Tuuluc

• Phase 0

• Phase 1

• Phase 2

• Phase 3

• Phase 4

  
  

• 10-15 Personen

• Pharmakokinetik, Pharmakodynamik

• Tests mit subtherapeutischen Dosen (Microdosing)

• 20-100 Personen

• erstmalige Anwendung an gesunden Probanden

• Pharmakokinetik, Pharmakodynamik

• 100-500 Personen

• Überprüfung des Therapiekonzeptes

• Bestimmung der geeigneten Therapiedosis -> Dosierung

• 1000 Personen

• Signifikanter Wirksamkeitsnachweis

• Marktzulassung der Therapie

ab 1000 Personen bis Millionen (nach der Zulassung)

• Langzeitstudien

Suche nach einem neuen WS oder Target

• Möglichst nur eine Interaktion mit der Zielstruktur

• keine Interaktion mit menschlicher Dna

• gute Pharmakokinetische Eigenschaften

• HTS: (High-Throughput-screening) Screening tausender Moleküle

• Modifizierung

  • bessere Aktivität, weniger unerwünschte Nebeneffektre

• Potentielle neue Substanzen werden weiter getestet via

  • Laboruntersuchungen (chemische Tests für Reinheit, Stabilität, Haltbarkeit, Prüfung möglicher Dosierungen und Darreichungsformen)

  • Toxikologische Studien (Tierstudien)

    • nur Substanzen, die eindeutige Hinweise auf ihre Sicherheit und mögliche Wirksamkeit vorliegen, werden in späteren Studien an Menschen getestet!

• In vitro Experimente

• In vivo Experimente

angewendet bei:

• Bakterien

• Isolierte Organe/Gewebe

• Zellen (primär oder Zelllinien)

• Zellorganellen (z.B. Mikrosomen)

• Rezeptoren

• Kanäle

• Enzyme

  -> Prüfung auf Genotoxizität

  • Aussagekraft eingeschränkt

  Vorteile:

• Nur geringe Mengen Testmaterial nötig

• Relativ kurze Durchführungszeit

• Möglicher Einsatz von HTS

• Relativ günstig (i. Vgl. zu Tierstudien)

• Ethisch akzeptiert

Nachteil:

• Chronische Effekte können nicht untersucht werden

• Kinetische Aspekte sind ausgeschlossen

• Die Komplexität eines Organismus kann nicht nachgeahmt werden

Ziel:

• 1.Ziel: Übertragung der Ergebnisse auf den Menschen

• Daher entscheidend: Auswahl der richtigen Tierspezies wichtig, da sonst die Ergebnisse nicht auf Menschen Übertragbar sind. (= most human-like animal species)

• systemische Toxizität

• Reproduktionstoxizität

• Genotoxizität (irreparable Schäden?)

• Kanzerogenität

• Spezielle Studien:

  • Lokale Verträglichkeit (bsp. am Auge)

  • Immunotoxizität (wirkt es allergisch?)

• akut: 1 Einzeldosis (Single dose toxicity)

• subakut: 2-4 Wochen

• Subchronisch: 13 Wochen

• Chronisch 6-12 Monate

• Kanzerogenitätsstudien: 2 Jahre (gesamte Lebenszeit der Tiere)

-> Die Dauer toxikologischer Studien ist so lang (oder länger) wie der beabsichtigte klinsiche Einsatz der Substanz!

= No observed adverse effect level

"Keine beobachtete nachteilige Wirkungsschwelle".

• Die Dosis die in den präklinischen, pharmakologischen und toxikologischen Untersuchungen an der empfindlichsten Spezies keine erkennbaren Schäden verursacht hat.

