BC 11. Proteinbiosynthese

• 5’ Capping: Stabilität,Schutz vor Endonukleasen, Phosphatasen

• Splicing/Alternatives Splicing: Spleißosome Enzymmachinerie

• Polyadenylierung + Export, Nur korrekt prozessierte mRNAs werden exportiert (markiert durch cap binding complec CBC, exon junction complexes EJC, poly-A-binding proteins

Proteinbiosynthese: Übersetzung der Infos der Nukleotidsequenz der mRNA in AS-sequenz der Proteine

• 3 Nucleotide = 1 Codon -> 1 AS

• 3 mögliche Leseraster

Für jedes Triplet eigene tRNA

tRNAs (transfer) - Informationsvermittler zw. Nukleotid- & AS-Sequenz

• Anticodon Region erkennt Codon Region der mRNA über Basenpaarung

• 3. Basenpaarung (Wobble Position) toleriert Fehlpaarungen -> 31 tRNAs in Bakterien für 61 Codons

• Aminoacyl-tRNA-Synthetasen koppeln AS an die tRNA, Meist 1 Pro AS

• AS werden an den 3’ Terminus der tRNA gekoppelt (Bei einigen Kopplung an 2’ OH Gruppe gefolgt von Umesterung

• Synthesemaschinerie für Proteine: basierend auf Infos der mRNA Sequenz werden AS zum Protein polymerisiert

• von N-Terminus zu C-Terminus, Neue AS an C-terminus der wachsenden Proteinkette gekoppelt

-> Proteinsynthesemachinerie, Ribozym

Aufbau Ribosom: Riboproteinkomplex > 50 Proteine, 3-4 rRNAs, prokaryotic 70S = 50S + 30S, eukaryotic 80S = 60S + 40S

• rRNAS übernehmen Positionierung der mRNA, der tRNA & die Knüpfung der Proteinkette

• ribosomale Proteine stabilisieren rRNA & ermöglichen für Proteinbiosynthese notwendige Strukturveränderungen

-> Kleine UE: Interaktion mit mRNA

-> Große UE: Katalyse Peptidbindung zw. AS

-> 3 Bindestellen: A (Aminoacyl), P (Peptidyl), E (Exit) Stellen

- 1. AS: Met beladen auf Initiator tRNA (Met-tRNAi)

- Met-tRNAi bindet zsm mit Initiationsfaktor eIF2 an kleine RibosomenUE

- Komplex erkennt mRNA via 5’ Cap sowie gebundenen Initiationsfaktoren eIF4E und eIF4G (interaktion mit polyA)

- Über weitere Initiationsfaktoren (unter ATP-Verbrauch) wird mRNA gescannt, bis erstes AUG-Codon erreicht ist

- Hydrolyse von GTP -> Dissoziation der Initiationsfaktoren & große RibosomenUE bindet

EF-Tu (EF1 Euk.) & EF-G (EF2 Euk.) erhöhen die Genauigkeit & Geschwindigkeit der Proteinbiosynthese

• EF-Tu eskortiert AS-tRNA zum Ribosom - bei korrekter Codon-Anticodon Paarung erfolgt Hydrolyse von GTP & Dissoziation von EF-Tu

• Inkorrekte tRNAS dissoziieren, korrekte werden weiter prozessiert

• EF-G vermittelt über GTP-Hydrolyse die Translokation des Ribosoms -> Vorwärtsbewegung der Translation

-> Wenn sich die Umgebung des Startcodons stark von der Konsensussequenz 5 ACC AUG G 3 ‘‘(Kozak Sequenz) unterscheidet wird AUG überlesen -> Translation beginnt beim 2. /3. AUG (sog. „ leaky scanning”)

-> basierend auf einer mRNA mehrere Proteinvarianten z.B. mit unterschiedlichen Signalsequenzen zum Transport in verschiedene Kompartimente der Zelle

• Stop Codons: UAA, UAG, UGA werden in A-Stelle von release Faktor erkannt

  -> Hydrolyse AS von tRNA in P-Stelle

  -> Fertiges Protein freigesetzt

• paralleles Ablesen der mRNA -> Simultane Translation derselben mRNA durch eine Reihe von Ribosomen -> Höhere Ausbeute

• alle 80 Basen kann Ribosom Zielprotein synthetisieren

Selenocystein:

21. proteinogene AS, Aus Serin gebildet an Selenocystein tRNA, Anticodon: ACU entspricht Stop-Codon UGA

SECIS Element in 3’ der untranslatierten Region bindet Selenocystein-spezifischen Translationsfaktor -> Rekrutierung Se-Cystein-beladene tRNA, Ohne SECIS -> Translationsstop

Translational Frameshifting:

