Globale Analyse der Genexpression
Für die Analyse der mRNA-Transkriptniveaus gab es zwei Ansätze gegründet, welche sind das?
Microarrays (2000)
RNA-seq (2010)
Microarrays
▪︎ Vorauswahl der interessierenden Gene
▪︎ Cy3/Cy5-Markierung von mRNAs aus Probe/Kontrolle
▪︎ Hybridisierung an Microarray mit festen DNA-Sequenzen für ausgewählte Gene
▪︎ Die Sonderfarbe zeigt an, in welchem Zustand das Gen exprimiert wurde
Die Analyse identifiziert unterschiedlich exprimierte Gene
RNA-seq
▪︎ Quantifizierung der (differenziellen) Genexpression
▪︎ Erkennung von Spleißvarianten und SNPs
▪︎ Erkennung neuartiger Transkripte
Ansätze zur Transkriptrekonstruktion
A) De novo Transkriptassemblierung
B) Mapping
Zwei Schritte zur Transkriprekonstruktion
1. Bioinformatik
2. Statistik
RNA-seq: Analyse Schritte
1. Ausrichtung / Zusammensetzung
▪︎ gegen Genome
▪︎ gegen Transkriptome
▪︎ Pseudoalignments
2. Quantifizierung
3. Normalisierung
4. Differentielle Ausdrucksanalyse (Statistik)
Ausrichtung an Genomen
▪︎ Spleißfähige Ausrichtung erforderlich
▪︎ ermöglicht die Erkennung neuartiger Spleißvarianten
Pseudoalignment
1. Erstellen Sie ein De-Bruijn-Diagramm (b) aus dem Referenztranskriptom, das farbige Lesevorgänge (a) enthält.
2. Finden Sie für Schwarz (a) den passenden Pfad im De-Bruijn-Graphen (c).
3. Identifizieren Sie kompatible Transkripte Knoten für Knoten (c).
Microarrays vs. RNA seq.
Microarrays: stellen einen zielgerichteten Ansatz dar: Gene von Interesse müssen vorselektiert werden, neue genetische Varianten sind nicht nachweisbar
RNA seq: Größerer Dynamikbereich: Kann seltene Transkripte und Spleißvarianten identifizieren
Fishers exact test
berechnet die Wahrscheinlichkeit, dass die beobachtete oder eine extremere Verteilung zufällig erhalten wird.
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