• die Human equivalent dose (HED)

  • Tier NOAEL * (Gewicht Tier/ Gewicht Mensch) hoch (1-b)

  • b = Korrekturfaktor (0,67)

    • Umwandlung von mg/kg in mg/m2

• MRSD (max. reccomended starting dose) = HED/10

  • die Dosis für die erste Studie am Menschen

• wenn WS an Menschen angewendet wird, sind es freiwillige Probanden

• es muss eine Dosis gwählt weren (sehr niedrige Dosis) wo die Probanden möglichst keinem Risiko ausgesetzt werden

= spontan auftretene dauerhafte Veränderung des Erbguts

• Nonsense Mutation: Übersetzung vorzeitig beendet (Stoppcodon)

• Missense Mutation: andere Aminosäure wird eingebaut

• Frameshift Mutation: Verschiebung des Leserasters

Die Tests untersuchen zwei verschiedene Arten:

• Vorwärts Mutation: Veränderung nativer DNA

• Rückwärts Mutation: mutierte Zelle wird zu ursprünglichem Phänotyp zurückgeführt

-> Die aktuellen Tests in Bakterien untersuchen das Potenzial eines Stoffes um Rückmutationen zu induzieren.

• Ames Test (Rückwärtsmutationstest)

• In vitro Metaphase-Chromosom Aberrationstest

• Maus Lymphom TK Assay (Thymidinkinase)

• In-Vitro Mikronukleustest

• In-Vivo Genotoxizitättest

  • in zwei verschiedenen Geweben

    • Mikronuklei in hämatopoetischen Zellen

    • DNA-Strangbruchassay in der Leber

• Schnelltest um die Mutagenität bestimmter Substanzen zu Überprüfen

• Normalerweise können Bakterien mittels verschiedener enzymatischer Reaktionen Histidin (Wildtyp Bakterien) selbst synthetisieren.

• Histidin ist essentiell für die Proteinbiosynthese

• Salmonella typhimurium Bakterien haben eine Frameshift Mutation in Enzym 4 und können keine Histidin selbst produzieren.

• Brauchen Histidin für Wachstum ( von der Umwelt) -> Mangelmutation

Vorteil:

• einfach durchzuführen

• billig

• effizient

1. Bakterien (Mangelmutanten, Salmonella typhimurium) werden auf Nährboden, der kein Histidin enthält ausgestrichen (können sich nicht vermehren, weil kein Histidin).

2. Zugabe eines potentiellen Mutagens (der zu testenden Substanz) und auf Medium Inkubieren.

3. Wenn nach dieser Inkubation neue Bakterienkolonien entstehen, bedeutet dies, dass die Bakterien die Fähigkeit zur Histidinsynthese zurückerlangt haben, was als Rückmutation oder Reversion bezeichnet wird.

4. Rückwärtsmutation/Reversion Substanz deutet darauf hin, dass die getestete Substanz mutagene Eigenschaften besitzt.

• in der Leber höherer Organismen kommt es häufig zu Modifikationen

• dadurch bekommen Substanzen erst mutagene Eigenschaften (Ames Test falsch negativ)

• Substanz in der Leber wird inaktiviert (Ames Test falsch positiv)

Lösung: Zugabe von S9-Extrakt

• = Mix aus Leberenzymen (meist aus Ratten)

• stimuliert die in der Leber stattfiindende Metabolisierung

Nachweis zur Bestimmung möglicher Mutagene in Säugetierzellen, in dem man Mutationen im Thymidin Kinase Gen induziert.

1. L5178 (heterozygote) Maus-Lymphom Zellen bekommen eine chemische Behandlung mit mutagener Zellen mit TK (-/-) oder TK (0/-) Gen in Anwesenheit oder Abwesenheit von S9.

2. bilden nach Selektion durch tödlichen Nukleosidanalogon Trifluorthymidon (TFT) Kollonien oder keine Kollonien (Nekrose)

3. Resistenz gegen zytotoxischen Effekt von TFT- während normale Zellen mit TK ++ oder TK +- (also funktionierender Thymidinkinase = Normalzellen) keine Resistenz besitzen!

-> Anhand der Ergebnisse kann dann die relative Gesamtwachstumsrate (RTG) und die Mutantenfrequenz (MF) berechnet werden.

1. • L5178Y-Zellen sind heterozygot für den TK-Locus. Sie tragen eine defekte Kopie des TK-Gens und eine intakte Kopie.

   • Durch die Exposition dieser Zellen gegenüber potentiell genotoxischen Substanzen können Mutationen im intakten TK-Locus nachgewiesen werden.