Ermöglicht Synthese mehrerer Proteine von einer mRNA

Bspw: HIV-Virus - Capsid Protein Gag & Reverse Transkriptase Pol von gleicher mRNA codiert, 10 % der Fälle -> -1 Frameshift im Gag-Gen -> anschließende Stop-Codon überlesen -> Translation Pol-Gens

Frameshift durch Pseudoknotenstruktur induziert

Nonsense-mediated mRNA decay: Inkorrekt gesplicte mRNAs enthalten Introns -> verfrühte Translationstermination, trunkierte Proteine toxisch. Erreicht Ribosom verfrühtes Stop-Codon gefolgt von einem Exon Junction Complex (resultierend aus dem Splice Prozess) binden Upf Proteine -> nachfolgender Abbau der fehlerhaften mRNA

Abbau trunkierter Proteine: unvollständige mRNAs -> Ribosom verharrt am 3’ Ende, vakante A Stelle von Alanin beladenen tmRNA besetzt -> 10 weiter. An trunkiertes Protein wird Sequenzmotiv aus 11 AS fusioniert -> von Proteasen erkannt -> schneller Abbau fehlerhaftes Protein

• Via Proteasom: ATP-getriebene Protease,

• 2 19S Cap Komplexe: erkennen zum Abbau markierter Proteine via hydrophobe oder entfaltete Sequenzbereiche oder Polyubiquitin Ketten, ATP-getriebner Prozess der Proteinentfaltung

• 1 20S Core Komplex (Protease-Aktivität, zerlegt Proteine in Peptide

BSE-Bovine Spongioform Encephalopathy

Durch Interaktion mit einem fehlgefalteten Prion können lösliche Prione die (unlösliche) Fehlfaltung einnehmen

Verzehr von fehlgefalteten Prionen kann zur Übertragung der Krankheit führen

Fehlgefaltete Proteine können aggregieren & Krankheiten auslösen: Aggregation in Cross beta Filamenten sind proteaseresistent und können im Gewebe akkumulieren (z.B. Amyloid Strukturen in Alzheimer / Huntington)

• schon geringe Fehler in Kopplung der richtigen AS -> hohe Quote fehlerhafter Proteine

• Mehrstufige Qualitätskontrollmechanismen (Fehlerquote bei Beladung 1:40.000

• mehrfache Interaktionspunkte zw. tRNA & Aminoacyl-tRNA-Synthetase: Via Anticodon, via Sequenz nahe der Aminosäurekopplung -> Doppelter Kontrollmechanismus

• Selektion auf korrekte Strukturen der ZielAS:

• Gegenselektion gegen inkorrekte Strukturen: inkorrekte AS hydrolysiert & abgespalten

-> 4 Stufen Prozess

1) tRNA-AS geht Codon-Anticodon Paarung in der A-Stelle ein

2) Peptidyl-transferase katlysierte Übertragung der Proteinkette auf die AS der tRNA in A-Stelle

3) Verschieben der großen Untereinheit

4) Verschieben der kleinen Untereinheit

Prokaryoten: Bindung mRNA an Ribosom via Shine-Dalgarno Sequenz (oberhalb Start-Codon, komplementär zu 16S rRNA Motiv) -> Ribosom kann an interne Startcodons binden & Translation initiieren -> Polycistronics mRNA

1. AS = N-formylmethionin

Eukaryoten:

Chaperone vermitteln die Faltung von komplexeren Proteinen (Einfache Proteine falten spontan co-translational& nehmen die korrekte Sekundär und Tertiärstruktur ein )

Chaperon Familie HSP70: heat shock Proteine - stark bei erhöhten Temperaturen exprimiert -> entgegenwirken des Denaturierungsprozesses, Erkennen & binden falsch gefaltete Proteine über ausgedehnte kurze, hydrophobe Bereiche -> Ermöglichen korrekte Faltung des Proteins

Chaperon Familie HSP60:

binden falsch gefaltete Proteine via hydrophobe Interaktionen

Unter ATP-Verbrauch & Bindung von GroES-cap verändert sich die Konformation von HSP60 -> Eingeschlossene Proteine werden partiell entfaltet & können sich danach neu falten

Ubiquitinylierung - Kann über Carboxy Terminus an Lysine des Zielproteins gekoppelt werden, Polyubiquitinylierung Lys63 signalisiert DNA Reparatur, an Lys48 - Degradation des Zielproteins

-Ubiquitin activating enzyme (E1), aktiviert Ubiquitin via Thioesterbindung

-Ubiquitin conjugating enzyme (E2), überträgt Ubiquitin auf Zielprotein im Komplex mit E3 (sog. Ubiquitin Ligase Komplex).

-E3 erkennt die zu ubiquitinylierenden Proteine

-E2 existiert in ca. 30 Varianten, E3 in mehreren hundert Varianten