Lecture 2

• DNA verlust

• DNA Erweiterung

• DNA Umlagerung

• DNa ist unverändert, wird aber unterschiedlich expremiert

Gene, die in einem bestimmten Zelltyp nicht benötigt werden, werden gelöscht, während die verbleibenden Gene aktiv sind

Gene, die in einem bestimmten Zelltyp benötigt werden, werden selektiv amplifiziert, was zu einer starken Expression des amplifizierten Gens führt

Die in einem bestimmten Zelltyp benötigten Gene unterliegen einer DNA-Umlagerung. Dadurch wird das Gen beispielsweise mit Promotorelementen (P) verknüpft, die für seine Transkription erforderlich sind.

Der richtige Mechanismus, bei dem sich der DNA-Gehalt nicht ändert, sondern die Expression einzelner Gene in verschiedenen Geweben reguliert wird, wobei Gen B, nicht aber Gen A vorhanden ist

• erste blottingtechnik

• Ed Southern 1975

• Aufklärung der Struktur einzelner Gene in verschiedenen Zelltypen

Methode:

▪︎DNA-Verdauung mit einer Restriktionsendonuklease, die bestimmte Sequenzen schneidet

▪︎Elektrophorese auf einem Agarosegel

▪︎DNA im Gel denaturiert und wird auf Nitrozellulosefilter übertragen

▪︎Hybridisierter Filter mit einer radioaktiv markierten Probe für das Gen von Interesse

▪︎Analysierung der Struktur eines bestimmten Gens anhand der Hybridisierungsmuster bei verschiedene Restriktionsendonukleasen

Elektrophorese von dnA, das mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurde, seine Übertragung auf einen Nitrozellulosefilter und die Hybridisierung des Filters mit einer spezifischen DNA Probe für das Gen von Interesse

Dass DNA im allgemeinen in allen Zelltypen gleich ist

Rote Blutkörperchen von Säugetieren

Während der Reifung der roten Blutkörperchen wird ihr Kern entfernt und es bildet sich Retikulozyten (DNA-Verlust)

▪︎ Dem Retikulozyten fehlt jegliche DNA, aber Synthese großer Mengen Globin geht weiter

▪︎ schließlich entsteht ein Erythrozyten, besteht im Grunde nur aus Sauerstoff- Transport von Hämoglobinmolekülen

In Vorläufern roter Blutkörperchen ist das Globin-Gen stark exprimiert und ein gehirnspezifisches Gen würde nicht exprimiert (a). In reifen Blutzellen gehen alle Gene verloren, so dass kein neues rnA produziert wird (b). Im Gehirn würde das hirnspezifische Gen exprimiert, das Globin-Gen jedoch nicht (c).

Pulsmarkierungsassay zur Beurteilung der Transkriptionsrate eines bestimmten Gens (Gen A) durch Messung der Menge an Radioaktivität (Punkte), eingebaut in entstehende Transkripte.

▪︎ Zugabe radioaktiv markierter Nukleotide zu Zellen

▪︎ Zellen nach 5-10 Minuten ernten und RNA isolieren

▪︎ Hybridisierung markierter RNA mit Dot-Blot, der DNA von interessierenden Genen enthält.

Kann nicht für niedrig exprimierte Gene verwendet werden, der Einfluss des RNA-Abbaus schränkt die Anwendbarkeit ein, außerdem: große Mengen an unmarkierten, nicht radioaktiven Ribonukleotiden schränkt die Empfindlichkeit ein, ➡ der größte Teil des Pools an Vorläufer-Ribonukleotiden verbleibt im Zytoplasma

Nuclear run-on assay.

• Nach Isolierung der Kerne stellt die RNA-Polymerase aufgrund des Mangels an Ribonulceotiden die Transkription ein, bleibt jedoch mit der DNA verbunden.

• Wenn radioaktiv markiertes Ribonukleotid hinzugefügt wird, nimmt die Polymerase die Transkription wieder auf und läuft bis zum Ende des Gens, wobei das markierte Ribonukleotid in das RNA-Transkript eingebaut wird.

  -> Die auf diese Weise in verschiedenen Geweben hergestellte markierte RNA kann dann zur Untersuchung von Filtern verwendet werden, die DNA von Genen enthalten, deren Transkription in den verschiedenen Geweben gemessen werden soll.