1. Zellen (zellkultur (in vitro) oder Erythrozyten aus dem Knockenmark (in vivo) ) im Stadium der Methaphase

2. Zugabe einer hypotonen Lösung, welche die Zellen so stark zum Quellen bringt, dass sie beim Auftropfen auf den Objektträger platzen. Dadurch werden sie so gestreut, so dass sie einzeln beieinander liegen und möglichst nicht überlappen

3. Färbung

= Test zum Aufdecken von Chromosomenaberrationen sowie Schäden des Spindelapparates!

• Mikronuklei sind zusätzliche, vom Zellkern getrennte Kerne, die während der Telophase der Mitose oder Meiose aus Chromosomen-Bruchstücken entstehen.

• während der Reifung der Erythrozytenvorläuferzellen (Erythroblast) wird der Zellkern ausgestoßen aber nicht der Mikrokern (wegen Einwirkung eines Mutagens).

• In Knochenmarkpräpataten kann mann dann nach DNA Färbung recht einfach in diesen kernlosen Zellen nach dem Mikrokern suchen!

  • Knochenmark ist stark vaskuliert und enthält schnell teilende Zellen (schnelle Meiose/Mitose)

• das Verhältnis polychromatischer (unreifer) zu reifen Erythrozyten wird als Maß für die Toxität verwendet.

  -> der Test kann auch mit Zellen aus dem peripheren Blut durchgeführt werden!

  • in Vitro Test mit zellen des Peripheren Blutes (bsp: Lymphozyten (geht auch in-vivo).

• man kann das gleiche Tier von Start bis zum Ende benutzen.

• man kann für den Test auch Zellen aus dem peripheren Blut benutzen!

• Können bei verschiedenen Zelltypen durchgeführt werden, die sich teilen können.

• gewisse Qualitätssicherung gewährleistet durch einheitliche Testvorschrift (OECD)

durch Mutation in Wachstumszellen

• Ionenkanalerkrankung (kanalopathie) mit pathologisch verändertem QT-Intervalll der Herzstromkurve.

• Begünstigt die Torsades de Pointes Tachykardie (Spitzenumkehrtachykardie) = ventrikuläre Tachykardie!

• Ursachen:

  • genetische Mutationen

  • drug induced

• Frauen sind anfälliger für das drug-induced Long QT Syndrom

• Östrogen verlangsamt Kaliumströme und erhöht die Aktionspotenzialdauer und macht Frauen dadurch anfälliger für Long QT-Syndrom

  -> Östrogen kann zu einer Verlängerung des QT-Intervalls beitragen.

• geschlechtsspezifischen Unterschieden in der elektrischen Aktivität des Herzens. (z.B. durch Östrogen)

• Frauen haben ein längeres QTc-Intervall als Männer (bereits im Normalzustand)

• Hormonschwankungen (z.B. Schwangerschaft) da das verlängerte QTc-Intervall als Schutzmechanismus interpretiert werden kann.

Frauen: <450ms

Männer: <430ms

Ionotrope Rezeptoren da Ionenaktivität das Membranpotenzial beeinflussen!

-> Ein ionotroper Rezeptor ist ein Membranrezeptor, der gleichzeitig als Ionenkanal fungiert und durch die Bindung eines Liganden aktiviert wird.

• Konformationsänderung des Ionenkanals, was zur Öffnung einer Pore führt.

• selektiv oder unselektiv Ionen in die Zelle einströmen, was das Membranpotenzial verändert und verschiedene physiologische Prozesse in Gang setzt.

• schnelle Reaktion auf äußere Signale

  
  

  z.B.

• nikotinische Acetylcholinrezeptor

• (GABA) und Glycin sowie Glutamat-bindende AMPA- und NMDA-Rezeptoren

• Bevorzugtes Modell zur Durchführung von sicherheitspharmakologischen Studien am kardiovaskulären System:

  • Hund unter stressfreien physiologischen Bedingungen

• Tiere können in der Laborumgebung trainiert werden, so dass sie unter Verwendung von Lichteinschränkung (z. B. Schlinge oder Stuhl) unter physiologischen Bedingungen untersucht werden könn

• Telemetrische Messungen umfassen:

  • die Herzfrequenz

  • Arteriellen Blutdruck

  • EKG

  • (und, bei einigen Systemen, linksventrikulärer Blutdruck und linksventrikuläres dP/dt).

