptose. Die Apoptose wird dabei über die Freisetzung von Granula induziert. Diese enthalten:

- Granzyme -> aktivieren Caspase-Kaskade

- Perforine -> erlauben Eintritt der Granzyme in die Zelle

Zudem findet eine Interaktion von Fas über den Fas-Ligand statt, was ebenfalls Caspasen aktiviert.

Aufgaben

-> CTLs dienen der Abwehr von intrazellulären Erregern (Viren, Bakterien), welche für Antikörper nur schlecht erreichbar sind indem sie das „Reservoir“ der Infektion, also die infizierte Zelle abtöten

-> CTLs können außerdem Tumorzellen eliminieren.

-> Immunzellen erkennen Antigene auf unterschiedliche Art und Weise, während B-Zellen lösliche Antigene im Körper erkennen können, trifft dies auf T-Zellen nicht zu. Diese können lediglich kurze Peptide erkennen, welche auf MHC-Molekülen auf Zelloberflächen präsentiert werden. Fast alle Zellen besitzen dabei MHCI und können somit Antigene für CD8+ T-Zellen („Killerzellen“) präsentieren. Dieses „zur Schau stellen“ von Peptiden, wird als Antigenpräsentation bezeichnet.

-> Makrophagen, Monozyten und B-zellen: spezifische Zellen des Immunsystems, die „professionell“ Antigene präsentieren. Dies verläuft über MHCII Moleküle und dient in erster Linie der Aktivierung naiver T-Zellen

Zelltypen:

Normale Körperzellen:

- z.B. Virus infizierte Zellen

- Proteine im Cytosol über Proteasom degradiert

- Präsentation der „Schnippsel“ über MHCI Komplex

Phagozyten:

- Präsentation von Antigenfragment über MHCII Komplex

B-Zellen:

- Antigen wird nach Oberflächenrezeptorbindung (Antikörper) internalisiert und degradiert

- Präsentation der Fragmente an Zelloberfläche durch MHCII

—> durch Pattern Recognition Receptors: TLRs: Toll-like Receptors und NLRs: NOD-like Receptors

-> sind auf verschiedene Kompartimente lokalisieren

-> aktivieren Phagozyten, die wiederum Lymphozyten aktivieren

-> induzieren immunstimulierende Signalmoleküle

1.Lipopolysaccharide (LPS) = ein wichtiger Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien

-> durch den TLR-4 erkannt, der auf der Zelloberfläche von Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird

-> Bindung von LPS an TLR-4 löst eine Signalkaskade aus -> Entzündungsreaktion -> Immunabwehr gegen die bakterielle Infektion

2.Peptidoglykan = ein strukturelles Polysaccharid, das in der Zellwand von Bakterien vorkommt, einschließlich vieler grampositiver Bakterien

-> durch verschiedene Rezeptoren erkannt -> TLR-1 und NLRs

-> Aktivierung dieser Rezeptoren führt zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren und zur Aktivierung des Immunsystems gegen die bakterielle Infektion

3.dsRNA:

-> durch den TLR-3 erkannt

-> Bindung von dsRNA an diese Rezeptoren

-> Aktivierung von Abwehrmechanismen gegen virale Infektionen: Produktion von antiviralen Interferonen und Induktion von Apoptose infizierter Zellen

= alle sind Teil der Pattern Recognition Receptors (PRRs) und spielen wichtige Rollen bei der Regulation des angeborenen Immunantworts

-> erkennen verschiedene pathogene Assoziierte Molekülmuster (PAMPs) und schädliche Assoziierte Molekülmuster (DAMPs)

Toll-like Rezeptoren (TLRs):

-> erkennen PAMPs wie Lipopolysaccharide, virale dsRNA, Flagellin, etc -> Aktivierung des angeborenen Immunsystems und der Regulation der adaptiven Immunantwort

-> sind auf Oberflächenzellen des Immunsystems (Makrophagen, Lymphozyten) oder in intrazellulären Kompartimenten wie endosomalen Membranen lokalisiert

NOD-like Rezeptoren (NLRs):

-> erkennen eine verschiedene PAMPs, einschließlich Komponenten der Bakterienwand (Peptidoglykan, Flagellin), abgeschiedene Toxine, virale RNA etc

-> Bildung des Inflammasoms -> Aktivierung von Capase 1 —> Produktion pro-imflammatorischer Cytokine (IL-1ß, IL-18) oder Induktion des Zelltods “Pyroptosis”

-> sind im Zytoplasma lokalisiert und haben eine charakteristische Domänenorganisation mit einem zentralen Nucleotid-Bindungsdomänen (NACHT-Domäne), einem N-terminalen Effektor-Domänenbereich und einer C-terminalen Region aus LRR-Wiederholungen für die Ligandenbindung