▪︎ Kerne aus Zellen isolieren

▪︎ radioaktiv markierte Nukleotide hinzufügen

▪︎ RNA aus Kernen nach 1-2 Stunden isolieren

▪︎ Hybridisierung markierter RNA mit Dot-Blot, die DNA aus interessierenden Genen enthält

• DNA ist dicht gepackt (Chromatin)

• mögliche Regulierungsschemata a, b, c

a) Die Transkriptionskontrolle könnte durch Veränderungen der Chromatinstruktur erfolgen, die den Zugang zu konstitutiv aktiven Proteinen ermöglichen, die die Transkription aktivieren (A) (a).

Alternativ könnte das Chromatin jederzeit zugänglich sein, wobei die Transkription durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Aktivatorproteinen kontrolliert wird (A) (b). In vielen Fällen sind diese beiden Mechanismen der Transkriptionsregulation jedoch kombiniert (C).

Die Genkontrolle könnte auf der Ebene der Transkription erfolgen, indem sie reguliert, welche Gene in das primäre RNA-Transkript transkribiert werden

(A)

Alternativ würden bei der posttranskriptionellen Kontrolle alle Gene transkribiert, wobei die Genregulation bestimmt, welche primären RNA-Transkripte zu reifer mRNA verarbeitet werden (b).

Transkriptionsinitiierung an einem RNA-Polymerase-II-Promotor.

• TFIID-Faktor bindet zusammen mit einem anderen Faktor, TFIlA (a), an die TATA-Box.

• Anschließend wird TFIIB durch Interaktion mit TFIID (b) rekrutiert und TFIIB rekrutiert dann RNA-Polymerase II und den damit verbundenen Faktor TFIIF (c).

• TFIIE und TFIIH binden dann und TFIIH phosphoryliert die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase II (d).

• Dadurch wird RNA-Polymerase II in eine Form umgewandelt, die in der Lage ist, die Transkription zu initiieren, und RNA-Polymerase II und TFIIF bewegen sich dann entlang des Gens und produzieren das RNA-Transkript, wobei TFIIA und TFIID am Promotor (e) gebunden bleiben.

Ein an seine Bindungsstelle (ABS) gebundener Aktivator (A) kann entweder den Aufbau des Basalkomplexes (a) oder die Aktivität des bereits zusammengesetzten Komplexes (b) stimulieren.

Verschiedene Aktivatoren (A) und Repressoren (R) interagieren mit dem Mediator, der die verschiedenen Signale integriert und dann ein integriertes Signal an die RNA-Polymerase überträgt und so die Transkriptionsrate festlegt.

Mechanismen, durch die ein Hemmfaktor (R) die Transkription unterdrücken kann. Dabei wird die Bindung eines Aktivators (A) an seine Bindungsstelle (ABS) in der DNA gehemmt, indem eine inaktive Chromatinstruktur erzeugt wird (a), um die DNA-Bindungsstelle konkurriert wird (b) oder der Aktivator in Lösung gebunden wird (c). ; Hemmung der Fähigkeit des gebundenen Aktivators, die Transkription zu stimulieren (d); Abbau des Aktivators (e) oder direkte Repression (f)

• 3/4 des menschlichen Genoms ist transkribiert

• nur 1 % ist Proteincodierend

• Regulatorische RNAs können die Genexpression hemmen, indem sie den mRNA-Abbau induzieren, die mRNA-Translation blockieren oder die Transkription hemmen, indem sie die Reorganisation ihres Zielgens in eine inaktive Chromatinstruktur induzieren.

• micro RNAs (miRNAs

• small interfering RNAs (siRNAs)

• Piwi-interacting RNAs (piRNAs)

• long noncoding RNAs (IncRNAs)

• Länge: 20-25 Basen

• einsträngige RNA

• in allen Zelltypen

• braucht Dicerprotein zur Reifung

• in Pflanzen und Tieren

• Funktion: kontrolliert die zelluläre Genexpression

• über 1000 miRNAs im Menschen entdeckt

Verarbeitung von miRNA-Vorläufern.

• Der pri-miRNA-Vorläufer wird von der RNA-Polymerase II transkribiert und bildet eine Haarnadelschleifenstruktur, die das Drosha-Protein bindet (a).

• Die Spaltung durch Drosha erzeugt eine Prä-miRNA, die den Haarnadel-Loopp enthält, der zum Zytoplasma transportiert wird (b).

• Anschließend bindet die prä-miRNA das Dicer-Protein (c), wodurch die einzelsträngige Schleife abgespalten wird

• Dadurch wird doppelsträngige RNA freigesetzt (d),Ein Strang davon ist abgebaut, der verbleibende Strang bildet die reife miRNA (e).