  
  

• Affe

• Schwein

• Kaninchen

• Frettchen

• Meerschweinchen

-> Ratten und Mäusen ungeignet weil ionischen

Mechanismen der Repolarisation anderst als beim Menschen ist!

• Ionenkanal Studien (Fokus auf hERG-vermittelte, IKr-Strömung)

  • Eine reduzierte ventrikuläre Repolarisation

    führt zu einer Verlängerung des QT-Intervalls

    und erhöhtem Risiko von Arrhythmien

• Gold Standard:

  • Manuelle Patch-Clamp (Oozyten, Zelllinien, Isolierte Myozyten)

• High Throughput

  • automated patch clamping systems

• Myocardial action potential assay systems

  • isolierte ventrikuläre myozyten

  • Purkinje Fasern

  • Papillarmuskeln

• Langendorff-Herzpräparate für monophasische Aktionspotentiale

=Human Ether-a-Go-Go channel (hERG)

• Spannungsgesteuerter Kaliumkanal aus 4 Untereinheiten mit je 6 Transmembrandomänen

• Verantwortlich für schnelleren Kaliumausstrom während des Aktionpotentials im Herzen. -> Repolarisation

• hERG Störung verursacht eine erniedrigte ventrikuläre Repolarisation -> QT- Intervall erhöht

  • Arrythmien Risiko deshalb erhöht!

• Auch AM können Funktionalität der hERG beeinflussen, daher müssen alle neuen Wst. auf ihre Wirkung auf den hERG untersucht werden.

• Prüfung durch elektrophysiologische Methoden wie

  • z.b. patch-clamp assay

= Ex-vivo Experiment zur Analyse der Herzfunktion und der Koronargefäße an einer isolierten Präparation am Herzen.

• ermöglicht die Untersuchung der kontraktilen Stärke des Herzens und der Herzfrequenz ohne die Komplikationen eines intakten Tieres oder Menschen.

• bei dem Experiment wird das Herz aus dem Körper des Tieres oder Menschen entfernt, die Blutgefäße werden durchtrennt, und das Herz wird in umgekehrter Richtung (retrograde Perfusion) über die Aorta perfundiert, normalerweise mit einer nährstoffreichen, sauerstoffhaltigen Lösung.

• Dies ermöglicht die Zugabe von Medikamenten und die Beobachtung ihrer Wirkung auf das Herz, ohne die Komplikationen von In-vivo-Experimenten.

• hat sich über mehr als 100 Jahre bewährt und wird immer noch verwendet!

= Maß für die Sicherheit eines Medikaments

• gibt das Verhältnis der letalen Dosierung eines Medikaments im Verhältnis zur wirksamen Dosierung an.

• Der therapeutische Index wird berechnet aus:

  • LD5: Letaldosis, bei der 5% der Individuen sterben

  • ED95: Einzeldosis, bei der 95% der maximalen Wirkung erreicht werden oder bei 95% der Individuen die gewünschte Wirkung eintritt.

-> je höher,desto sicherer! (hoches Verhältnis!)

= subchronische Toxizität

• umfasst die schädigenden Wirkungen, die bei Versuchstieren als Ergebnis wiederholter täglicher Verabreichung oder Exposition gegenüber einer chemischen Substanz auftreten

• Strahlung, UV Strahlung

• Viren (Eppstein Barr Virus)

• hohe Temperaturen

• chemische Mutagene (polycyclische aromatische KW)

Ziele:

• Identifizierung möglicher toxikologischer Effekte (Was kann passieren?)

• Übertragung der nicht-klinischen Daten aus Tierstudien auf den Menschen (Was kann beim Einsatz im Menschen passieren?)

• Hilfestellung beim Umgang mit möglichen Risiken (Wie kann das Risiko minimiert werden?)

