Lecture 3

• 46 Chromosomen im Zellkern einer menschlichen Zelle (22 Autosomenpaare und ein einzelnes Geschlechtschromosompaar: weiblich: xx, männlich:

  xy)

• Jeder Elternteil trägt ein Chromosom pro Paar bei (Diploidie)

• Gameten enthalten nur 23 Chromosomen (Haploidie)

Paint probes

▪︎ FISH-Sonden (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung) binden an spezifische DNA, werden mit Fluorochrom markiert und leuchten unter einem Fluoreszenzmikroskop auf

▪︎ Farbsonden für das gesamte Chromosom enthalten einen Cocktail von FISH-Sonden, die auf verschiedene Regionen eines bestimmten Chromosoms abzielen

▪︎ ermöglichen die Identifizierung von Translokationsereignissen

Genomische Hybridisierung (aCGH)

▪︎ Immobilisierte Sequenzen bekannter Position im Genom werden im Mikroarray verteilt

▪︎ genetisches Material aus Test und Referenz wird mit unterschiedlichen Markern markiert

▪︎ Nach der Hybridisierung erkennen ungleichmäßige Intensitäten beider Marker Veränderungen, z. B. Deletionen

SNP-Microarrays

▪︎ SNPs sind meist biallelisch, haben zwei Formen an einer bestimmten Stelle und können daher mit A und B bezeichnet werden

▪︎ Für eine diploide Zelle ergeben sich daraus die Genotypen AA, AB und BB

▪︎ Ein regionaler Mangel an AB deutet auf eine hemizygote Deletion (Verlust einer chromosomalen Kopie) hin.

Die DNA wird in mehreren Schritten in das Chromosom gewickelt und gefaltet, beginnend mit Histone (linearisierte menschliche DNA würde sich über mehrere Meter erstrecken!)

Die meisten Gene sind einzigartige Einzelkopie-Gene (Enzyme, Hormone, Rezeptoren, Struktur- und Regulierungsproteine) (2 % des menschlichen Genoms).

▪︎ Multigenfamilien enthalten Gene gemeinsamer Abstammung (Paralog)

-> zB - und -Globin-Gencluster

▪︎ klassische Genfamilien weisen eine hohe Homologie auf

▪︎ Gen-Superfamilien weisen eine geringere Sequenzhomologie auf, sind aber funktionell verwandt, z. B. ähnliche strukturelle Domänen

1. Transkriptionsregulation

▪︎ Umweltfaktoren (z. B. Hormone) und genetische Faktoren (Zellsignale) können die Genexpression beeinflussen

▪︎ Signalmoleküle binden an Rezeptoren an der Zelloberfläche (führen zur Signalweiterleitung), intrazelluläre Hormon-Kernrezeptoren, regulatorische DNA (Antwortelemente)

▪︎ Transkriptionsfaktoren binden innerhalb der Promotorregion (innerhalb von 200 bp stromaufwärts des Gens) an DNA und ermöglichen so die Bindung der RNA-Polymerase

1. Post-transkriptionale Regulation

wirkt auf:

▪︎ RNA-Verarbeitung

▪︎ RNA-Transport

▪︎ mRNA-Abbau

▪︎ mRNA-Translation

einfach in Prokaryoten, ohne Introns und wenig repetitive DNA. ▪︎ Vier Funktionen sind hilfreich:

1. Offene Leserahmen (ORF), definiert als Region zwischen Startcodon (ATG, Methionin) und Stoppcodon (TAA, TAG, TGA, auch: GTG, TTG)

2. Vorhandensein einer Konsensussequenz für die Ribosomenbindung in unmittelbarer Nähe des Startcodons

3. Vorhandensein eines Musters der Codon-Nutzung, das mit Genen übereinstimmt (Hidden-Markov-Modelle)

4. Homologie des mutmaßlichen Gens zu bekannten Genen ▪︎ prominentes Werkzeug: GLIMMER, unter Verwendung interpolierter Markov-Modelle

kompliziert durch Exon/Intron-Struktur:

▪︎ Exon: Teil eines Gens, der Teil der reifen mRNA wird (nach dem Spleißen)

▪︎ Intron: Teil eines Gens, der beim Spleißen verloren geht (oft beginnend mit GT und endend mit AG)

anfängliches Exon:

• Beginnt mit Methionin

• Weiter bis zur ersten Verbindungsstelle

internes Exon:

• Von der Spleißstelle zur nächsten Spleißstelle strecken

terminales Exon:

• erstreckt sich von der letzten Spleißstelle bis zum Terminationscodon

▪︎ (nichtkodierende Exons: nicht translatierte Regionen am 5'- und 3'-Ende der reifen mRNA)

Algorithmen zur Gensuche

extrinsisch:

▪︎externe Datenquellen abfragen (z. B. Karten von ESTs zu Genom-Loci, Proteinsequenz, verwandte Organismen)

intrinsisch:

▪︎Nur Verwendung von Signalen/Mustern in der genomischen DNA (ab initio)

-> oft in Kombination verwendet

▪︎ Homologiebasierte Methoden nutzen lokale Alignments zu Genen mit bekannter Funktion

▪︎ probabilistische Methoden (hydrophile und hydrophobe Säuren können die Position des Proteins anzeigen)

▪︎ Methoden des maschinellen Lernens

-> Die beiden letztgenannten Methoden profitieren von einem kontrollierten Vokabular zur Beschreibung von Funktionen (z. B. GO-Begriffe).