NOD Rezeptoren = Untergruppe der NLRs

-> erkennen speziell Peptidoglykanmotive von gramnegativen Bakterien

-> NOD1 und NOD2 sind wichtig bei der Erkennung und Aktivierung des NF-κB-/MAPK-Pathways, das eine wichtige Rolle bei der Entzündungsreaktion spielt —> Produktion imflammatorischer Cytokine (IL-2, IL-8,INFa)

-> sind im Zytoplasma lokalisiert

= ein Teil der Pattern Recognition Receptors (PRRs) und hat wichtige Rollen bei der Regulation des angeborenen Immunantworts

-> sind im Zytoplasma lokalisiert und haben eine charakteristische Domänenorganisation mit einem zentralen Nucleotid-Bindungsdomänen (NACHT-Domäne), einem N-terminalen Effektor-Domänenbereich und einer C-terminalen Region aus LRR-Wiederholungen für die Ligandenbindung

-> erkennen eine verschiedene PAMPs, einschließlich Komponenten der Bakterienwand (Peptidoglykan, Flagellin), abgeschiedene Toxine, virale RNA etc

—> Bildung des Inflammasoms

- Inflammasombildende NLRs weisen dieselben allgemeinen Merkmale auf

- Bei der Ligandenerkennung binden NLR das Adapterprotein Asc und Caspase-1

-> Aktivierung von Capase 1 —> Produktion entzündungsfördernder pro-imflammatorischer Cytokine (IL-1ß, IL-18) => Aktivierung von Immunantwort

-> Aktivierung von Capase 1 führt auch zum Zelltod “Pyroptosis”

= Antigene, die zu einer antigen-unabhängigen Aktivierung von T-Zellen führen und somit als Toxine wirken. Sie verbinden den MHCII-Antigen-Komplex einer präsentierenden Zelle mit dem T-Zellrezeptor einer T-Zelle außerhalb der normalen Bindungsstelle. Die Bindung erfolgt dabei unabhängig vom gebundenen Antigen

-> Aktivierung eines Großteils (bis zu 50%) der T-Zellen ohne dass ein spezifisches Peptid zugegen ist -> polyklonale T-Zell Aktivierung

-> sehr starke Cytokin-Sekretion und somit systemische Entzündung

-> Beschädigung des Gewebes, Schock und in ca. 30% der Fälle zum Tod

Beispiele: - YPM aus Yersinia pseudotuberculosis

                  - TSST-1 aus Staphylococcus aureus

Neutrophile gehören zum angeborenen Immunsystem, werden im Knochenmark gebildet und zirkulieren im Blut. Von dort können sie ins Gewebe rekrutiert werden und Bakterien phagozytieren und verdauen. Sie haben zudem Granula-Vesikel im Cytoplasma, welche bakterizide Substanzen enthalten. Diese können sekretiert werden und Bakterien in der Umgebung abtöten.

2 Typen von Granula:

 - Spezifische Granula (enthalten Lysozym, Collagenase, Elastase)

 - azurophile Granula (enthalten neben Enzymen noch mikrobizide wie Defensine oder Cathelicidine)

Sie sind sehr schnell am Infektionsort und vermitteln die früheste Phase entzündlicher Reaktionen. Sie besitzen nur eine kurze Lebenszeit im Kreislauf und Gewebe.

Opa-Proteine von Neisseria: sind integrale Außenmembranproteine von Neisserien

- Ein Stamm kann dabei viele verschiedene Opa-Gene besitzen, welche alle der Phasen- und Antigenvariation unterliegen

- Dadurch kann jedes Opa-Protein unabhängig von einem anderen aus- oder angeschaltet werden

- Durch zusätzliche Verschiebungen des Leserasters bei der Replikation durch strand slippage wird eine extrem hohe Varianz der Oberflächenproteine erzielt

- Gebildete Antikörper sind somit nur gegen einen sehr kleinen Teil der Bakterien wirksam, während der Rest der humoralen Immunantwort entgeht, sich weiter vermehren und die Oberflächenproteine ändern kann

Antiphagozytosefaktoren (Antiopsonisierende Wirkung) von Staphylococcus aureus:

- Immunglobuline werden am Fc-Teil der schweren Kette durch Protein A auf der Oberfläche von Staph. A. gebunden (also verkehrt herum)

- Makrophagen erkennen dies nun nicht mehr als Signal und es findet keine Phagozytose statt

Spaltung von Immunglobulinen durch IgA-Proteasen (Neisseria gonorrhoeae)

- Protease spaltet eine Aminosäurebindung in der Gelenkregion der schweren Kette von Immunglobulin A

- Antikörper werden zerstört.

induzierte Apoptose von Makrophagen durch Blockierung der MAPKK, was durch das Anthraxtoxin von Bacillus anthracis verursacht wird

—> Bewegung über Aktinpolymerisation zu Aktinschweifen mit folglich raketenartigem Antrieb.