Anforderungen:

• Identifizierung von Organen mit Gefährdungspotential für toxikologischer Schäden

• Identifizierung klinischer Parameter für ein mögliches Monitoring

• Identifizierung gefährdeter Populationen

• Untersuchung des toxischen Wirkmechanismus

Arzneimittelsicherheit:

• akute Effekte auf die Funktion vitaler Organsysteme

• Vor Beginn der Phase-1 Studien

Toxikologie:

• chronischer Effekt auf die Struktur vitaler Organe (histopathologisch)

• Vor und während der klinischen Entwicklung

• ZNS: motor. Aktivität, Verhaltensänderungen, Koordination, Körpertemperatur

• Kardiovaskuläres System: Blutdruck, HF, EKG

• Respirationssystem: Atemfrequenz, O2-Sättigung

• Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf das pharmakokinetische Profil einschließlich Biotransformation

• Exposition gegenüber dem (den) Hauptmetaboliten des Menschen sollte gewährleistet sein

• Wenn dies in Toxizitätsstudien mit der Ausgangsverbindung nicht erreicht werden kann, sollten spezifische Studien mit dem (den) Metaboliten erwogen werden.

-> zwei Arten von Säugetieren

• Von denen eines ein Nicht-Nagetier sein muss (Hausschwein oder Minischwein, Hund)

-> gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Tieren

• eine niedrige Dosis (low dose)

  • ausreichende pharmakodynamische Wirkung

  • den gewünschten therapeutischen Effekt erzielt

  • zu einer systemischen Exposition führt, die mit der beabsichtigten klinischen Verwendung vergleichbar ist.

• eine hohe Dosis (high dose)

  • die so ausgewählt wurde, dass die Zielorgan-Toxizität oder eine andere unspezifische Toxizität oder bis auf das Volumen der Dosis begrenzt werden kann.

  • Grenzdosierungen für akute, subchronische und chronische Toxizitätsstudien von 1000 mg/kg/Tag für Nagetiere und Nichtnager werden als angemessen erachtet

• eine mittlere Dosis (intermediate dose)

  • geometrische Mittel zwischen der hohen und der niedrigen Dosis ist.

1. Bestimmung der NOAEL des Tieres (mg/kg)

2. Umrechnung des NOAEL zu HED (= human equivalent dose)

3. Wahl des HED aus dem am besten übertragbaren Tiermodell

4. Auswahl des Sicherheitsfaktors (SF) und Berechnung:

   1. HED * SF = MRSD

5. Überlegung ob MRSD verkleinert werden sollte (z.B. klinische Studien an Kindern)

6. Ziel: MRSD

• Intakte Tiermodelle erlauben die Untersuchung potentieller neuronaler und hormoneller Einflüsse auf den pharmakodynamischen Effekt.

• Zusätzliche Sicherheitsparameter, einschließlich Blutdruck, Herzfrequenz, PR-Intervall, QRS-Dauer und Arrhythmien, können gleichzeitig beurteilt werden.

• normalerweise Vorwärtsmutationen

• Beinhaltet Basenpaar-Substitution und Frameshift-Mutationen.

• Messungen von Genmutationen in Säugetierzellen sind aufgrund der größeren Komplexität von Säugerzellen und Chromosomen im Vergleich zu denen von Prokaryoten erforderlich.

• Sie sagen das Potenzial für Gentoxizität beim Menschen besser voraus.

• Im Gegensatz zu Bakterien sind Säugetierzellen im Wesentlichen diploid (2n, mit zwei Kopien jedes Chromosoms).

• Säugetierchromosomen enthalten sowohl nichtcodierende als auch codierende Sequenzen.

• Zwei Kopien jedes Gens (eines auf jedem Chromosom)

• Eine (dominante) Form des Gens kann exprimiert werden, während das andere (rezessive) Gen nicht exprimiert wird.

• Homozygot= beide Kopien des Gens sind gleich (+/+, -/-)

• Heterozygot= die Kopien sind unterschiedlich. Eine mutierte und eine normale (+/-)

• Hemizygot= nur ein Chromosom ist vorhanden.

  • Hemizygote Merkmale sind auf dem X-Chromosom bei Säugetieren gefunden, weil Männer nur ein X-Chromosom (XY) haben.