Gen-Ontologie

▪︎ gepflegt vom GO-Konsortium, finanziert vom National Human Genome Research Institute (US NIH)

▪︎ soll die gesamte Komplexität der Biologie abdecken (GO-Begriffe, bezogen auf Klassen)

▪︎molekulare Funktion: Prozesse (z. B. Katalyse, Transport)

▪︎zelluläre Komponente: Zellanatomie (z. B. Mitochondrium, Ribosom)

▪︎biologischer Prozess: übergeordnete Prozesse (z. B. DNA-Reparatur, Signaltransduktion)

▪︎ GO-Annotationen: nachvollziehbare, evidenzbasierte Aussagen, die ein bestimmtes Genprodukt mit bestimmten ontologischen Begriffen in Beziehung setzen, um seine normale biologische Rolle zu beschreiben

▪︎ in ständiger Weiterentwicklung

• Jeder GO-Begriff hat einen für Menschen lesbaren Begriffsname und eine GO-ID, z. B.:

  Glukose-Transmembrantransport, GO:1904659

  Beziehungen:

  ▪︎ist-ein (is-a)

  ▪︎Teil von (part of)

  ▪︎hat einen Anteil (has part)

  ▪︎reguliert (regulates)

  ▪︎abgeleitete Beziehungen (inferred relations)

  Eine GO-Anmerkung besteht aus:

• Genprodukt (Protein, RNA, ...)

• GO-Begriff

• Referenz

• Beweise

▪︎ Nutzung der hohen homologen Rekombinationsrate der Hefe

▪︎ Bereiten Sie für jeden ORF eine DNA-Sequenz vor, die Folgendes enthält

▪︎ 2 x 50 bp entsprechend ORF-Start und -Ende

▪︎ einzigartige molekulare Barcodes (20 bp) UPTAG und DOWNTAG

▪︎ KanR-Gen

▪︎ wird verwendet, um eine Zellpopulation zu erstellen, die Knock-out-Stämme für alle ORFs enthält

▪︎ Population unter Standard- und gestörten Bedingungen inkubieren

▪︎ PCR verstärkt molekulare Barcodes und markiert sie mit Cy3 für Standard- und Cy5 für gestörte Bedingungen

▪︎ Hybridisierung mit Microarray, das alle Barcodes enthält

▪︎ Interpretation der Ergebnisse für das entsprechende Gen:

▪︎ Cy3 = 0: essentiell für Wachstum unter Standardbedingungen

▪︎ Cy3 = Cy5: kein Einfluss

▪︎ Cy3 > Cy5: vorteilhaft für Wachstum unter gestörten Bedingungen

▪︎ Cy3 < Cy5: ungünstig unter gestörten Bedingungen

Gene Trapping (zufällige Insertionsmutagenese)

▪︎ Einfügen von Sequenz-Tags und Reportergenen in genomische DNA mithilfe von Vektoren

▪︎ jeder Genfalle fehlt eine wesentliche Transkriptionskomponente:

▪︎ Enhancer Trap erfordert endogenen Enhancer für die Neo-Expression

➡ Das Gen wird stummgeschaltet und seine Transkription wird gemeldet

▪︎ Der Promotorfalle fehlt der Promotor, sie wird durch den Genreporter aktiviert

➡ Das Gen wird stummgeschaltet und seine Transkription wird gemeldet

▪︎ PolyA-Falle erfordert endogenes PolyA-Signal

➡ nützlich zum Abfangen von Genen, die nicht exprimiert werden

Vorteil:

• Ein Zielgen kann präzise ersetzt, gelöscht oder verändert werden

• es entstehen stabile Mutationen

• spezifisch (keine Off-Target-Effekte)

Nachteil:

• geringer Durchsatz

• geringe Effizienz

Vorteil:

• Kann einen hohen Durchsatz haben

• kann verwendet werden, um eine Allelreihe zu erzeugen

• kann die Anwendung auf bestimmte Gewebe oder Entwicklungsstadien beschränken

Nachteil:

• unvorhersehbarer Grad der Gen-Stummschaltung

• Phänotypen nicht stabil

• Off-Target-Effekte sind möglich

Vorteile:

• hoher Durchsatz

• wird für Funktionsverlust- (loss-of-function) und Funktionsgewinn (gain-of-function) Studien verwendet -

• führt zu stabilen Mutationen.

Nachteile:

• Zufällige oder Transposon-vermittelte Insertionen zielen nur auf eine Teilmenge des Genoms ab

• begrenzte Wirksamkeit bei tandemwiederholten Genen -

• begrenzter Nutzen für essentielle Gene

Ähnliche Vor- und Nachteile wie beim Stummschalten von Genen