-> Bsp. Shigella, Listeria, Rickettsia

Shigellas aktinbasierte Bewegung:

-> IcsA befindet sich auf der Bakterienoberfläche (Nachahmung der Rho-GTPase Cdc42)

-> N-WASP (vom Host) bindet an IcsA und wird dabei „geöffnet“

-> G-Aktin bindet an geöffnetes N-WASP

-> Arp2/3-Komplex (vom Host) bindet an geöffnetes N-WASP und bildet den Komplex Aktin-Nukleations-Initiator

-> Aktinfilamente wachsen, werden durch α-Actinin dicht quervernetzt und treiben Shigella voran

Apoptose = programmierter Zelltod in mehrzelligen Lebewesen. Wird von der Zelle selbst und aktiv ausgeführt und ist somit Teil des Stoffwechsels

Auslöser: 3 Wege der Aktivierung:

1. Extrinsische Weg: extrazelluläre Liganden binden an Rezeptoren der TNF-Rezeptor-Familie und führen zur Aktivierung von Procaspase 8 (Initiator-Caspase)

-> kann zur Signalverstärkung auch die Aktivierung des Intrinsischen Weges einleiten

2. Intrinsische Weg: intrazelluläre Signale (z.B: starke DNA-Schäden) -> Freisetzung von pro-apoptotischen Proteinen (z.B: Cytochrom C) aus den Mitochondrien

-> Ist das Gleichgewicht zu Anti-apoptotischen Molekülen (z.B.: Bcl-2) im Zytosol zu stark gestört, bilden diverse Proteine zusammen mit der Procaspase 9 das Apoptosom -> Aktivierung der Caspase 9 (Initiator-Caspase)

3. Cytotoxische T-Zellen injizieren Granzyme und Perforine in die Zielzelle. Diese wirken verstärkend auf den intrinsischen Weg und führen auch davon unabhängig zur Aktivierung von Initiator-Caspasen

Ablauf:

-> Initiator-Caspasen lösen die Caspasenkaskade aus. Dies beinhaltet zum einen die Aktivierung von Effektor-Caspasen (Caspase 3, 6 und 7), zum anderen aber auch die rückgekoppelte verstärkte Aktivierung von den entsprechenden Initiator-Caspasen

-> Effektor-Caspasen bauen Lamin und Aktin ab, aktivieren auch sekundäre Zielproteine. Dies führt letztendlich zu folgenden Phänomenen: Bläschenbildung, Zellschrumpfen, Chromatin Kondensierung, Fragmentierung der chromosomalen DNA und Phagozytose der kleineren Apoptosekörpern

Ergebnis: gezielter Zelltod einer infizierten Zelle, ohne Schädigung von umliegendem Gewebe

Nekrose: pathologischer Untergang einzelner oder vieler Zellen bis zur Bildung von verschiedengroßen arealen abgestorbenen Gewebes

Auslöser: Toxine, bakterielle Infektion, Nährstoff- und Sauerstoffmangel, Radioaktivität

Ablauf: betroffene Zelle schwillt an, es kommt zu Defekten in der Plasmamembran und der Zellinhalt kann unkontrolliert in die Umgebung austreten

Ergebnis: Im umliegenden Gewebe kommt es zur Entzündungsreaktion und Fresszellen werden angelockt und diese lösen über TNF auch lokal Apoptose aus.

Autophagie: ein intrazellulärer Prozess, bei dem zelleigene Bestandteile (z.B.: fehlgefaltete Proteine oder beschädigte Organellen) abgebaut und recycelt

Auslöser:

- Ubiquitin-Signale (z.B.: auf defekten Zellorganellen, defekten Membranfragmenten, Bakterien innerhalb oder außerhalb beschädigter Vakuolen/Phagosomen)

- Autophagie-Protein Atg5

- Bakterien (z.B. S. aureus) können Autophagie induzieren

Ablauf:

1. Aktivierung der Autophagie

2. Bildung einer isolierenden, halbmondförmigen Membran um den gekennzeichneten, zytosolischen Zielinhalt

3. Bindung von Faktoren wie Atg- und LC3-Proteinen spielen eine wichtige Rolle

4. Wachstum einer Doppelmembran -> komplett umschließendes Autophagosom

5. Kann zur Fusion mit Endosom kommen -> Intermediäres Autophagosom

6. Lysosomale Fusion -> Autolysosom

Ergebnis: komplette Degradation der Zielbestandteile des Autolysosoms in kleinste Komponenten

Apoptose: dient der Verhinderung der Ausbreitung von intrazellulären Bakterien

-> einige intrazelluläre Bakterien haben Mechanismen entwickelt, um die Apoptose zu verhindern oder zu verzögern (z.B.: Chlamydia)

-> Einige Bakterien haben auch Mechanismen entwickelt, die die Apoptose induzieren, um dem Verdau in Makrophagen zu enkommen (z.B.: Yersinia)

Nekrose: kann ebenfalls durch einige Bakterien induziert werden (z.B.: Chlamydia) -> Dadurch können die Bakterien der Zelle entkommen und sich in neuen Wirtszellen verbreiten

Autophagie: 3 Autophagie-Arten:

1. Nicht-bakterielle Autophagie

-> richtet sich gegen bestimmte intrazelluläre Bestandteile, die aber auch durch Bakterieninvasion entstanden sein können (defekte Membranfragmente)

-> Diese können sowohl ubiquitinyliert, als auch nicht-ubiquitinyliert erkannt und autophagozytiert werden

-> Diese Art der Autophagie kann auch „autonomes Signaling“ aktivieren und die bakterielle Replikation beeinflussen

2. Antibakterielle Autophagie -> Xenophagie

-> ermöglicht den Abbau von intrazellulären Bakterien, die aus Vakuolen ausgebrochen sind oder sich in beschädigten Vakuolen befinden

-> Diese Bakterien werden unter anderem an Ubiquitin-Signalen erkannt und der Verdauung im Autolysosom zugeführt

-> erfolgreicher Abwehr der Zelle gegen diverse Bakterien (z.B.: Salmonella)

3. Pro-bakterielle Autophagie

-> einige Bakterien rekrutieren bestimmte Komponenten der Autophagie-Maschinerie, verhindern aber die Fusion mit Lysosomen und bilden auf diese Art eine replikative Nische in Autophagosom-ähnlichen Vakuolen (z.B.: S. aureus)

= programmierter Zelltod, der durch antimikrobielle Immunantwort hervorgerufen wird

-> Bestimmte Zellen der angeborenen Immunantwort (Makrophagen/Neutrophile) erkennen bakterielle Bestandteile (PAMPs: Pathogen associated molecular patterns), wie z. B. LPS, Peptidoglykane oder Flagellin mit TLRs (Toll-like Rezeptoren) oder NLRs (NOD-like Rezeptoren)

-> es kommt zur Signalkaskade, die zu einer Bindung von Asc und Pro-Caspase-1 an die NLRs führt = Inflammasom-Bildung

-> Aktivierung der Pro-Caspase-1 (durch bestimmte DAMPs: Damage associated patterns)

-> Spaltung der Zytokine Pro-IL-1beta und Pro-IL-18, die pro-inflammatorisch wirken (sorgen für Aktivierung von Dendritischen Zellen, die dann T-Zellen aktivieren)

-> Folgen: Ausschüttung Zytokine IL-1beta und IL-18, Poren-Formierung, DNA-Zerstörung, Anschwellen und Platzen der betroffenen Makrophagen/Neutrophilen -> dadurch Freisetzung weiterer DAMPs

-> DNA-Schädigung

-> Induktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen

-> Inhibition von Apoptose

-> Produktion von Wachstumsfaktoren

▪ Fusobacterium nucleatum:

-> Adhesin FadA bindet E-Cadherin auf Zelloberfläche -> inhibiert Tumor-Suppressor-Aktivität und aktiviert beta-Catenin-Signalweg

-> Falls APC mutiert ist -> beta-Catenin ist Transkriptionsfaktor für Onkogene

-> Außerdem Stimulation von inflammatorischen Genen

▪ Bartonella henselae: bindet und invadiert in Endothelzellen -> direkte Stimulation von Proliferation und Inhibition von Apoptose

-> Außerdem: Rekrutierung von Makrophagen und anderen Lymphocyten -> resultiert in Hypoxischen Bedingungen -> HIF-1 wird aktiviert -> VEGF Expression -> Vaskuläre Tumorformierung

▪ Agrobacterium Tumefaciens: Einbau von DNA-Stück (T-DNA) in Pflanzen-Chromosom -> T-DNA stark proliferativ -> Tumor in Pflanze (hierdurch erhöhte Opinsynthese = Nutzen für Bakterium)

H. pylori verursacht anhaltende Infektion des Magens -> chronische Entzündung der gastrischen Mucosa

▪ Sekretiert inflammatorische Zytokine (z.b. CagA):

--> Inhibiert Apoptose (CagA bindet ASPP2 -> interagiert mit p53 -> Degradation -> keine Apoptose durch p53.