• Länge: 21-24 Basen

• doppelsträngig RNA

• in allen Zelltypen

• braucht Dicerprotein zur Reifung

• in Pflanzen und Tieren

• Funktion: kontrolliert virale und zelluläre Genexpression

siRNA

▪︎ verarbeitet aus doppelsträngiger RNA (meistens)

▪︎ beschrieben als Abwehrmechanismus gegen eindringende Viren (die im Laufe ihres Lebenszyklus häufig doppelsträngige RNA produzieren)

▪︎ Nach Bindung durch Protein Dicer und Spaltung kann siRNA an virale mRNA binden und diese für den Abbau markieren

In Fällen, in denen ein Transgen in der Nähe eines nachgeschalteten zellulären Promotors (CP) eingefügt wird:

• wird ein Antisense-Transkript produziert.

  Dieses kann das vom Transgen-Promotor (TP) produzierte normale Transkript binden, um eine doppelsträngige RNA zu erzeugen.

• Die doppelsträngige RNA wird von Dicer gespalten, um siRNA zu produzieren, die sowohl an die Transgen-mRNA als auch an die mRNA des entsprechenden endogenen Gens binden kann.

• Dies führt zum Abbau sowohl des Transgens als auch des entsprechenden endogenen Gens

Eine weitere Art der Regulation durch siRNAs wird durch homologe Pseudogene ermöglicht

▪︎ Beispiel: Säugetiergen, das für Histondeacetylase 1 (Hdac1) kodiert

▪︎ Acetylierung/Deacetylierung von Histonen spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Chromatinstruktur und damit der Transkriptionsregulation! Beispiel für ein siRNA-System, das ein Gen reguliert, dessen Protein selbst eine regulatorische Rolle spielt

• Länge: 21-31 Basen

• einsträngig

• primär in Keimzellen und anderen Zelltypen

• bedarf kein Dicerprotein

• nur in Tieren

• Funktion: Hemmt transposone und kontrolliert die zelluläre Genexpression

• ursprünglich in Keimzellen von Drosophila identifiziert

• grundlegend anderer Verarbeitungsweg

Funktion: Förderung der Genomintegrität, Hemmung der Transposonaktivität auf zwei Arten

Um sich innerhalb des Genoms zu bewegen, werden Transposons transkribiert, um eine RNA-Kopie zu erzeugen, die dann in eine neue DNA-Kopie umgewandelt wird, die an anderer Stelle im Genom eingefügt wird (a). Dieser Prozess kann gehemmt werden, indem piRNAs an die Transposon-RNA binden und deren Abbau induzieren (b)

• Bindung von piRNA kann nicht nur den Abbau von Transposon-RNAs induzieren (a),

• sondern auch das Kopieren der Transposon-RNA induzieren, um kleine 22G-RNAs zu produzieren, die zur Transposon-RNA komplementär sind (b).

• Diese 22G-RNAs können die Hemmung der Transposon-Genexpression verstärken, indem sie entweder an weitere Kopien der Transposon-RNA binden und deren Abbau induzieren (c) oder indem sie an die Transposon-DNA im Genom binden und deren Transkription blockieren (d).

Lange regulatorische RNAs können

• aus der regulatorischen Region eines proteinkodierenden Gens trankribiert werden(a)

• aus der transkribierten Region eines proteinkodierenden Gens, wobei die regulatorische RNA normalerweise vom gegenüberliegenden Strang der DNA transkribiert wird (b)

• oder abgeleitet werden von einem der beiden DNA-Stränge einer völlig anderen Region des Genoms (c).

Eine nichtkodierende regulatorische RNA, die aus der regulatorischen Region eines Protein-kodierenden Gens stammt, kann funktionieren, indem sie:

• einen Proteinkomplex (x) rekrutiert, der das Zielgen in einer dicht gepackten Chromatinstruktur organisiert (a),

• oder indem sie um Proteine ​​(y) konkurriert, die normalerweise binden zur Genregulationsregion und stimulieren die Transkription (b).

▪︎ alternatives RNA-Spleißen

▪︎ Regulierung der Polyadenylierung

▪︎ Regulierung des RNA-Transports

▪︎ Regulierung der RNA-Stabilität

▪︎ Regulierung der Übersetzung

reversible posttranslationale Modifikationen:

▪︎Phosphorylierung

▪︎Sequestrierung

irreversibel:

▪︎Proteolyse

▪︎zeigen Unterschiede in der Art und Häufigkeit von RNAs und Proteinen

▪︎zeigen keine Unterschiede im DNA-Gehalt

1. Chromatinstruktur

2. Transkriptionsregulation (Aktivatoren, Repressoren)

3. Posttranskriptionale Regulation (regulatorische RNAs)

▪︎ Hauptziel ist die Transkriptionsebene