—> Produktion von Wachstumsfaktoren

—> Änderung der Zellform und des Migrationsverhaltens

—> Daueraktivierung von Signalwegen Ras-MEK-ERK -> Proliferation

—> Änderung der intrazellulären Transportwege: Actin-Polymerisierung und Zytoskelett-Veränderung (Src-Kinase inaktiviert)

—> DNA-Schäden durch Inflammation (ROS)

—> Verlust der Polarität: CagA bindet ZO-1 und Jam -> Zerstörung des epithelialen Apical-junction-Complexes AJC. Epitheliale und mesenchymale Transition (EMT) -> wichtig für Tumorentstehung

Transkriptom bezieht sich auf die Gesamtheit aller Gene bzw. RNA-Moleküle, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle synthetisiert werden

-> umfasst verschiedene Arten von RNA: mRNA, rRNA, tRNA, ncRNA,..

1. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq):

   ▪ Extraktion der RNA aus Zelle/Gewebe -> Umwandlung in cDNA -> Fragmentierung der cDNA

   ▪ Sequezierung des Ende der cDNA-Fragmente, um die RNA-Sequenzen zu bestimmen -> Map reads: Analyse der erhaltenen Sequenzdaten

   -> Quantifizierung der Menge der verschiedenen RNA-Typen sondern auch, Identifizierung neuer Transkripte, Untersuchung alternativer Spleißvarianten, Vergleich der Expressionsniveaus der Gene

2. Microarray-Technologie: Mikroarrays sind Plattformen, auf denen Tausende von DNA-Sonden immobilisiert sind

   ▪ Bei der Untersuchung des Transkriptoms werden cDNA-/ RNA-Proben mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden hybridisiert, um die mRNA-Moleküle zu detektieren

   -> Die Intensität der fluoreszierenden Signale wird gemessen und gibt Auskunft über die relative Menge der spezifischen RNA-Sonden

   -> Expression von Genen analysieren und Muster von Genaktivitäten zu identifizieren

Microarray: Bei 2 verschiedenen Temperaturen die Gesamt-RNA extrahieren, unterschiedlich fluoreszenzmarkieren und auf Array-Platte geben. Je nach Intensität und Farbe der Spots lässt sich die Veränderung der Genexpression durch die variierte Temperatur feststellen

-> Inducermedium verwenden, das die Expression von Virulenzfaktoren auslöst -> Microarray/RNAseq. -> knockout jedes Gens erstellen und überprüfen, bei welcher Mutation das Bakterium nicht mehr invasiv ist. Prüfung der Invasivität mit konfokaler Mikroskopie, Differential immunofluorescence assay. Quantifizierung z.B. mit Gentamicin protection assay.

-> IVET (in vivo expression technology)

-> STM (signature-tagged mutagenesis) / TIS (mapping of transposon insertion sites)

IVET (in vivo expression technology)

1. In einem Bakterienstamm wird ein für das Überleben essentieller Wachstumsfaktor (=egf) mutiert -> Bakterienstamm kann nicht leben

2. Der intakte egf wird zusammen mit einem Reportergen (zb. GFP) im 2. Schritt ohne Promotor in ein Plasmid kloniert (egf vor Reportergen). Danach wird zufällige Bakterien-DNA an die fehlende Promotorstelle im Plasmid kloniert.

3. Das fertige Plasmid wird in das Chromosom des mutierten Bakteriums aus Schritt 1 integriert

4. Bakterien, bei denen der Promotor in einer bestimmten Nische aktiv ist (bei Infektion: infektiös in Labortier), exprimieren egf und können somit das in Schritt 1 mutierte egf kompensieren: sie überleben. Diese können isoliert und auf die Expression des Reportergens getestet werden.

5. So kann beobachtet werden, ob ein bestimmter Promotor unter bestimmten Umständen aktiv ist (= Bakterium wächst und zeigt Reportergen nur unter bestimmten Umständen, z.b. nur bei Invasion) bzw. wie stark die jeweilige Promotoraktivität unter bestimmten Umständen ist. Konstitutive Promotoren werden aussortiert (erkennbar durch dauerhaftes Leuchten = Promotor ist unabhängig von Infektion immer aktiv)

Beispiel: Bakteriengene, die nur bei Infektionen von Makrophagen aktiviert werden.